Name: 放線菌突然変異体のビジュアルと顕微鏡的評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: 学ぶ放線菌の表現型プロファイリング法。Streptomyces coelicolorを用いた四分画線法、位相差顕微鏡、蛍光染色による観察技術を習得し、初心者研究者が菌株の形態変化を評価できるようになる。

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著者は、学部学生研究員や学生研究基金賞 GVK、SGK; に Otterbein 大学を認識したいです。Otterbein ギルバート E. ミルズ教授記念恵まれてサバティカル プログラム賞を受賞し、生物学科と地球科学部研究奨学金寄附のジャブに賞。GVK と SGK バートとジェーン ホーン恵まれている学生研究基金科学が授与されました。作者は感謝するデュケイン大学 GVK の SGK の学部研究プログラム奨学金の資金によってたいです。元 Juniata の大学学部研究生、ライアン ・ ジョンソンとリンジーは、それぞれ数字 2、3、顕微鏡画像を貢献しました。

1. 楽器、文化、メディア、ソリューション、およびシャーレ
<ol><li>50 mL のビーカーにオートクレーブつまようじは、無菌を保つためにアルミ箔で覆われています。</li>
	<li>されるすべての乾燥品を滅菌するオートクレーブ (ヒント、棒、ガラス、等) を使用します。 注: 注意!使用されるオートクレーブ モデルのすべての安全指示に従ってください。オートクレーブは、爆発や蒸気、熱、材料、およびメディアとの接触から火傷の危険をもたらします。オートクレーブの安全のため「オートクレーブの適切な使用」34を表示します。</li>
	<li>
文化を育てるに寒天 (マンニトール大豆小麦粉 (SFM))14 MS を準備します。
	<ol>
<li>5 g の大豆小麦粉と寒天の 5 g を 1 L フラスコに追加します。</li>
		<li>250 mL の水道水にマンニトールの 5 g を溶かし、大豆粉と寒天を含むフラスコに分注します。</li>
		<li>121 ° c、15 psi、少なくとも 30 分間泡プラグ アンド フラスコとオートクレーブのオープニングに箔を追加します。 注意: この媒体以上の簡単に沸騰します。少なくとも 4 回 MS 寒天培地をオートクレーブに入れることの実際の量を保持することができますフラスコを使用します。標準的な圧力鍋は、同様な安全配慮のオートクレーブの代わりに使用できます。また、オートクレーブへのアクセスが可能な35,36ではない場合、メディアや材料を滅菌する電子レンジを使用する可能性があります。高校教師ローカル大学やオートクレーブの供給にアクセスする大学と協力することも。</li>
		<li>クールなメディアまでを処理するために十分に快適。50 ° C 以下の温度で寒天が固化するので長時間それを冷却しないように注意してください。</li>
		<li>各ペトリ皿の底が約半分になるまで滅菌シャーレにフラスコから MS 寒天を注ぐフル (約 25 mL の培地シャーレあたり)。寒天を使用する前に固化することができます。必要になるまで室温でビニール袋に寒天を格納します。 注: メディアで抗生物質が必要な場合に特に寒天版を冷蔵庫で保存される場合も。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2 連勝放線菌伝搬用板
<ol><li>MS 領域などの標準的なメソッドを使用して単一のコロニーを寒天上に連勝放線菌菌株は、サンダース、2012年37に示すように、メソッドを連勝します。 注: 接種ループまたは生殖不能のつまようじを使用する可能性があります。(省略可能) その他のメディアが使われています R2YE や最小媒体14などの放線菌種。</li>
	<li>30 ° C でプレートを孵化させなさい</li>
	<li>単一コロニーのすべての 4-6 日を選択することにより、プレートを restreak します。植民地時代がランダムな突然変異しがちになります。</li>
</ol>3. 細菌ストレージのグリセロール菌糸を作成します。
注: 菌糸株は、胞子形成を完了することができる他の発達変異体とbld株whiを含むすべての放線菌の菌株について作成できます。
<ol><li>200-500 μ L 滅菌木製だぼのアプリケーターを使用して 20% のグリセロールの 15-20 の植民地を漬け込みます。</li>
	<li>マイクロ ピペットまたは無菌転送ピペットを使用して 1.5 mL 冷凍庫培養管にやせるコロニーのスラリーを転送します。 注: マイクロ ピペット使用の基本は取り上げません38。</li>
	<li>最終的なボリュームに十分な 20% グリセロールを追加 1 mL と軽く混ぜます。-80 ° C で試料を保存します。 注: 注意!使用低温安全手袋、極端な寒さとの接触から皮膚を保護するために実験用の上着。また、長期貯蔵時間の潜在的な削減と-20 ° C のフリーザーを使用可能性があります。過剰な凍結と融解性を拡張するため避けてください。</li>
</ol>4. 株の胞子グリセロールを作成する胞子形成が可能
注: 胞子株式は長期的な存続のために望ましいがのみ胞子形成を完了することができる系統の実現可能な。
<ol><li>
成長37の合流芝生を取得する寒天 (ステップ 3.1) から漬け材料の 100 μ L を広めます。 注意: 拡散めっきはサンダース37に表示 (変更: ターン テーブルは必要ありません。)。プレートをオンできます片手で穏やかに来たり、スプレッダーを移動する他の手を使用している間動き寒天媒体を経由。<ol>
<li>ピペット 100 μ L の MS 寒天平板の中心にやせる菌糸体。</li>
		<li>ガラスや金属の部分的に 70% のエタノールに水没し、エタノールの蒸発を促進するブンゼン バーナー火炎の中をゆっくり一度拡散機を渡すことによってツールを拡散を滅菌します。 注意: エタノールは引火性の高いです。エタノールに燃えるようなスプレッダーを配置したり、エタノール エタノール皿に落下するのフレイミング ドロップを許可しないでください。また、エタノールや炎を必要としないプレートに細菌を広げる使い捨て滅菌綿棒を使用します。</li>
		<li>MS 寒天バックを使用している間、片方の手でプレートし、前後の滅菌スプレッダーとプレートを接種する動きは電源を入れます。</li>
		<li>歪みがよく sporulated まで 30 ° C で 5 ~ 7 日間インキュベートします。 注: インキュベーション時間は、種や系統によって異なります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>滅菌生理食塩水 2 mL を追加 (0.8 %nacl) 胞子形成を経た放線菌細胞の合流の芝生の中心に。</li>
	<li>芝生のエッジに向かって移動ループ (または綿棒) をゆっくりと接種滅菌菌糸体の表面をやさしくなでることで胞子を収穫します。</li>
	<li>15 mL の円錐管に胞子をピペットで移しなさい、生理食塩水を含みます。個々 のセルに胞子の鎖を断ち切るに、積極的に渦。</li>
	<li>常温約 2,500 x gで 5 分間遠心します。</li>
	<li>上澄みをピペットで移しなさいと破棄。残りの液体の少量の積極的な渦攪拌による胞子ペレットを分散させます。</li>
