細胞代謝研究のためのマルチモーダル光学イメージングプラットフォーム

私たちの研究では、マルチモーダル顕微鏡を活用して、いくつかの病態における分子的および代謝的な違いを測定し、それらの空間的不均一性を視覚化します。光学イメージングへのマルチモーダルアプローチにより、さまざまな視点から病態生理学的変化を特定することができます。光学顕微鏡へのマルチモーダルアプローチは、特に臨床現場でその用途を継続的に拡大しており、マイクロ内視鏡の開発により臨床イメージングの道が開かれました。

現在の実験上の課題は、すべてのハードウェアを相互に組み込むことの複雑さにあり、それがカスタムメイドの顕微鏡システムを利用する理由の一部です。当社のマルチモーダル光学イメージングプラットフォームの使用により、さまざまな乳がんサブタイプの分類やショウジョウバエとマウスの脳における脂質代謝の解析など、ラベルフリーの生体直交疾患研究において大きな進歩を遂げました。ラベルフリーのマルチモーダル光学イメージングにより、代謝、形態、分子組成を同時に可視化することができ、疾患や老化プロセスの調査に強力なツールとなります。

まず、レーザーをウォームアップし、約15〜20分待ちます。コントロールボックスの電源を入れ、続いてタッチパネルコントローラー、メインレーザーリモコン用のACアダプター、サブレーザーリモコン用のACアダプターの電源を入れてから、シリコンフォトダイオード検出器とロックインアンプの電源を入れます。780ナノメートルから990ナノメートルまで調整可能なポンプビーム、パルス幅5〜6ピコ秒、80メガヘルツの繰り返し周波数でレーザーシステムを設定します。

ストークスレーザービームは、1031ナノメートルの固定波長を持ち、6ピコ秒のパルスと80メガヘルツの繰り返し周波数を持つ必要があります。ポンプビームとストークスビームの両方が低電力で、アライメントプレートに見えるように少なくとも20ミリワットであることを確認してください。高開口オイルコンデンサーにオイルを塗布します。

顕微鏡スライドをオイルコンデンサーに取り付け、顕微鏡スライドに大きな水滴を置き、25X水対物レンズを取り付けます。Zステージを調整して、生物学的サンプルの明るい明視野画像が25倍水対物レンズの下に表示されるまで焦点を調整します。光退色を避けるために、正しい順序でイメージングプロセスを開始します。

MPF と SHG をすばやく切り替えるには、ポンプ ビームから固定ストークス ビームに切り替えます。画像の解像度を 512 x 512 ピクセルとして選択します。MPF と SHG の滞留時間をピクセルあたり 8 マイクロ秒に設定し、平均フレームを 3 以上にします。

SRS モダリティでは、ピクセルあたり 40 マイクロ秒を使用し、平均フレームは 2 です。MPFで自家蛍光を取得するには、ストークスレーザービームをオフにします。ポンプレーザーを800ナノメートルに調整して、NADHとフラビンを励起します。

SHGを用いてコラーゲン繊維のシグナルを取得します。ポンプレーザービームをオフにし、500ミリワットの出力でのみストークスレーザービームを使用してください。SRSを用いてタンパク質や脂質の空間分布を取得します。

両方のレーザービームをオンのままにし、各分子の特定の振動モードに一致するようにレーザービームの周波数を調整します。SRSハイパースペクトル画像データセットを集録するには、スイートモードを選択し、波長範囲を781.3ナノメートルから806.5ナノメートルに設定します。少なくとも 60 のスタック番号を選択し、ハイパースペクトル イメージ スタックをキャプチャします。

同じ関心領域のすべての画像を同じフォルダーに保存し、画像形式がOlympus OIRファイルであることを確認します。自家蛍光およびSRSイメージングは、ヒト肺組織から代謝情報および構造情報をうまく取得しました。光学酸化還元比と脂質不飽和比のレシオメトリック分析により、ヒト肺組織における代謝活性と分子組成の空間分布が得られました。

健康な組織と腫瘍組織との間の酸化ストレスと脂質不飽和の定量的比較は、代謝状態の違いを明らかにします。