Name: 真核生物の転写エラーのゲノム全体の監視 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: 学ぶC-seqアッセイによる真核生物の転写エラー測定法。RNAサークル化とローリングサークル逆転写を用いて、転写忠実性と転写変異誘発をゲノム規模で解析する革新的バイオインフォマティクス手法です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この文書は、(C. フリッチュ) に助成金 T32ES019851 からの資金によって可能になった、R01AG054641 と遠く若手研究者は (M. Vermulst) に付与します。

<ol><li>Kireeva, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+reversal+of+RNA+polymerase+II+active+site+closing+controls+fidelity+of+transcription+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Transient reversal of RNA polymerase II active site closing controls fidelity of transcription elongation.</a> Molecular Cell. 30, 557-566 (2008).</li>
<li>Walmacq, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rpb9+subunit+controls+transcription+fidelity+by+delaying+NTP+sequestration+in+RNA+polymerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rpb9 subunit controls transcription fidelity by delaying NTP sequestration in RNA polymerase II.</a> The Journal of Biological Chemistry. 284, 19601-19612 (2009).</li>
<li>Strathern, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fidelity+of+transcription%3A+RPB1+%28RPO21%29+mutations+that+increase+transcriptional+slippage+in+S.+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The fidelity of transcription: RPB1 (RPO21) mutations that increase transcriptional slippage in S. cerevisiae.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288, 2689-2699 (2013).</li>
<li>Irvin, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+assay+for+transcription+errors+reveals+multilayer+control+of+RNA+polymerase+II+fidelity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A genetic assay for transcription errors reveals multilayer control of RNA polymerase II fidelity.</a> PLoS Genetics. 10, e1004532(2014).</li>
<li>Gout, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+landscape+of+transcription+errors+in+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">The landscape of transcription errors in eukaryotic cells.</a> Science Advances. 3, e1701484(2017).</li>
<li>Gout, J. F., Thomas, W. K., Smith, Z., Okamoto, K., Lynch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+detection+of+in+vivo+transcription+errors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Large-scale detection of in vivo transcription errors.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110, 18584-18589 (2013).</li>
<li>Viswanathan, A., You, H. J., Doetsch, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+change+caused+by+transcriptional+bypass+of+uracil+in+nondividing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phenotypic change caused by transcriptional bypass of uracil in nondividing cells.</a> Science. 284, 159-162 (1999).</li>
<li>Bregeon, D., Doddridge, Z. A., You, H. J., Weiss, B., Doetsch, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+mutagenesis+induced+by+uracil+and+8-oxoguanine+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptional mutagenesis induced by uracil and 8-oxoguanine in Escherichia coli.</a> Molecular Cell. 12, 959-970 (2003).</li>
<li>Saxowsky, T. T., Doetsch, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase+encounters+with+DNA+damage%3A+transcription-coupled+repair+or+transcriptional+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase encounters with DNA damage: transcription-coupled repair or transcriptional mutagenesis.</a> Chemical Reviews. 106, 474-488 (2006).</li>
<li>Saxowsky, T. T., Meadows, K. L., Klungland, A., Doetsch, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((8-Oxoguanine-mediated+transcriptional+mutagenesis+causes+Ras+activation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">8-Oxoguanine-mediated transcriptional mutagenesis causes Ras activation in mammalian cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 105, 18877-18882 (2008).</li>