	<li>20% のグリセロールの 1 mL のピペットで上下にソリューションを描画することによって胞子を再懸濁します。</li>
	<li>冷凍庫にある、1.5 mL のチューブにグリセロール胞子株式を転送します。-80 ° C でストア 注意: 使用低温安全手袋、極端な寒さとの接触から皮膚を保護するために実験用の上着。また、長期貯蔵時間性の潜在的な削減と-20 ° C のフリーザーを使用可能性があります。過剰な凍結と融解性を拡張するため避けてください。</li>
</ol>5. 突然変異誘発を実行します。
<ol><li>変異導入で参照している目的の結果に基づくし、Baltz、2016年39によって最近確認を実行します。 注: いくつかの表現型解析実験には変異原性, 環境から新しい種を識別するために意図などは不要です。ランダム変異導入法には、トランスポゾン8,9,10、11,12,13、紫外線照射、または化学物質14の使用が含まれます。サイト指示された突然変異誘発15,16,17,18,19,20技術を使用して、特定のポイント突然変異、削除を作成できますか他のタイプの突然変異。</li>
</ol>6 を比較し、視覚的な外観を記録
<ol><li>ステップ 2 のようにすべての株をストリー キングした後は野生型の親株に比べて各変異体のコロニー形態の注意してください。S の改変やS の venezuelae、 放線菌の新種を特性評価する際など、よく研究の種の新しい隔離集団を比較します。基本的な形は、植民地の表面などの特性 (図 1) に注意してください (ファジィ、ハゲ、しわなど)、不透明度、昇格、および色素沈着 (栄養菌糸、菌糸、および/または周囲の媒体を区別)。</li>
	<li>ラベルの MS 寒天プレートとストリーク野生タイプおよび突然変異体系統くさびパターン (図 1)。ひずみが交差汚染を避けるために別の歪みを触れないように注意します。日付と時刻系統板に縞になることに注意してください。30 ° C で版を孵化させなさい</li>
	<li>色やホワイト ペーパー バック グラウンドを均質に成長したシャーレを配置します。ストリー キングの最初のプレートから紙緊張の名前、日付、培養温度と時間を書いてください。後者の情報の混乱を最小限になるように用紙の背景に書かれたプレートのデジタル画像を取る。 注: 書き込みできるからトリミング写真後で図の準備のため使用する場合は。</li>
</ol>位相差顕微鏡を実行します。
<ol><li>70% エタノールで洗浄し、エタノールを蒸発するブンゼン バーナー炎を通過し、ピンセットを滅菌します。冷却することができます。</li>
	<li>70% エタノールで洗浄し、滅菌シャーレに乾燥させる coverslips を滅菌します。</li>
	<li>
検査されるため細菌の増殖の coverslip リフトを準備します。
	<ol>
<li>滅菌ピンセットで滅菌 coverslip をピックアップし、MS 寒天版の細菌の増殖は密、coverslip を配置します。カバーガラスの背中に軽く押しますピンセットで細菌の胞子と菌糸の十分な転送を確実に。</li>
	</ol>
</li>
	<li>プレートから coverslip をピックアップし、セルの材料が付いている側面に取付のために水の準備 50% のグリセロールの 15 μ L ドロップで顕微鏡スライドの表面に向かって直面しているように配置。スライドに 45 ° の角度で、coverslip を配置することによって気泡を削減し、50% のグリセロールに落ちること。</li>
	<li>(省略可能)クリアのシールはスライドの保存のマニキュアします。</li>
	<li>
位相差顕微鏡によるフレーリッヒ ・40さまざまな時間間隔でライフ サイクルの中に説明されているように実行します。 注: 繰り返しイメージングは、詳細な分析と開発の遅延を検出する能力。精度と再現性を確保するため観測しない独立してを繰り返します。<ol>
<li>顕微鏡ステージに準備されたスライドを配置し、カバー スリップの中心に液浸オイルの滴を追加します。100 X 相の目的で配置し、適切な「一致する」位相設定にコンデンサー砲塔を設定を回転させます。対物レンズは石油と接触が微調整ノブのみを使用してイメージの焦点を当てます。</li>
		<li>突然変異系統と野生のタイプ、フォーム胞子、胞子のサイズと形状 (図 2参照) の胞子の全体的な数など顕著なと一貫性のある違いを識別するいくつかのフィールドの表示を確認します。 注: は、位相差顕微鏡の代わりに、差動干渉の対照 (DIC) 顕微鏡40明視野顕微鏡41, クリスタル バイオレット染色などで簡単な染色技術を使用します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>8 蛍光顕微鏡を実行します。
<ol><li>ピンセットを滅菌するには、70% エタノールで洗浄し、ブンゼン バーナーの炎の中を実行します。</li>
	<li>滅菌ピンセットや場所 MS 寒天版の細菌の増殖は明らかに滅菌 coverslip を拾います。細菌の胞子と空中フィラメントの十分な転送を確実にピンセットで、カバーガラスの背中をそっとさわってください。</li>
	<li>プレートから coverslip をピックアップし、セルの材料が付いている側面を厚紙、カバーガラスの操作で容易にするために、向いているように配置。</li>
	<li>冷たいメタノール (20 × 20 mm2 coverslip の ~ 300 μ L) coverslip の洪水、それは完全に空気乾燥できます。 注意: メタノールは、変異原性です。皮膚との直接接触を避けます。</li>
	<li>洗って、coverslip 3 回リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)42優しく調剤およびソリューションを削除してください。</li>
	<li>100 μ g/ml Propidium ヨウ化物の 15 μ L を追加および/または (WGA FITC) かにラベル付き顕微鏡スライドに 50% グリセロール、10 μ g/mL 小麦胚芽凝集素鎖共役型します。 注: Propidium ヨウ化汚れ DNA 赤 WGA FITC 緑細胞壁の汚れ、染色体 DNA の位置を検出します。</li>
	<li>Coverslip 滴スライド ガラスに蛍光染色の上に下向きに反転します。(オプション) スライドの保存のための明確なマニキュアで封印します。 染料は光に敏感な暗く、薄暗い部屋での 15 分間インキュベートします。</li>
	<li>位相コントラストまたはヨウ化 propidium (テキサス赤のフィルター設定、535/617 nm 励起/蛍光マキシマ) と FITC の落射蛍光励起キューブを搭載した DIC 顕微鏡を使用して 100 X 対物レンズの下でスライドを観察 (FITC フィルター設定または 490/525 nm励起/蛍光マキシマ)。</li>
	<li>ステージと粗・微動調整ノブを使用してフォーカスにスライドを配置します。</li>
	<li>43を他の所で示すように、蛍光を観察します。</li>
	<li>低蛍光強度44と胞子の識別するために助けることができる無料の画像解析ソフトウェア パッケージを使用します。</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

