蛍光標識した CXC ケモカイン Ligand 12 CXC ケモカイン受容体 4 を混乱させる化合物を識別するためにフロー フローサイトメトリーを用いた測定

フローサイトメトリーを用いた細胞結合の試金を記述、CXC ケモカイン受容体 4 (CXCR4) に蛍光に分類された CXC ケモカイン リガンド 12 (cxcl 12) の結合を阻害する化合物を同定するスクリーニング用具として主に使用される種類の流れ。

セルベースアッセイの全体的な目標は、Gタンパク質共役型受容体に結合する分子を同定することです。蛍光標識されたリガンドと競合して受容体に結合する能力に基づいています。競合結合アッセイは、Gタンパク質共役受容体創薬をサポートします。

このプロトコルで示すように、ケモカイン受容体、CXC4。この方法の主な利点は、記憶の準備の代わりに生細胞を使用して受容的結合を解析できることです。また、放射能標識プローブの使用が避けられること。

この方法は当初、ケモカイン受容体CXCR4への結合を研究するために設定されましたが、蛍光標識リガンドが存在する他のGPCRに対しても開発できます。まず、100マイクロリットルの化合物溶液を、事前に定義された実験レイアウトに従って、透明な96のよく丸みを帯びた底板に分注します。試薬リザーバーから50マイクロリットルの細胞懸濁液をマルチチャンネルピペットを使用して96ウェルプレートに加えます。

プレートを室温で15分間暗所でインキュベートします。インキュベーション後、蛍光標識された100ナノグラム/ミリリットルのCXCL12を、同様の試薬リザーバーから50マイクロリットルを96ウェルプレートのウェルに加えます。暗所で室温で30分間インキュベートします。

次に、96ウェルプレートを室温で400倍の重力で5分間遠心分離します。プレートを裏返して、ペレット化された細胞から上清を取り除きます。プレートをティッシュで乾かします。

試薬リザーバーから200マイクロリットルの新鮮なSAバッファーをマルチチャンネルピペットを使用してウェルに加えます。直ちにプレートを再び遠心分離し、室温で重力400倍で5分間遠心分離します。プレートを裏返し、ティッシュで乾燥させて、再び上清を取り除きます。

最後に、PBSに溶解した200マイクロリットルの1%パラホルムアルデヒドに細胞ペレットを穏やかに再懸濁します。この手順では、セルを修正します。フローサイトメトリーでサンプルを解析するには、デバイスを起動し、対応するソフトウェアを開きます。

ドットブロック形式で視覚化するセルラーパラメータを、前方散乱領域、側方散乱領域、ヒストグラムビューでフルオロ4検出チャネルとして選択します。サンプルを 1 つ選択します。例えば、ネガティブコントロールサンプルは、前方散乱および側方散乱パラメータに基づいて定義された均質な細胞集団のゲーティングを実行する。

細胞をフローサイトメトリーデバイスにロードするための設定を適応させます。注入前に3つのミックスを選択します。100マイクロリットルの固定細胞の自動注入を選択し、毎秒1.5マイクロリットルのサンプル流量を使用します。

[データの取得] を選択してサンプルを実行します。このサンプルの前方散乱光と側方散乱光のパラメータ、およびフルオロ4の検出が画面に表示されます。次に、ソフトウェアゲーティングツールを選択します。

前方散乱光と側方散乱光ドットプロットの可視化に基づいて、ゲーティングによって均質で生存可能な細胞集団を事前に定義します。サンプルあたり 20 、 000 のイベントを分析する場合に選択します。これは、各サンプルについて、事前定義されたゲート内にある20,000個の細胞が最終的に分析されることを意味します。

データ取得は、このイベント数に達するまで続行されます。最初に、分析するウェルを選択して実行を開始します。次に、ランウェルを選択します。

フローサイトメトリーデバイスは、各サンプルの平均蛍光強度を記録することにより、これらのサンプルを1つずつ分析します。これは、事前定義されたゲート内にある20, 000個の細胞からの平均蛍光シグナルに対応します。最後に、プロトコルに記載されているようにデータ分析を実行します。

高濃度のAMD3100、未確立および特異的なCXCR4アンタゴニストを含むジャーカット細胞のプレインキュベーション後。標識されたCXCL12の結合を反映する平均蛍光強度は、ほぼ完全にバックグラウンドレベルまで低下します。これは、jurkat細胞上に発現するCXCR4へのCXCL12の高度に特異的な結合を示しています。

CCR5アンタゴニストのマラビロックのように、CXCR4受容体での結合について標識CXCL12と競合できない化合物は、平均蛍光強度に影響を与えません。対照的に、高活性化合物は用量依存的にこれを行います。ビデオを見た後、生細胞とフローサイトメトリーを使用した競合的受容結合アッセイの実施方法を十分に理解しているはずです。