哺乳類細胞におけるメジャー クロマチン アクセシビリティ規制要素のホルムアルデヒドによる分離

この実験の全体的な目標は、DNAを関連タンパク質に共有結合的に架橋し、続いて遊離DNAを精製および定量することにより、遺伝子座のクロマチンアクセシビリティを決定することです。この方法は、未処理の細胞やクロマチンリモデリングを受けている細胞の細胞タイプに関係なく、DNAアクセシビリティを決定できるため、クロマチンフィールドの主要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、実験設定ごとに滴定が必要なDNAや抗体を切断するために酵素を使用する必要がないことです。

このプロトコルには、Sonicator以外の特別な機器を必要としないという追加の利点があります。その手順を実演するのは、私の研究室の博士課程の学生であるOlesja RitterとTabea Riedlingerです。プロトコールを開始するには、ホルムアルデヒドを1日前に播種した細胞の増殖培地に直接添加し、最終濃度が1体積%に達します。

培地を室温で10分間インキュベートし、2分ごとに手動でプレートをスルーします。次に、グリシンを最終濃度0.125モルまで加えてホルムアルデヒドを急冷します。溶液を室温で5分間インキュベートし、2分ごとに死滅させます。

培地を吸引し、氷のように冷えたPBSを皿の側面に慎重に加えて細胞を洗います。メディウムを吸引し、洗濯を慎重に2回繰り返します。3回目の洗浄後、細胞を1ミリリットルの氷冷PBSに再懸濁し、必要に応じて細胞スクレーパーを使用して細胞を剥離します。

氷上の1.5ミリリットルの反応チューブに移します。冷却した卓上遠心分離機で、細胞を300g、摂氏4度で5分間遠心分離します。上清を慎重に吸引して捨てます。

細胞ペレットを1ミリリットルのFAIRE溶解バッファーに再懸濁し、数回慎重にピペッティングします。細胞を氷上で20分間インキュベートします。インキュベーション後、架橋DNAを超音波処理して平均200〜300塩基対のサイズに共有し、超音波処理中にサンプルを冷却してサンプルの加熱を防ぎます。

DNAの断片化は、フラグメントのサイズが技術全体の溶液の感度に影響を与えるため、この実験にとって重要であるため、事前に超音波処理条件を慎重に確立し、すべての実験でクロマチンフラグメントのサイズを確認することが重要です。サンプルを 15 分間遠心分離し、摂氏 4 度で 13, 000g 遠心分離します。次に、上清を新しい反応チューブに移します。

サンプルを100マイクロリットルのアリコートに分割します。100マイクロリットルのアリコートを使用して架橋を逆転させ、全DNAの参照として使用します。10マイクロリットルのRNase Aを加え、サンプルを摂氏37度で1時間インキュベートします。

次に、10マイクロリットルのプロテイナーゼK.Elect Functionは、プログラマブルサーモブロックを使用して、サンプルを摂氏37度で4時間インキュベートし、次に摂氏65度で6時間インキュベートして、タンパク質を切断し、架橋を逆転させます。新しい100マイクロリットルのアリコートを入手し、10マイクロリットルのRNase Aを追加し、サンプルを摂氏37度で1時間インキュベートします。インキュベーション後、非架橋サンプルと前のセクションの非架橋サンプルを並行して進めます。

H2Oを添加して、最終容量を300マイクロリットルにします。次に、ヒュームフードに300マイクロリットルのフェノールクロロホルムイソアミルアルコールを加え、激しく渦巻きます。サンプルを13, 000g、摂氏4度で10分間遠心分離します。

次に、上部水相の280マイクロリットルを新しい反応チューブに慎重に移します。タンパク質も含まれている間相から破片を取らないように注意し、残りの下相は有機溶剤廃棄物として捨ててください。治療を繰り返し、上部水相の270マイクロリットルを新しい反応チューブに慎重に移します。

ヒュームフードに270マイクロリットルのクロロホルムを加え、激しく渦巻かせます。サンプルを遠心分離します。遠心分離後、上部水相の250マイクロリットルを、間相からの破片を運ばないように注意しながら、新しい反応チューブに慎重に移します。

残りのサンプルは有機溶媒廃棄物として廃棄します。次に、25マイクロリットルの5モル塩化ナトリウム、250マイクロリットルのイソプロパノールを追加し、DNAキャリアとして5マイクロリットルのグリコーゲンを追加します。チューブを反転させ、室温でインキュベートします。

インキュベーション後、サンプルを遠心分離してDNAを沈殿させます。次に、DNAペレットを400マイクロリットルの70体積体積エタノールで洗浄し、サンプルを遠心分離します。上清を慎重に吸引し、ペレットを室温で10分間乾燥させます。

ペレットが乾いたら、100マイクロリットルのTEバッファーに再懸濁します。非架橋遊離DNAサンプルを摂氏65度で4時間インキュベートし、DNA間架橋を除去します。最後に、分光光度計を使用してDNAの量を定量し、少量のアリコートを実行して、2体積重量のアガロースゲルでフラグメントサイズを確認します。

HeLA細胞をTNFで1時間刺激し、FAIREで解析しました。遊離DNAと全DNAの比率は、ACTBのプロモーター、β-アクチンをコードする遺伝子、ポジティブコントロール、12番染色体上のヘテロクロマチン領域、ネガティブコントロール、およびIL8-プロモーターについて決定されました。異なる超音波処理時間を特徴とするエチジウムブロマイド染色ゲルが生成され、20分間の超音波処理後に200〜300塩基対の最適なクロマチンサイズが得られたことを示しています。

一度習得すれば、このテクニックは2日で完了します。この手順に続いて、ゲノム全体のレベルでクロマチンアクセシビリティを決定するために、ディープシーケンシングなどの他の方法を実行できます。ホルムアルデヒドとフェノールクロロホルムでの作業は非常に危険である可能性があり、この手順を実行することにより、ドラフトでの作業、手袋の着用、廃棄物の適切な処理などの予防措置を確保する必要があることを忘れないでください。