ストレプトミセスにおける発生変異体を評価するための位相差顕微鏡

糸状土壌細菌である Streptomyces coelicolorの野生型および変異株のコロニーを含む寒天プレートから始めます。

コロニー表面の上に伸びるフィラメントである空中フィラメントがはっきりと見える、密なコロニー成長の領域に滅菌カバーガラスを置きます。

カバーガラスをそっと押して、空中フィラメントと関連する胞子をカバーガラス表面に移します。

次に、封入剤を含む顕微鏡スライドを取り、カバーガラスのセル側を下にして取り付けて、細菌構造を保存します。

スライドを顕微鏡ステージに置き、カバーガラスに浸漬油を一滴加え、対物レンズを位置合わせします。

位相差顕微鏡を使用して、野生型株と変異株の両方から空中フィラメントの画像を取得します。

野生型フィラメントは、均一なサイズで規則的な間隔の胞子を示します。

対照的に、変異株は、膨らんだフィラメント、不規則な胞子、溶解した胞子などの欠陥を示し、野生型と変異体の間の発生表現型の違いを明らかにします。

細菌増殖のカバーガラスリフトを準備するには、滅菌ピンセットを使用して滅菌カバーガラスをピックアップし、細菌の増殖が密集しているMS寒天プレートにカバーガラスを置きます。ピンセットを使用して、カバーガラスの裏側を軽く押して、細菌胞子と気上菌糸体が十分に移動するようにします。プレートからカバーガラスを持ち上げ、15マイクロリットルの50%グリセロール液滴を含む顕微鏡スライドの表面にセル材料を45度の角度で置きます。

カバーガラスをグリセロールに落とすと、気泡が減ります。さまざまな時間間隔で位相差顕微鏡検査を行うには、準備したスライドを顕微鏡ステージに置き、カバーガラスの中央に浸漬油を一滴加えます。100倍位相対物レンズを所定の位置で回転させ、コンデンサータレットを適切な適合位相設定に設定します。

対物レンズがオイルに接触したら、微調整ノブのみを使用して画像の焦点を合わせます。いくつかの視野を調べて、変異株と野生型の間の顕著で一貫した違いを識別します。胞子を形成する能力、胞子のサイズと形状、胞子の総数など。