<li>Vermulst, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+errors+induce+proteotoxic+stress+and+shorten+cellular+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Transcription errors induce proteotoxic stress and shorten cellular lifespan.</a> Nature Communications. 6, 8065(2015).</li>
<li>van Leeuwen, F. W., Burbach, J. P., Hol, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+RNA%3A+a+first+example+of+molecular+misreading+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Mutations in RNA: a first example of molecular misreading in Alzheimer's disease.</a> Trends in Neurosciences. 21, 331-335 (1998).</li>
<li>van Leeuwen, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frameshift+mutants+of+beta+amyloid+precursor+protein+and+ubiquitin-B+in+Alzheimer%27s+and+Down+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Frameshift mutants of beta amyloid precursor protein and ubiquitin-B in Alzheimer's and Down patients.</a> Science. 279, 242-247 (1998).</li>
<li>Morreall, J. F., Petrova, L., Doetsch, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+mutagenesis+and+its+potential+roles+in+the+etiology+of+cancer+and+bacterial+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Transcriptional mutagenesis and its potential roles in the etiology of cancer and bacterial antibiotic resistance.</a> Journal of Cellular Physiology. 228, 2257-2261 (2013).</li>
<li>Strathern, J. N., Jin, D. J., Court, D. L., Kashlev, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+transcription+fidelity+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of transcription fidelity mutants.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1819, 694-699 (2012).</li>
<li>Acevedo, A., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Library+preparation+for+highly+accurate+population+sequencing+of+RNA+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Library preparation for highly accurate population sequencing of RNA viruses.</a> Nature Protocols. 9, 1760-1769 (2014).</li>
<li>Traverse, C. C., Ochman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Spectra+of+Transcription+Insertions+and+Deletions+Reveal+That+Slippage+Depends+on+RNA%3ADNA+Hybrid+Complementarity%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Spectra of Transcription Insertions and Deletions Reveal That Slippage Depends on RNA:DNA Hybrid Complementarity.</a> mBio. 8, (2017).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://journal.embnet.org/index.php/embnetjournal/article/view/200">Cutadapt Removes Adapter Sequences From High-Throughput Sequencing Reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li>
<li>Kent, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLAT--the+BLAST-like+alignment+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">BLAT--the BLAST-like alignment tool.</a> Genome Research. 12, 656-664 (2002).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TopHat2%3A+accurate+alignment+of+transcriptomes+in+the+presence+of+insertions%2C+deletions+and+gene+fusions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions.</a> Genome Biology. 14, R36(2013).</li>
<li>Zhou, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+RNA+polymerase+rpoB+mutations+that+alter+transcription+slippage+during+elongation+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of RNA polymerase rpoB mutations that alter transcription slippage during elongation in Escherichia coli.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288, 2700-2710 (2013).</li>
<li>Reid-Bayliss, K. S., Loeb, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+RNA+consensus+sequencing+for+high-fidelity+detection+of+transcriptional+mutagenesis-induced+epimutations%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Accurate RNA consensus sequencing for high-fidelity detection of transcriptional mutagenesis-induced epimutations.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 114, 9415-9420 (2017).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