ここで系統を反映し、長期保存のため在庫を準備するための手順を含めることによって研究を開始する放線菌研究者を開始するためのプロトコルを提案する.その後、放線菌の菌株の視覚的及び微視的特性のプロトコルについて述べる.フェノタイピング突然変異体のいくつかの典型的な最初の手順は、: 1) 野生型の寒天培地上のコロニーに比べて突然変異コロニーの目視検査2) 位相差顕微鏡・ 3) sporogenic 空中菌糸の蛍光顕微鏡像。これらの 3 つの手順で表示される表現型を基に、さらに特定の株の表現型を識別するさまざまな手法を用いることができます。
初期の表現の実験は、新しい種を特徴付ける、興味の突然変異を識別する、部分的に変異体を特徴付ける、識別された突然変異体の表現型に基づく特定遺伝子の典型的な役割を識別するを開始する使用されます。ここで説明する方法は、既に大学を識別し、特徴付ける細胞分裂48,49,の欠陥を含め、放線菌の変異体のさまざまな所で使用されています。50,51,52,53,54、胞子形成55,56、菌糸形成57,58、抗生物質生産59、第 2 メッセンジャー シグナリング47、および染色体分配60します。 これらのテクニックは、一般的に突然変異体の表現型を決定する重要な最初のステップと大量の興味の遺伝子の役割についての重要な情報を明らかにします。メソッドは、放線菌の他の種に容易に拡張することがあり、既にs ・ ミセス属、 s. venezuelae s. 疥癬、および他の多くの放線菌の系統を記述するために使用されています。ここで説明されているビデオ プロトコルが創部における放線菌研究のフィールドを入力新しい研究者のための重要なリソースとして期待されます。これは、抗生物質耐性の危機と無数の小さな世界のイニシアティブのクラウドソーシングの努力に参加する新たな学部生研究者の教育と戦うために働いている新しいインストラクターを含まれます。
ここで説明したテクニックは、研究所、動画とテキストで説明されている変更に加え大学や高校の教室の使用に容易に適応することができます。小さいリベラルアーツの大学で最初年顕微鏡モジュールで学生が株を連勝、寒天、上に成長した株のデジタル写真を撮るし、の提出で絶頂に達した位相差顕微鏡および蛍光顕微鏡を実行することができる、実験室での仕事の 15 h を表す 3 週間モジュールの終わりに多パネルをはめられた数字のポートフォリオ。約 160 1年生 320 新規トランスポゾン変異体の初期の表現に責任があった。3 つの機関での学部の研究生は追加の突然変異体の初期のフェノタイピングと系統の多くのそれに続く評価に参加しました。時間の比較的短い期間で得られる包括的なデータは、ここで説明したプロトコルの値を示しています。追加の突然変異体の数百は、将来特性の菌糸グリセロールとして格納されています。
最初の実験は、ここで説明した、次の興味の系統に係る情報の品質を拡張するさまざまな方法を用いることができます。突然変異が既知の場合ジェノタイピング法を依頼型や突然変異の位置を決定してください。たとえば、ランダムなトランスポゾン野生型染色体6,7,8,9,10、11,12,13 の突然変異の誘発上記を記述されていないなどの初期表現型スクリーンを受けるべきである植民地の結果します。反対のポリメラーゼの連鎖反応 (iPCR)61などのテクニックを使用してトランスポゾンの場所を識別する必要があります。新たに発見された突然変異体の遺伝子型を決定する次の初期特性の重要なステップです。
教室で言及されることがありますやさらなる研究を通じて探求以降表現分析のためいくつかの一般的に使用される高度な方法は、緑色蛍光タンパク質 (GFP)、興味の蛋白質の局在化のパターンを決定するためのタグ付け遺伝子発現解析などの時間の量的な PCR (qPCR) と野生型の世界的な遺伝子発現パターン変異 RNA シーケンス (seq RNA) 経由で対。表現型解析スキルも遺伝的相補性の分析のために必要です。相補性の実験では、新しく追加された対立遺伝子が変異遺伝子の機能喪失に補うことができるかどうかを決定する変異株に遺伝子の野生型のコピーを導入します。元の突然変異体と保護者による制限のそれと補完のひずみの表現型を比較すると、野生型株が必要です。

