ナノ流体チップを使用して希少な転写産物バリアントを検出するためのチップベースのデジタルPCR

チップベースのデジタルPCR技術は、単一の反応をナノ流体チップのチャンバーに分割します。分割された配列の増幅により、まれな転写産物変異体(低頻度で発生する非標準転写産物)の検出が可能になります。

まず、標的の希少転写産物バリアントと一般的なバリアントのcDNAを含むサンプルを採取します。熱安定性DNAポリメラーゼ、dNTP、およびプライマーを含む溶液を追加します。

一般的でまれな転写産物変異体特異的オリゴヌクレオチドプローブを追加し、異なる蛍光レポーターとクエンチャー分子で標識します。クエンチャーは、近接するとレポーターの蛍光を吸収します。

混合物をナノ流体チップにロードします。溶液は均一なサイズのナノチャンバーに分割されます。cDNAを含む各チャンバーは、独立した反応容器として機能します。

熱サイクルプロセスを開始します。高い変性温度により、二本鎖DNAが一本鎖に分離されます。温度を下げて、プライマーとオリゴヌクレオチドプローブが単一のDNA鎖の相補領域にアニールできるようにします。

温度を上げて伸長ステップに到達し、DNAポリメラーゼがプライマーを伸長させてプローブを切断します。クエンチャーからの距離により、レポーターの蛍光発光が可能になります。蛍光シグナルを読み取ります。

増幅された希少転写産物ターゲットを持つチャンバーと、ターゲットを欠いたチャンバーを示す散布図を作成します。標的の陽性シグナルは、サンプル中に希少転写産物バリアントが存在することを示します。

まず、マスターミックスとアッセイを室温で少なくとも20分間解凍します。次に、0.5ミリリットルのチューブに6マイクロリットルのcDNAサンプルをロードします。また、テンプレートなしのコントロールチューブを作成します。次に、マスターミックスを穏やかにボルテックスし、反応ごとに8.7マイクロリットルを滅菌チューブに分注します。

次に、反応ごとに、0.87マイクロリットルのカスタムアッセイプライマーを加え、1.83マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を加えます。組み合わせを穏やかに混合し、11.4マイクロリットルをcDNAを含む各チューブとテンプレートなしのコントロールに移します。次に、チューブを穏やかに混合し、パルス遠心分離を使用してチューブの内容物をプールします。最適な結果を得るには、できるだけ早くチップをロードしてください。

チップローダーを接続し、インジケーターライトが緑色に変わるまで待ちます。次に、プランジャーを1〜2ミリメートルまでそっと引いて浸漬液シリンジを準備し、キャップを取り外してチップを追加します。

次に、新しいチップの蓋に書かれたコードをメモし、蓋の横を慎重に持ち、保護フィルムをはがし、粘着面を上にして蓋の巣に置きます。次に、レバーを押してクランプを開き、チップをチップネストに慎