ここでは、酵母、ショウジョウバエ、線虫で転写エラーの検出のための C seq ライブラリの準備のための最適化されたプロトコルについて述べる。このプロトコルには、代替技術と同様に、既存のプロトコルでは、多くの利点があります。
過去 15 年間、レポーターの多数のシステム開発されているルシフェラーゼ7,8や Cre Lox 組換え3,4,15,21転写を検出するために依存します。エラー。これらのレポーター システムは、彼らは遺伝子、対立遺伝子、および識別する直接転写の忠実度を調節する分子機構を許可ため転写の忠実度の者を理解する貴重なされています。しかし、彼らのレポ...

ゲノムは生命の正確な生物の設計図を提供します。この青写真を正しく実装するには、素晴らしい精度で転写されるゲノムのために重要です。ただし、転写は、エラーが発生する可能性がありますはありません。たとえば、RNA ポリメラーゼがエラーを起こしやすい体外1、2、長い知られている、最近エラー体内だけでなく、3、5,6、犯すことが示されました。特に、DNA 損傷7,8,9,10に直面しています。一緒に取られて、これらの観察は、転写エラー発生する継続的にすべての生きた細胞でタンパク質構造変異の強力なソース可能性があることを示唆していることを示します。
転写変異と呼ばれるこのプロセスは、2 つの方法で古典的な変異によって異なります。最初に、彼らは DNA の複製に依存しない、遺伝子の突然変異とは対照的転写エラーは分裂期と分裂後の細胞を影響します。転写の忠実度に影響を与えるメカニズムを勉強して、したがって、分裂、分裂後の細胞の突然変異荷重に対して貴重な洞察を提供します。興味深いことに、転写エラーが最近タンパク質凝集11,12,13のプロモーションに関与しているし、10両の発癌に寄与するように仮定されたが、細菌14の抗生の抵抗の開発。
第二に、遺伝子の突然変異と対照をなして転写エラー、自然で一時的です。転写エラーを検出するため極めて困難になりますので、彼らの一時的な存在は特に挑戦的です。たとえば、いくつかのラボは、転写の突然変異誘発の研究のための貴重な記者アッセイを考案した、一方これらの試、コンテキストとモデル生物4,15の限られた数の転写エラーを測定することができるのみ。これらの制限を克服するために多くの研究者は、理論により、任意の種のトランスクリプトームを通して記録される転写エラー RNA 塩基配列決定技術 (RNA シーケンス) になっています。ただし、これらの研究は、逆のトランスクリプション エラー、PCR 増幅エラー シーケンス自体のエラーを起こしやすい性質など、図書館建設の成果物によって簡単に混同されます。たとえば、逆転写酵素約 1 つのエラーすべて 〜 20,000 拠点間コミット RNA ポリメラーゼ (RNAPs) は、1 つだけエラーをすべて 300,000 拠点5,6にすると予想されます。従来の RNA シーケンス データ (ライブラリ準備で起因するアーチファクトと真転写エラーを区別することは事実上不可能じゃないので単独で逆のトランスクリプションの誤り率を小さく細胞内 RNA ポリメラーゼのエラー率、図 1 a)。
この問題を解決するために試金5,16円シーケンス (Cirseq、または今後 C seq) の最適化されたバージョンを行った。このアッセイでは、トランスクリプトーム5で RNA の転写エラー、その他の稀な変形を検出することができます。円形配列アッセイは、この試金の重要なステップは、環状 RNA を中心に展開するためにこの名前を運ぶ。RNA ターゲットが円形、一度彼らは同じ RNA テンプレートの数多くのコピーを含む線形 cDNA 分子を生成する、ローリング サークル ファッションを転写したリバースされます。エラーは、これらのテンプレートの 1 つには、このエラーは cDNA 分子内に含まれるすべての単一の繰り返しで現在もでしょう。対照的に、逆のトランスクリプション、PCR 増幅、またはシーケンスによって導入されたエラーはランダムに発生する傾向がある、こうして繰り返されるがのみ 1 つまたは 2 つがあります。したがって、各 cDNA 分子コンセンサス シーケンスを生成してランダム エラーを区別するすべての繰り返しで発生するエラーで、ライブラリ構築アーティファクト効果的にから分離できる真の転写エラー (図 1 b)。
任意の種のトランスクリプトームで RNA の塩基置換、挿入、および削除の速度を正確に検出 C seq 試金を使用することができます適切に使用する場合 (たとえば、トラバース ・ オフマン17を参照)。たとえば、我々 は単一の基本解像度は、5 と酵母、ショウジョウバエ、線虫で転写の誤り率のゲノム全体の測定値を提供するために C seq 試金を使用しています。(未発表の観察)。最初に正確に RNA ウイルス集団をシーケンスに使用、C seq 試金のこの最適化されたバージョンがライブラリ構築アーティファクトに貢献するライブラリの準備中に過酷な条件を最小限に抑えるために合理化されています。さらに、市販のキットの数を使用して、アッセイのスループットが大幅に向上、その使いやすさだけでなく、適切に使用する場合、この試金は正確にあたり、大幅改善前の研究6転写エラーの何千もを検出できます。全体的にみて、このメソッドは転写変異を研究する強力なツールを提供、幅広い生物の転写の忠実度を制御するメカニズムに新しい洞察力を得るためにユーザーになります。