放線菌は、グラム陽性菌、糸状菌土壌細菌の抗エイズ薬・抗寄生虫薬さまざまな市販の抗生物質だけでなく、抗腫瘍の 3 分の 2 以上を含む、二次代謝産物を生産する能力で知られています。1. S. 改変属2,3の最も遺伝的特徴とメンバーでありここで説明した方法で使用される種であります。S. 改変は単胞子の発芽から始まる複雑なライフ サイクル寒天培地に育つ、広範な分岐栄養菌糸に進みます。ライフ サイクルが進むにつれて、空中のフィラメントが形成される基板菌糸体の表面張力を破るし、最終的に最終的に成熟した、グレー色素胞子に変換されるセルの長い鎖に分かれています。これらの新たに形成された胞子の分散は、次のライフ サイクル4の始まりを構成します。
分化の複雑なパターンは、ためS. 改変は細菌の開発の研究のための優れたモデルとして機能します。歴史的に、変異は開発の 2 つの主要な段階のブロックで起因し、明確な視覚的表現型を作り出します。Bld (ハゲ) 変異体菌糸形成と「ハゲ」コロニー出現を与えるファジィ菌糸の欠如の結果ブロックされます。突然変異体は胞子形成の抑制し、成熟と呼びますwhi (ホワイト) 変異株から、彼らは通常灰色胞子顔料の野生型レベルを生成に失敗して、菌糸が白。他の興味深い変異体が抗生物質の生産、細胞分裂、染色体分配、または他の重要なプロセス4,5で抑制されます。
放線菌種に多く発達遺伝子の発見、にもかかわらずより突然変異体画面の彩度の欠如に基づいて存在と考えられて多くがあります。我々 の研究室は、構築したミニ トランスポゾン システムを使用して新しい発達の遺伝子を識別するために続けます。新規変異株を分離した私たちのトランスポゾン ランダム変異導入実験は、各新しい遺伝子を発見した6、7の可能な役割を識別する表現型スクリーニングを受けます。ここで説明した細菌の表現型解析法、トランスポゾン変異8,9,10、11,12、によって分離された放線菌の変異体に関連します。 13とジーン15,16を使用して遺伝子の削除などの突然変異の監督の建設と同様に、化学と紫外線 (UV) 突然変異誘発14などの他のランダムな方法またはCRISPR Cas9 (クラスター化された定期的に空間短い回文繰り返し) ゲノム編集技術17,18,19点突然変異は20。
抗生物質耐性病原体の間でますます普及しているになると、新しい抗生物質のための必要性はますます緊急21,22になります。「小さな世界構想」(または SWI) は効果的な科学技術、工学および数学 (茎) 大学生のクラウドソーシングを通じて抗生物質耐性戦闘に戦略24 23と研究を学習最近高校生。サポート コース新規抗生物質 (http://www.smallworldinitiative.org) を生成する新しい土壌微生物を識別する作業が含まれます。未知の抗生物質の主要な源は放線菌種は土の広い範囲で発見、水の生息地25,26,27,28、続けますといわれています。 29,31。最近、当研究室と他の作業を検出し、信号形態と抗生物質生産7,32を含む、開発を規制する放線菌遺伝子の特徴 33。これらの遺伝子発現の変化量と生成される抗生物質のタイミングの変更あります。新しい種と新しい抗生物質生産変異体の熟練した表現型解析は重要である続けます。新しい講師と生徒は、創薬の分野への主要な貢献者になるように、細菌の表現型解析にトレーニングはこれらの初心者個人の成功に必要です。さらに、これらの実験は高校幹または大学微生物学教育研究所の扱いやすいです。設定教育実習で基本的な微生物遺伝的原理のデモンストレーションを表します。

