パラフィン包埋と顕微解析の微生物コロニー バイオ フィルムの薄い断面

この手順の全体的な目標は、無傷のネイティブ形態内での蛍光タンパク質産生によって報告される遺伝子発現の分布を評価するために使用できるパラフィン包埋バイオフィルム切片を生成することです。この方法は、エクソポリマー物質の生産における特定の遺伝子の発現がネイティブバイオフィルムアーキテクチャのコンテキストでどのように分布するかなど、微生物群集の研究における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、バイオフィルム断面の保存された形態内での遺伝子発現の解析を可能にすると同時に、明確な特徴の染色や共焦点顕微鏡や電子顕微鏡などの高解像度イメージングなどの下流処理にも適

テキストプロトコルに従って寒天トリプトン溶液を調製した後、50ミリリットルの円錐管を使用して、100ミリメートル×100ミリメートルの正方形の皿に45ミリリットルの溶液を注ぎます。寒天が約20〜30分間固まるのを待ちます。最初の層の上に2番目の15mmの層を注ぎ、一晩固化させ、必要に応じて、糸くずの出ないティッシュを使用して蓋の結露を取り除きます。

次に、コロニーバイオフィルムを見つけるために、テキストプロトコルに従って凍結ストックから単離された単一のP.Aeruginosaコロニーを成長させた後、細胞懸濁液の2.5〜10マイクロリットルを培地二重層プレート上にピペットで移動します。コロニーは、摂氏25度の暗闇、相対湿度80〜100%で最大4日間インキュベートできます。15ミリリットルの寒天溶液を増殖培地とコロニーに静かに注ぎ、寒天を室温で5分間ゲル形成させます。

次に、鋭利なカミソリの刃を使用して、上部の2つの層の間にコロニーをラミネートした正方形の3層チャックをカットします。複数のサンプルを調製する場合は、各チャックが同等のサイズにカットされていることを確認してください。チャックを含むコロニーから余分な寒天をそっと取り除きます。

次に、へらの平らな頭をPBSまたは水で濡らし、寒天の上層と下層の間にそっと挿入します。ラミネートされたコロニーを、耐薬品性のマーキングペンでラベル付けされた包埋カセットに直ちに移します。埋入カセットを、事前に準備した固定剤が入ったスライドガラスメーラーに入れます。

サンプルを処理します。1X PBSを使用して、それぞれ1時間ずつ2回洗います。最良の結果を得るには、自動ティッシュプロセッサーのスピン機能の低設定を使用して試薬の均質化を自動化します。

サンプルを埋め込むには、55°Cに加熱した溶融パラフィンワックスをワックス型に充填し、加熱した平らなヘラを使用して、浸潤したチャックを埋め込みカセットからワックス型にすばやく移し、チャックが金型のベースと平行になるようにします。ワックスが摂氏4度で一晩固まるのを待ちます。固体ワックスで成形されたサンプルは、この温度で無期限に保存できます。

ワックスが固まったら、サンプルを型から取り出し、かみそりの刃を使用してサンプルの周りから余分なワックスを切り取ります。サンプルの一方の端から伸びるワックスを残して、ミクロトームに固定するために使用できます。ワックスに埋め込まれたサンプルは、その形状が滑らかな直線状のリボンの収集を容易にするようにトリミングすることが重要です。

トリミングの小さな欠陥は、リボンにアーティファクトを生成し、セクションの完全性を損なう可能性があります。次に、ウォーターバスを摂氏42度に加熱します。次に、コロニーの表面をブレードの端に垂直に向けるように、サンプルをミクロトームにクランプします。

コロニーの所望の平面に達するまで、サンプルを50マイクロメートル間隔でトリミングし、そこから切片を採取するミクロトームを75〜80 RPMの切片化速度と6〜10度のクリアランス角度に設定して行います。厚さ10マイクロメートルのセクションを必要な数のリボンにカットします。次に、先端の細いペイントブラシを使用して、リボンをブレードから取り外します。

次に、パスツールピペットの先端に鉗子または水滴をさらして、リボンを水浴にそっと移します。すぐにスライドをウォーターバスに挿入し、リボンの下に45度の角度で配置します。リボンの狭い方の端を、つや消しラベルのすぐ下のスライドに接触させます。

リボンが接着している必要があります。スライドをウォーターバスから引き出し、角度を調整して水面に対して垂直になるようにし、リボンがその長さに沿ってスライドに対して平らになるようにします。リボンの下に余分な水が溜まらないようにしてください。

スライドを糸くずの出ない吸収性のあるティッシュにそっと立て、切片から余分な水分を逃がします。次に、スライドをペーパータオルの上に置き、室温で一晩暗闇で乾かします。水平にしたホットプレートを摂氏45度に加熱し、スライドをプレートに30〜60分間置きます。

ワックスは半溶融し、スライドに対して平らになります。スライドをホットプレートからそっと持ち上げ、ワックスが固まるまで約1分間、滑らかな水平な室温の表面に平らに置きます。溶融ワックスがスライドの両側に引っ張られないことを確認してください。

スライドガラスメーラーにサンプルを入れた状態で、清澄剤を4回洗浄し、それぞれ5分間スライドにワックスを落とします。Buchnerアスピレーターを使用して、洗浄の合間に溶液を除去します。100%エタノールを使用して、スライドを3回、それぞれ1分間洗浄します。

次に、テキストプロトコルに従ってスライドを再水和した後、すぐに切片をトリスバッファー封入剤にマウントし、カバースリップを塗布します。切片の周りのオーバーレイ寒天は固定剤と反応しないため、フダンソウスライドに付着しません。この寒天は、再水和中に剥がれ落ちて切片を損傷する可能性があるため、再水和中に溶液を攪拌しないように注意する必要があります。

封入剤を室温で一晩重合させます。重合したら、透明なマニキュアを使用してカバーガラスをスライドに密封します。最後に、密封されたスライドは、摂氏4度の暗闇で無期限に保管します。

40倍油浸対物レンズを使用したDICイメージングは、バイオフィルムの薄切片の形態学的特徴を示すのに十分ですが、蛍光タンパク質を恒常的に発現するように設計された株の蛍光顕微鏡法は、サンプル内の細胞分布の視覚化を強化します。これらのパネルに示されているように、個々のセクションの画像をつなぎ合わせてコロニー全体の断面を生成することができ、巨視的なレベルでの全体的な形態内の構造的特徴の局在化のコンテキストを提供します。特定のプロモーターの制御下で蛍光タンパク質を発現するように改変された株を用いることで、遺伝子発現の分布を可視化することができます。

さらに、コロニーは色素を含む培地で成長させることができ、または染色剤の特定の多糖類にポストセクショニングで色素を添加することができます。最後に、ここに示すように、透過型電子顕微鏡を使用してサンプルを調製し、より高い分解能でイメージングすることもできます。この手順を試みる際には、サンプルの不安定性に注意し、固定、切片化、または再水和によって蛍光アーチファクトや構造アーチファクトが生じる可能性に注意することが重要です。これは、データの解釈に影響を与える可能性があります。

この手順により、蛍光レポーターの発現プロファイルを形態学的特徴やバイオフィルムのZ軸と相関させるなど、定量的な画像解析が可能になります。このプロトコルは、緑膿菌、コレラ菌、枯草菌など、医学的および産業的に重要なバイオフィルム形成微生物の多様な種に適用できます。このビデオを見れば、パラフィン包埋による切片化のためのコロニーバイオフィルムの育成方法と調製方法について十分に理解できるはずです。