蛍光標識した CXC ケモカイン Ligand 12 CXC ケモカイン受容体 4 を混乱させる化合物を識別するためにフロー フローサイトメトリーを用いた測定
2018年3月10日
フローサイトメトリーを用いた細胞結合の試金を記述、CXC ケモカイン受容体 4 (CXCR4) に蛍光に分類された CXC ケモカイン リガンド 12 (cxcl 12) の結合を阻害する化合物を同定するスクリーニング用具として主に使用される種類の流れ。
セルベースアッセイの全体的な目標は、Gタンパク質共役型受容体に結合する分子を同定することです。蛍光標識されたリガンドと競合して受容体に結合する能力に基づいています。競合結合アッセイは、Gタンパク質共役受容体創薬をサポートします。
このプロトコルで示すように、ケモカイン受容体、CXC4。この方法の主な利点は、記憶の準備の代わりに生細胞を使用して受容的結合を解析できることです。また、放射能標識プローブの使用が避けられること。
この方法は当初、ケモカイン受容体CXCR4への結合を研究するために設定されましたが、蛍光標識リガンドが存在する他のGPCRに対しても開発できます。まず、100マイクロリットルの化合物溶液を、事前に定義された実験レイアウトに従って、透明な96のよく丸みを帯びた底板に分注します。試薬リザーバーから50マイクロリットルの細胞懸濁液をマルチチャンネルピペットを使用して96ウェルプレートに加えます。
プレートを室温で15分間暗所でインキュベートします。インキュベーション後、蛍光標識された100ナノグラム/ミリリットルのCXCL12を、同様の試薬リザーバーから50マイクロリットルを96ウェルプレートのウェルに加えます。暗所で室温で30分間インキュベートします。
次に、96ウェルプレートを室温で400倍の重力で5分間遠心分離します。プレートを裏返して、ペレット化された細胞から上清を取り除きます。プレートをティッシュで乾かします。
試薬リザーバーから200マイクロリットルの新鮮なSAバッファーをマルチチャンネルピペットを使用してウェルに加えます。直ちにプレートを再び遠心分離し、室温で重力400倍で5分間遠心分離します。プレートを裏返し、ティッシュで乾燥させて、再び上清を取り除きます。
最後に、PBSに溶解した200マイクロリットルの1%パラホルムアルデヒドに細胞ペレットを穏やかに再懸濁します。この手順では、セルを修正します。フローサイトメトリーでサンプルを解析するには、デバイスを起動し、対応するソフトウェアを開きます。
ドットブロック形式で視覚化するセルラーパラメータを、前方散乱領域、側方散乱領域、ヒストグラムビューでフルオロ4検出チャネルとして選択します。サンプルを 1 つ選択します。例えば、ネガティブコントロールサンプルは、前方散乱および側方散乱パラメータに基づいて定義された均質な細胞集団のゲーティングを実行する。
細胞をフローサイトメトリーデバイスにロードするための設定を適応させます。注入前に3つのミックスを選択します。100マイクロリットルの固定細胞の自動注入を選択し、毎秒1.5マイクロリットルのサンプル流量を使用します。
[データの取得] を選択してサンプルを実行します。このサンプルの前方散乱光と側方散乱光のパラメータ、およびフルオロ4の検出が画面に表示されます。次に、ソフトウェアゲーティングツールを選択します。
前方散乱光と側方散乱光ドットプロットの可視化に基づいて、ゲーティングによって均質で生存可能な細胞集団を事前に定義します。サンプルあたり 20 、 000 のイベントを分析する場合に選択します。これは、各サンプルについて、事前定義されたゲート内にある20,000個の細胞が最終的に分析されることを意味します。
データ取得は、このイベント数に達するまで続行されます。最初に、分析するウェルを選択して実行を開始します。次に、ランウェルを選択します。
フローサイトメトリーデバイスは、各サンプルの平均蛍光強度を記録することにより、これらのサンプルを1つずつ分析します。これは、事前定義されたゲート内にある20, 000個の細胞からの平均蛍光シグナルに対応します。最後に、プロトコルに記載されているようにデータ分析を実行します。
高濃度のAMD3100、未確立および特異的なCXCR4アンタゴニストを含むジャーカット細胞のプレインキュベーション後。標識されたCXCL12の結合を反映する平均蛍光強度は、ほぼ完全にバックグラウンドレベルまで低下します。これは、jurkat細胞上に発現するCXCR4へのCXCL12の高度に特異的な結合を示しています。
CCR5アンタゴニストのマラビロックのように、CXCR4受容体での結合について標識CXCL12と競合できない化合物は、平均蛍光強度に影響を与えません。対照的に、高活性化合物は用量依存的にこれを行います。ビデオを見た後、生細胞とフローサイトメトリーを使用した競合的受容結合アッセイの実施方法を十分に理解しているはずです。
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概要
本記事では、CXCL12のCXCR4への結合を阻害する化合物を同定することを目的とした、フローサイトメトリーに基づく細胞結合アッセイについて解説します。この手法は、生細胞を用いて受容体結合を分析するため、放射性標識の使用を避けることができます。
研究の主要構成要素
科学分野
- 細胞結合アッセイ
- Gタンパク質共役受容体
- 創薬
背景
- CXCL12は、Gタンパク質共役受容体であるCXCR4に結合するケモカインである。
- この結合の阻害剤を同定することは、創薬に寄与する。
- 従来の手法では放射性物質が用いられることが多いが、本アッセイではそれを回避することを目的としている。
- 生細胞を用いることで、生物学的相互作用をより正確に再現できる。
研究目的
- CXCL12のCXCR4への結合を阻害する化合物を同定するためのスクリーニングツールを開発すること。