<table><tbody><tr><td>50%グリセロール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>イマージョンオイル(タイプDF)</td><td>Cragille&nbsp;</td><td>16482</td><td></td></tr><tr><td>レンズペーパー</td><td>フィッシャーブランド</td><td>11-995</td><td></td></tr><tr><td>滅菌水</td><td>GeneMate</td><td>G-3250-1L</td><td></td></tr><tr><td>100% エタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム</td><td>Invitrogen</td><td>P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>つまようじ (フラット)</td><td>ターゲット</td><td>081-22-1957</td><td></td></tr><tr><td>ピペットチップ (10 mL)</td><td>GeneMate</td><td>P-1240-10</td><td></td></tr><tr><td>ピペットチップ (200 mL)</td><td>GeneMate</td><td>P-1240-200Y</td><td></td></tr><tr><td>ピペットチップ (1,250 mL)</td><td>GeneMate</td><td>P-1240-1250</td><td></td></tr><tr><td>木製アプリケーター 6''</td><td>ソロンケア</td><td>070809</td><td></td></tr><tr><td>綿棒</td><td>フィッシャーブランド</td><td>23-400-124</td><td></td></tr><tr><td>大豆粉&nbsp;</td><td>ボブのレッドミル&nbsp;</td><td>1516C164</td><td></td></tr><tr><td>D-マンニトール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4125-1KG</td><td></td></tr><tr><td>寒天</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296-1KG</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール 100%</td><td>VWR amresco ライフサイエンス&nbsp;</td><td>0854-1L</td><td></td></tr><tr><td>0.8% NaCl (生理食塩水)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBB9000V</td><td></td></tr><tr><td>1.2 mL 冷凍庫チューブ</td><td>NEST</td><td>606101</td><td></td></tr><tr><td>超低 (-80 °C;C)冷凍庫</td><td>SO-LOW</td><td>U85-18</td><td></td></tr><tr><td>クライオ安全手袋</td><td>Bel-Art</td><td>H13201</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5856-500EA</td><td></td></tr><tr><td>カバー スリップ #1.5</td><td>Thomas Scientific</td><td>64-0721</td><td></td></tr><tr><td>スライド</td><td>Carolina</td><td>63-2010</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Tuttnauer</td><td>2540E</td><td></td></tr><tr><td>位相差顕微鏡&nbsp;</td><td>オリンパス</td><td>BX40</td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td>カロライナバイオロジカル</td><td>624504</td><td></td></tr><tr><td>ブンゼンバーナー</td>カ<td>ロライナバイオロ</td><td></td>ジカル706706<td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>34860-1L-R</td><td></td></tr><tr><td>PBS(リン酸緩衝生理食塩水)</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>P4417-50TAB</td><td></td></tr><tr><td>WGA-FITC</td><td>ビオチウム</td><td>29022-1</td><td></td></tr><tr><td>クリアマニキュア</td><td>OPI</td><td>22001009000</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>フリー ソフトウェア</td><td></td></tr><tr><td>100 mL ビーカー</td><td>パイレックス USA</td><td>1000-T</td><td></td></tr><tr><td>1 L ビーカー</td><td>カロライナ バイオロジカル</td><td>721253</td><td></td></tr><tr><td>1 L フラスコ</td><td>フィッシャーブランド</td><td>S63274</td><td></td></tr><tr><td>250 mL フラスコ</td><td>パイレックス USA</td><td>4980</td><td></td></tr><tr><td>100 mL メス シリンダー</td><td>Carolina Biological</td><td>721788</td><td></td></tr><tr><td>500 mLメスシリンダー&nbsp;</td><td>カロライナ生物</td><td>721792</td><td></td></tr><tr><td>攪拌棒</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>22-271825</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>カメラ顕微鏡オ</td><td>リンパス</td><td>DP72</td><td></td></tr><tr><td>ニトリル検査手袋(メド)</td><td>バイオエクセル</td><td>71011002</td><td></td></tr><tr><td>ボルテックスミキサー</td><td>カロライナバイオ</td><td>バイオ701077</td><td></td></tr></tbody></table>

