否定的な変奏曲染色電子顕微鏡検査方法: システムに挑戦に取り組むためのツール

このビデオの全体的な目標は、ネガティブ染色透過型電子顕微鏡サンプルを調製するためのいくつかの異なるバリエーションを示すことです。ネガティブ染色は、EMサンプルの品質を迅速に評価するための最良の方法です。サンプルによっては、さまざまなグリッド調製手法がより効果的であることを認識することが重要です。

特定のサンプルに最適な手法は、試行錯誤によって決定する必要があります。まず、カーボンシート法を使用してEMグリッドを調製し、付属のテキストプロトコルに記載されているようにネガティブ染色試薬を調製します。カーボンシートでコーティングされたEMグリッドを上向きにして顕微鏡のスライドに置きます。

スライドをグロー放電ユニットにセットし、グリッドを30ミリアンペアで最低10秒間処理して、グリッドを親水性にします。終了したら、サンプルを排出ユニットから取り出します。次に、負圧ピンセットを使用してグリッドの端をつかみます。

サイドブロット法で染色するには、まず3〜5マイクロリットルのサンプルを支持面に塗布します。サンプルをグリッド表面に吸着させてから、グリッドの端を濾紙のシートに触れ、毛細管現象が液体を引き抜くようにします。次に、50マイクロリットル滴の超純水または適切な揮発性緩衝液を実験用フィルムのシートに置きます。

グリッドのカーボン表面を水滴にそっと触れ、グリッドの表面に小さな水滴を持ち上げます。次に、グリッドの端を濾紙のシートに触れ、毛細管現象が液体を引き抜くのを待ちます。次に、50マイクロリットルの染色試薬を2滴、ラボ用フィルムの上に置きます。

グリッドのカーボン表面を液滴にそっと触れ、小さな液滴をグリッドの上面に持ち上げます。汚れがグリッドの背面に移動する場合は、カーボンフィルムが壊れているため、廃棄する必要があります。10〜15秒後、グリッドの端を濾紙に触れ、毛細管現象によって液体を引き抜きます。

この染色ステップをもう一度繰り返してから、グリッドを風乾させます。フリック法でサンプルを染色するには、負圧ピンセットでグリッドの端をつかみ、3〜5マイクロリットルのサンプルを支持面に塗布します。ピンセットを片手で持ち、グリッドが約45度反対側を向くように角度を付け、手首をすばやくフリックしてグリッドの上部にある液滴の大部分をはじきます。

次に、ガラス製のパスツールピペットを使用して、支持体の表面に洗浄液を一滴垂らします。ドロップをはじき、数回繰り返してサンプルを洗浄します。次に、支持体表面に染色試薬を一滴垂らし、再度液滴をはじき飛ばします。

この染色ステップを1〜3回繰り返しますが、これは試料の可視化に必要な染色の深さによって異なります。濾紙の破れた端をグリッドの端に触れて余分な汚れを取り除き、グリッドを風乾させます。急速フラッシング法でサンプルを染色するには、まず200マイクロリットルのピペットの先端に30〜70マイクロリットルの汚れを吸い込みます。

ボリュームダイヤルを回して5マイクロリットルの空気を吸い上げ、次に5〜30マイクロリットルの洗浄試薬を吸い上げ、続いて別の小さなエアギャップを吸い上げ、さらに5マイクロリットルのサンプルを吸い込みます。一対の負圧ピンセットでグリッドの端をつかみ、グリッドを約45度反対側に向けて角度を付けます。1回の素早い動きで、ピペットチップの内容物全体をカーボンコーティングされたEMグリッドの表面に排出します。

濾紙の破れた端をグリッドの端に触れて余分な汚れを取り除き、グリッドを風乾させます。ネガティブ染色の理想的な選択は、サンプルに大きく依存します。最も一般的に使用される汚れは酢酸ウラニルですが、ランタニドの汚れも使用できます。

深く埋め込まれたサンプルの場合、ランタニドベースの染色剤である酢酸ツリウムと酢酸エルビウムは、染色された粒子の明らかなコントラストとシャープネスから判断されるように、酢酸ウラニルと同等の品質の陰性染色を引き起こし、酢酸ツリウムは酢酸エルビウムよりも鮮明で鮮明な画像を生成しました。酢酸ツリウムの大きな粒径は、高倍率で明らかになります。これは、タバコモザイク繊維粒子のサンプルを1%酢酸ツリウムで染色したときに示されています。酢酸ツリウムを使用すると、タバコモザイク繊維粒子の23オングストロームリピートが目ではっきりと見えます。

試験した他のランタノイド染色では、この特徴を解決できませんでした。画像化が難しい別のサンプルは、筋肉由来のCタンパク質です。このサンプルは、染色方法によって大きく異なる画像を生成します。

サイドブロット法で染色すると、球状のつぶれた翼のような構造として現れます。フリック法でグリッドを作製すると、Cタンパク質はストリング上のビーズに似た一連のドメインとして観察されます。これは、実際のCタンパク質の構造をよりよく表しています。

一度習得すれば、ネガティブ染色されたサンプルを調製するのに約1分しかかかりません。各サンプルは、各染色技術に対して異なる反応を示すことを覚えておくことが重要です。新しいサンプルの場合、最適なアプローチを実験的に決定する必要があります。

ウラニル染色試薬は毒性があり、わずかに放射性であることを忘れないでください。それらが適切な廃棄物の流れに廃棄されていることを確認してください。