- 結合アッセイにおいて生細胞を使用することの利点を実証すること。
- Gタンパク質共役受容体の創薬研究を支援すること。
使用方法
- 細胞結合を分析するためのフローサイトメトリー。
- 結合競合を評価するための蛍光標識リガンドの使用。
- 受容体相互作用を評価するための生細胞アッセイ。
- 実験系における放射性標識の回避。
主な結果
- 本アッセイにより、CXCL12の結合を阻害する化合物を正常に同定できる。
- 生細胞解析は、従来の手法と比較してより有用なデータを提供する。
- 本手法は、潜在的な候補薬のスクリーニングに有効である。
- 結果は、創薬における本アッセイの利用可能性を裏付けるものである。
結論
- フローサイトメトリーに基づくアッセイは、CXCR4阻害剤を同定するための有用なツールです。
- 生細胞を用いることで、結合研究の精度を高めることができます。
- 放射能を避けることで、実験工程を簡略化できます。
よくある質問
産業界における重要性
このフローサイトメトリーを用いた競合結合アッセイにより、バイオ医薬品開発チームは、腫瘍学および炎症性疾患のパイプラインにおける重要な標的であるCXCL12-CXCR4相互作用を阻害する低分子化合物を同定することができます。生細胞と蛍光リガンドを使用することで、放射能を避けつつ、生理学的に妥当な結合データを得ることが可能です。本手法は、化合物の優先順位付けのための定量的で再現性のあるリードアウトを提供し、初期段階の標的妥当性確認およびリード化合物の同定を支援します。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期発見とターゲット検証
- 科学的価値： 天然の細胞内環境における受容体-リガンド結合への化合物の直接的な影響を測定することで、治療仮説の検証を可能にする。
- 運用の価値： 化合物の活性をメカニズム的に確認することで、ターゲットとしてのCXCR4のリスクを低減する機能的リードアウトを提供する。
- 予測的価値： ターゲットへの結合を示す用量依存的な阻害プロファイルを持つ化合物を特定することで、ポートフォリオの選別（トリアージ）を支援する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 平均蛍光強度を通じて定量的な結合阻害データを生成し、構造活性相関解析を可能にする。
- 運用上の価値： 96ウェルプレート形式に適応可能であり、アッセイの整合性を維持しながらスクリーニングキャンペーンのスループットを向上させる。
- 再利用性： 蛍光リガンドが利用可能であれば他のGPCRにも適用可能な標準化されたプラットフォームを確立し、再開発の手間を削減する。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 科学的価値： 生きたJurkat細胞を使用することで、生理学的な受容体発現および結合ダイナミクスを反映させ、トランスレーショナルな関連性を向上させている。
- 運用的価値： 標的特異的な化合物の効果を確認することで、後続の前臨床評価と互換性のあるデータを生成する。
- リスク軽減： 特異的なCXCR4阻害剤と非特異的な化合物（例：Maravirocは効果を示さない）を区別することで、偽陽性を減少させる。
パイプラインおよびワークフローの統合
このアッセイは、ターゲットのバリデーションからリード化合物の同定に至る創薬の連続的なプロセスに適合し、ヒット化合物からリード化合物への最適化に資する結合データを提供します。また、化合物の特性解析にメカニズム的な深みを与えることで、表現型スクリーニングを補完します。
- 探索生物学： 生細胞におけるCXCL12のCXCR4への結合が化合物によってどのように阻害されるかを定量化し、仮説検証をサポートします。
- スクリーニング： フローサイトメトリーの読み取りに対応した標準的なインキュベーション、洗浄、および固定ステップにより、アッセイの準備を可能にします。
- 分析： 平均蛍光強度を定量的な出力として提供し、用量あたりの化合物の力価および有効性を比較します。
- トランスレーショナルリサーチ： CXCR4を発現する疾患関連細胞株（Jurkat）を使用し、結合データをがんや炎症における潜在的な治療効果に結びつけます。
- 企業内での再利用： 他のGPCRターゲットにも転用可能なモジュール式結合プラットフォームとして機能し、アッセイ開発への投資利益率（ROI）を最大化します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：CXCL12がCXCR4に特異的かつ置換可能な結合を示すことを実証することで、ターゲットエンゲージメントに対する予測の信頼性を向上させます。
- 運用上の価値：標準化された細胞操作、インキュベーション時間、およびフローサイトメトリーのゲーティングプロトコルにより、再現性を確保します。
- 戦略的価値：創薬の早期段階でターゲット特異的な活性を欠く化合物を排除することで、go/no-go判断を改善します。
- ポートフォリオへの影響：明確な用量依存的阻害プロファイルを持つ化合物を特定することで、リスク調整済みの開発推進を可能にします。
実施上の検討事項
- フローサイトメトリーの操作、コンペンセーション、および生存細胞集団のゲーティング戦略に関する専門知識が必要です。
- 適切なチャンネル（例：FITCまたは同等品）で蛍光信号を検出可能なフローサイトメーターへのアクセスに依存します。
- スクリーニングバッチ全体で、細胞調製、化合物の希釈、およびインキュベーション条件を標準化する必要があります。
- 他のGPCRに適応させるには、標的受容体に特異的な蛍光標識リガンドの開発または調達が必要です。
- 実用上の制限として、アッセイ時間（約90分に解析時間を加算）および、十分なS/N比を確保するためのリガンド濃度の最適化が必要であることが挙げられます。