放線菌突然変異体のビジュアルと顕微鏡的評価

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

放線菌は、世界中で発見され、抗生物質や他の代謝産物の広い配列を生成する、アクチノ バクテリア門に属する糸状土壌細菌です。放線菌の改変はさまざまな実験室での分析に従うよ特徴付けられた、非病原性の種であります。説明する表現方法はここでモデル放線菌; としてs. 改変を使用します。ただし、メソッドは、いくつかの密接に関連放線菌と同様に、この大きな属のすべてのメンバーに適用されます。表現型解析は環境で識別される放線菌の新種の特性評価に必要なまた放線菌の新規分離された突然変異系統の特性の重要な最初のステップです。表現の能力は細菌の開発、細胞分裂、染色体分配、信号 2 つ目のメッセンジャーの研究が含まれます放線菌研究のフィールドに入っている多くの新しい人のため重要です。新しい土壌微生物の分離により抗生物質発見の最近のクラウドソーシングはインストラクター放線菌研究の大学や高校のフィールドに新しい表現の訓練のための高められた必要性の学生になりました。この原稿は、細菌の伝播、ストレージ、および視覚および顕微鏡検査における特性評価のための方法を説明します。この記事を読んだ後新しい研究者 (微生物学教育研究所と市民の科学者) は放線菌の菌株を操作および視覚特性実験を開始することができるはず。

初期表現型解析実験、新しい種や系統の特性評価に必要な新しい種を特徴付けるために使用される DNA 交雑実験と系統分類への無料アプローチとして使用できます。放線菌の突然変異体のランダム変異導入法化学物質、紫外線などから生じる寒天プレートに直接、視覚的画面を通して識別される通常のトランスポゾン変異または。放線菌のコロニーは野生型、親のひずみと比較すると表現型の変化を検討しました。たとえば、軽く着色された菌糸、胞子形成の欠陥によって引き起こされる灰色の顔料の下位レベルまたはファジィ外観の欠如は菌糸形成 (図 1) でブロックを示す。多くの放線菌は、栄養菌糸または周囲の寒天の色素に抗生物質を生産します。S. 改変は、2 つの非色素物と同様、二つの色素性の抗生物質を生成します。アクチノロジンはブルー発色の抗生物質、undecylprodigiosin は赤色色素の抗生物質の45。初期視覚的植民地画面を受けた系統は単一コロニーのストリー キングに伝達されます。
次の可能性のある興味深い変異体の視覚的な識別、系統な顕微鏡検査を受けます。位相差顕微鏡はコントロール (図 2) と野生型ひずみを用いた発達障害の放線菌変異を調べることに特に適しています。野生型s. 改変コロニー通常 MS の寒天、30 ° C での成長の約 2 日間と胞子の長い鎖成長の 3 日間で空中菌糸を生成します。ライフ サイクルは、若干低速または他のタイプのメディアに高速に進行します。発育障害や遅延についての結論を描画するときに、変異体が野生型と同じ成長の条件の下で分析することが不可欠です。ハゲの変異体は、寒天に長期成長の後胞子を作り出す可能性があります。胞子形成のためか白い突然変異体が遅れると呼ばれる変異体のクラスは、胞子形成、形状やサイズの欠陥を有する農産物胞子の豊富なまたは灰色、成熟した胞子顔料46の単に農産物より低いレベルに減少を示す.他の変異体がこれまでに調査を遅延またはシグナル分子 (例えば、繰返し・ ディ ・ GMP47) の蓄積の影響を受けて変異体などライフ サイクルの進行に加速した可能性があります。
上記光顕微法の簡単なフォロー アップは、胞子形成隔壁の細胞壁を染色する染色染色体 DNA 核様体と蛍光に分類された小麦胚芽凝集素による蛍光顕微鏡です。染色、通常は染色 (図 3) は減少しているように思われた場合識別される可能性がありますよりも少ない DNA を含む胞子中赤 propidium ヨウ化を欠いている染色体を欠いている胞子になります。小麦胚芽凝集素は細胞壁を染色するされることがあります、染色パターン (すなわち、細胞分裂の欠陥) 細胞壁における相違点が観察されることがあります。S. venezuelae、別モデルとして最近使用されている種の図 4野生型株のライフ サイクルや液体45、感受性に力から高速放線菌は、明らかにする WGA FITC で染色されています。胞子形成の初期段階で一般的に見られる分裂隔壁のはしごのような配列です。