<table><tbody><tr><td>RiboPure RNA精製キット</td><td>ThermoFisher</td><td>AM1926</td><td>Total RNA精製</td></tr><tr><td>Genelute mRNA精製キット</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MRN70-1KT</td><td>mRNA精製</td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー ウォーター</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td>溶出・希釈</td></tr><tr><td>Ambion RNase III</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2290</td><td>RNAフラグメンテーション</td></tr><tr><td>T4 RNAリガーゼ1 (ssRNALigase)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0204S</td><td>RNA環状化</td></tr><tr><td>Ribolock</td><td>ThermoFisher</td><td>EO0381</td><td>RNase inhibitor</td></tr><tr><td>SuperScript III Reverse Transcriptase</td><td>ThermoFisher</td><td>18080044</td><td>Rolling circle reverse transcription</td></tr><tr><td>10 mM dNTP mix</td><td>ThermoFisher</td><td>18427013</td><td>Rolling circle reverse transcription</td></tr><tr><td>ランダムヘキサマー (50 ng/&micro;L)</td><td>ThermoFisher</td><td>N8080127</td><td>Rolling circle reverse transcription</td></tr><tr><td>NEB Second Strand Synthesis Module</td><td>New England Biolabs</td><td>E6111S</td><td>Second Strand Synthesis</td></tr><tr><td>NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina</td><td>New England Biolabs</td><td>E7370S</td><td>cDNA Library preparation</td></tr><tr><td>NEB Next index primers</td><td>NEB</td><td>E7335S</td><td>Multiplex PCR primers</td></tr><tr><td>オリゴクリーン&濃縮器</td><td>Zymo Research</td><td>D4061</td><td>RNAおよびDNAサンプルのクリーンアップ</td></tr><tr><td>DynaMag-2 マグネット</td><td>ThermoFisher</td><td>12321D</td><td>磁気ビーズ精製</td></tr><tr><td>AMPure XP ビーズ</td><td>ベックマン・コールター</td><td>A63881</td><td>磁気ビーズ精製</td></tr><tr><td>Eppendorf 5424 微量遠心分離機</td><td>FisherScientific</td><td>05-403-93</td><td>遠心分離</td></tr>機 <tr><td>INCU-Shaker 10 L</td><td>ベンチマークScientific</td><td>H1010</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>T100 サーマルサイクラー</td><td>BIO RAD</td><td>1861096</td><td>中温から高温のサイクリング条件</td></tr><tr><td>PTC-200 サーマルサイクラー</td><td>GMI</td><td>8252-30-0001&nbsp;</td><td>低温サイクル条件</td></tr><tr><td>RNase Away</td><td>Molecular Bioproducts</td><td>700S-11</td><td>滅菌</td></tr><tr><td>50 mL 遠心チューブ</td><td>Corning</td><td>430290</td><td>ヌクレアーゼフリー</td></tr><tr><td>15 mL 遠心チューブ</td><td>Corning</td><td>430052</td><td>ヌクレアーゼフリー</td></tr><tr><td>エッペンドルフチューブ</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td>ヌクレアーゼフリー</td></tr><tr><td>4200 タペステーションシステム</td><td>Agilent</td><td>G2991AA</td><td>RNAおよび一本鎖DNAサンプルの品質管理のためのヌクレオチド分析装置</td></tr><tr><td>高感度RNAスクリーンテープ</td><td>Agilent</td><td>5067-5579</td><td>RNAおよび一本鎖DNAサンプルの品質管理</td></tr><tr><td>RNAスクリーンテープサンプルバッファー</td><td>Agilent</td><td>5067-5577</td><td>RNAおよび一本鎖DNAサンプルの品質管理</td></tr><tr><td>RNAスクリーンテープラダー</td><td>Agilent</td><td>5067-5578</td><td>RNAおよび一本鎖DNAサンプルの品質管理</td></tr><tr><td>2100 バイオアナライザー機器</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td>二本鎖DNAの品質管理</td></tr><tr><td>高感度DNAキット</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td>二本鎖cDNAサンプルの品質管理</td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>VWR</td><td>462-0244</td><td>インキュベーション</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000/2000C 分光光度計</td><td>サーモフィッシャー</td><td>ND-2000C</td><td>RNA濃度の測定</td></tr></tbody></table>