ここで説明されている初期フェノタイピング戦略は次になります: 1); のさらなる研究のための興味の突然変異系統の同定2) 新たに同定された変異と遺伝子が変異していることの潜在的な役割についての知識を取得しました。3) 問題の遺伝子の役割をさらに明確に使用することができます次の実験手順の後続シリーズの定式化。環境から新たに同定された放線菌、場合研究者は既に特徴付けられる放線菌の種と比較して潜在的な新しい種の知識を得る。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57373/57373fig1.jpg"> 図 1: S. 改変の巨視的コロニーの表現型を示す代表的な寒天培地プレートの写真。野生型s ・改変の空中菌糸体の外観を灰色は発達の表現型を持つさまざまなランダムなトランスポゾン挿入変異体と比較して MT1110 (WT) をひずみ寒天プレートを示しています、ファジー。突然変異体は菌糸 [ハゲ (ビル)] または減らされた胞子色素沈着 【 ホワイト (whi) 】 と菌糸どちらか欠けています。トランスポゾン変異体挿入変異6、7のミニ Tn5 を使用して生成します。系統は、30 ° C で 5 日間の MS 寒天上に成長しました。シャーレの直径、100 mm。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57373/57373fig2.jpg"> 図 2: 代表者を空中に示す位相差顕微鏡S. 改変白い突然変異体のフィラメント系統含むランダムなトランスポゾン挿入変異します。(A) 表示は均等に生産、同期の間隔を定期的に細胞の分裂を受けている代表的な野生型の空中フィラメントの形、サイズの胞子 (MT1110)。(B-F)残りのパネルは、ランダムなトランスポゾン変異を介して分離された各種の白い突然変異体の著しく異なる微細な表現型を示します。パネルBは、胞子形成を経ていませんが、代わりにフィラメント内の膨らんだ領域を生産している空中のフィラメントを示しています。長い矢印C D、およびFは、MIC42、MIC43、および TH49 の突然変異体の特徴である、異常に大きな胞子を示します。パネルDの短い矢印は、分離胞子コンパートメントの例を示します。Eパネルは TH10 変異株による産生胞子鎖の典型的な部分的に収縮の小さいコンパートメントを示しています。系統は、30 ° C で 5 日間の MS 寒天上に成長しました。変異体は、図 1で示されるように関係がありません。野生型の胞子は、長軸約 1.1 μ m です。スケール バー = 2 μ m.<a href="/files/ftp_upload/57373/57373fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57373/57373fig3v2.jpg"> 図 3: 代表的な顕微鏡S. 改変の突然変異体の染色体分離の表現型を示すします。(A) A の表現図表示染色体変異の断続的な染色パターンと比較して (すべての胞子は、染色体 DNA を含んでいる) の胞子の鎖の典型的な野生型、定期的に間隔染色外観分離の欠陥。(B) パネルの各ペアを示し、同じ胞子チェーンが左側に差動干渉の対照 (DIC) のイメージで観測された propidium ヨウ化染色蛍光イメージが右側に表示されます。野生型表現型、( b) は、2 つのランダムなトランスポゾン挿入変異 (c、 d e、 f) と比較されます。矢印は、DNA を欠いている胞子を示します。系統は、30 ° C で 5 日間の MS 寒天上に成長しました。示す変異体は、図 1と図 2の関係がありません。スケール バー = 1 μ m.<a href="/files/ftp_upload/57373/57373fig3v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57373/57373fig4v3.jpg"> 図 4: s. venezuelae野生型株の蛍光顕微鏡写真に染まった WGA FITC 。空中フィラメントの A (A) 図がインデントを滑らかに見えるし、胞子形成の初期段階を示す細胞壁の汚損のはしごのような配列と比較して位相差顕微鏡による胞子形成の目に見える印を持たないその同じフィラメントの WGA FITC を使用して蛍光顕微鏡下で始まった。(B) 野生型s. venezuelaeの顕微鏡写真。(、) の滑らかな航空のフィラメントが胞子の鎖の間で存在します。(b) パネルに表示菌糸内 1 つ、開発の初期段階で空中のフィラメントは、細胞壁形成のはしごのような配列を所有しています。矢印は、それは発達に関連付けられている胞子形成を受けるよう単一空中フィラメント内で同期的に発症する WGA FITC で染色してクロス壁の間隔が規則的に形成を示しています。ひずみは 30 ° C で 38 時間 (Maltose、 Yイースト抽出物、 Malt エキス) MYM MYM 寒天上に成長しました。スケール バー = 2 μ m.<a href="/files/ftp_upload/57373/57373fig4v3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

ここで重要な薬理学的細菌属放線菌の表現型解析を開始する研究者紹介初心者のためのプロトコル。

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of ...

以下の技術の全体的な目標は、大学の教育研究室や高校の教室でストレプトマイセスや他の関連種を扱うための初心者研究者を訓練することです。表現型の観察は、Streptomyces研究の分野に参入する多くの研究者にとって重要です。このビデオでは、細菌の増殖、保存、目視および顕微鏡検査の方法について説明しています。ここで説明する表現型法は、Streptomyces coelicolorをモデルとして用います。ただし、この方法は、大型属のすべてのメンバーだけでなく、密接に関連する放線菌にも適用できます。これらの手法の主な利点は、高校の教室や学部の教育研究室の初心者研究者だけでなく、経験豊富な研究室の担当者もアクセスできるように設計されていることです。このビデオを見て、付属のプロトコルを読んだ後、新しい研究者はStreptomyces株を操作し、適切に保存して、視覚的特性評価実験を開始できるはずです。手順を実演するのは、オッターバイン大学の私の研究室の学部生であるGarret KandellとSean Kirkです。まず、Saunders 2012で実証された象限ストリーク法などの標準的な方法を使用して、Streptomyces株をMS寒天プレートにストリークし、培養を単一のコロニーにします。4〜6日ごとに、1つのコロニーを選び、それを新しいプレートに再度縞模様にします。コロニーが老化すると、ランダムな突然変異を起こしやすくなります。テキストプロトコルに従って突然変異誘発を行った後、野生型の親株と比較した各変異体のコロニー形態に注意してください。新しいStreptomyces種を特徴付けるときは、新しい分離株をよく研究された種の分離株と比較し、基本的な形状、コロニーの表面、不透明度、隆起、および色素沈着に注意してください。MS寒天プレートを標識し、野生型および変異株をウェッジパターンで線条状にします。クロスコンタミネーションを避けるために、ひずみが他のひずみに触れないように注意してください。プレートにひずみが縞模様になっている日時に注意してください。次に、プレートを摂氏30度でインキュベートします。Streptomycesサンプルを汚染から常に保護することが非常に重要であることを忘れないでください。すべてのステップで最高の滅菌技術を使用し、プレートとチューブを可能な限り短い時間で開きます。成長したペトリ皿を色紙または白い紙に置き、背景を均質化します。紙に菌株名、日付、インキュベーション温度、および最初のプレートストリーキングからの時間を書きます。紙の背景にひずみ情報を書いたプレートのデジタル写真を撮り、混乱を最小限に抑えます。ピンセットを70%エタノールで洗浄し、ブンゼンバーナーの炎に通してエタノールを蒸発させて滅菌します。カバースリップを70%エタノールで洗浄し、滅菌済みのペトリ皿で乾燥させて滅菌します。次に、細菌増殖のカバースリップリフトを準備するには、滅菌ピンセットを使用して滅菌カバースリップをピックアップし、細菌の増殖が密集しているMS寒天プレートにカバースリップを置きます。ピンセットを使用して、カバーガラスの裏側をそっと押して、細菌の胞子と空中菌糸体が十分に移動するようにします。プレートからカバースリップを拾い上げ、細胞材料を50%グリセロールの15マイクロリットル滴を含む顕微鏡スライドの表面に向けて45度の角度で置きます。カバーガラスをグリセロールに落とすと、気泡が減少します。位相差顕微鏡をさまざまな時間間隔で行うには、準備したスライドを顕微鏡ステージに置き、カバーガラスの中央に液浸油を一滴加えます。100xフェーズ目標を所定の位置で回転させ、コンデンサータレットを適切なマッチングフェーズ設定に設定します。対物レンズがオイルに接触したら、微調整ノブのみを使用して画像の焦点を合わせます。いくつかの視野を調べて、変異株と野生型との間の顕著で一貫した違いを識別します。胞子を形成する能力、胞子のサイズと形状、胞子の総数など。滅菌ピンセットを使用して、細菌の増殖が明らかな場合と同様に、MS寒天プレートからカバースリップリフトを準備し、ピンセットでカバースリップの裏側にそっと触れて、細菌の胞子と空中フィラメントの十分な移動を確保します。プレートからカバースリップを拾い上げ、カードストックの上に置いて、セル材料のある面が上を向くようにして、カバースリップを簡単に操作できるようにします。氷冷したメタノールでカバーガラスを浸し、5分間放置します。PBSを使用して、溶液を静かに分注して取り除き、カバーガラスを2回洗います。10マイクログラム/ミリリットルのヨウ化プロピジウム溶液の15マイクロリットル、またはWGA-FITCの1ミリリットルあたり10マイクログラムをスライドに加えます。カバーガラスを下向きにして蛍光染色の滴の上に置きます。サンプルを暗い部屋または薄暗い部屋で15分間インキュベートします。蛍光染色剤および染色サンプルのストックは、光から保護する必要があります。研究者は、サンプルを準備するときは暗い場所を使用し、サンプルが準備されたら暗いボックスを使用してサンプルを保持することをお勧めします。位相差顕微鏡またはヨウ化プロピジウムおよびFITC用の落射蛍光励起キューブを装備したDIC顕微鏡を使用して、100倍対物レンズの下でスライドを観察します。テキストプロトコルに従って画像を分析します。ここに示されているのは、トランスポゾン突然変異誘発に起因するStreptomyces変異体の例です。明るい色の空中菌糸体は、胞子形成の欠陥によって引き起こされる灰色の色素のレベルが低いことを示している可能性があります。または、ぼやけた外観の欠如は、空中菌糸体形成のブロックを示しています。位相差顕微鏡で見られるように、野生型S.coelicolorコロニーは、通常、約2日の成長で空中菌糸体を生成します。そして、成長の3日で胞子の長い鎖。白色変異体は、胞子形成が遅れるか、産生される胞子の量が減少するか、形状および/またはサイズの欠陥を有する胞子を生成するか、または単に成熟した灰色の胞子色素を低レベルで産生する可能性があります。DICおよび蛍光顕微鏡とPI染色を用いたところ、野生型サンプル中の胞子鎖の等間隔染色を、染色体分離欠損を示す2つのトランスポゾン挿入変異体の間欠染色パターンと比較しています。WGA-FITCを使用して細胞壁を染色すると、野生型株S.venezuelaeは胞子の鎖の間に滑らかな空気フィラメントとして存在します。そして、胞子形成中に典型的に見られる分割中隔の配列のような外側を示します。糸状生物を扱うことは、よく知られている棒状の細菌を扱うこととは大きく異なります。ここでのビデオプロトコルは、Streptomyces研究の分野に参入する真新しい研究者にとって重要なリソースとして役立つはずです。このビデオを見た後、Streptomyces種やその他の関連細菌の研究を開始する方法についてよく理解しているはずです。これらの最初の実験に続いて、Streptomyces株についてさらに学ぶために、研究室でさまざまな手法を使用することができます。例えば、高度な技術には、タンパク質のタグ付けや、リアルタイムPCRやRNAシークなどの遺伝子発現解析などがあります。初期の表現型解析は、新しい株を同定して特徴付け、特定の遺伝子の典型的な役割を識別するために使用されます。これらの方法は、すでに大学の教育研究室で、さまざまなストレプトマイセス株を同定し、特徴付けるために使用されています。

visual-microscopic-evaluation-streptomyces-developmental

Research

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放線菌突然変異体のビジュアルと顕微鏡的評価

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