真核生物の転写エラーのゲノム全体の監視

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

正確な表記は、遺伝情報の忠実な表現に必要です。しかし意外にも、少しは転写の忠実度を制御するメカニズムについて知られています。科学の知識で、このギャップを埋めるためには、我々 は最近線虫、ショウジョウバエ、酵母のトランスクリプトームを通して転写エラーを検出するサークル シーケンス分析を最適化線虫。このプロトコルは、前例のない詳細の転写の忠実度を制御するメカニズムを解明することができますので、真核細胞での転写エラーの風景にマップする強力な新しいツールを使って研究を提供します。

大量並列シーケンスのアプローチのすべてのような各 C seq 実験は扱いにくく、大規模なデータセットを生成します。初めてユーザーのためそれはこれらのデータセットを処理することは困難することができます。したがって、実験前に経験豊富なバイオ informatician をすべてのユーザーに連絡をお勧めします。平均では、期待は、ユーザーあたりのほとんどの大量並列シーケンスのプラットフォームの実行 55-70 ギガ基地 (Gbases) 約生成することです。通常、このプロトコルのため、各サンプルの約 2-6 Gbases に買収されたので、あたりの実行 12-30 サンプルされた多重化されます。アダプター シーケンス、低品質基本電話 (&lt; 20) このデータセットからトリミング後の初期データ サイズ 〜 70% に残った。
生成された繰り返しのサイズを決定することにより RNA の断片化と環状の効率を調査するため、これらの基地はさらに分析しています。長さ...

このプロトコルは、複数のモデル生物における転写の忠実度を監視する新しいツールと研究者を提供します。

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

この方法は、どのRNAポリメラーゼサブユニットまたは生物学的プロセスが転写の忠実度を制御するかなど、転写突然変異誘発の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、真核生物のトランスクリプトームにおける内因性転写エラーの測定を可能にすることです。一般に、このプロトコルに不慣れな個人は、アッセイの長さと複雑さ、およびデータを解釈するための高度なバイオインフォマティクスの必要性のために苦労します。プロトコールを開始するには、以前に調製したサンプルの20マイクロリットルを摂氏65度で1分間加熱変性することにより、RNAフラグメントを環状化します。1分後、すぐにサンプルを氷の上に2分間置きます。次に、4マイクロリットルの10x T4 RNAリガーゼバッファー、4マイクロリットルの10ミリモルATP、1マイクロリットルのRNase阻害剤、1マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水、および8マイクロリットルの50%ポリエチレングリコール(PEG)を追加します。次に、ボルテックスによってサンプルを完全に混合します。次に、T4 RNAリガーゼ1のマイクロリットルあたり10ユニットの2マイクロリットルを追加します。ピペッティングでサンプルを再度混合し、蓋の温度を摂氏30度に設定したサーモサイクラーで摂氏25度で2時間インキュベートします。2時間のインキュベーション後、10マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水をサンプルに加え、オリゴクリーンアップおよび濃縮キットでサンプルを洗浄します。サンプルを20マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水で溶出します。環状RNA分子を逆転写するには、4マイクロリットルの10ミリモルdNTP、4マイクロリットル/マイクロリットルのランダムヘキサマー50ナノグラム、および9マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を9マイクロリットルのRNAに加えます。ピペッティングで十分に混合し、サンプルを摂氏65度で1分間変性させます。サンプルを変性させた後、氷上に2分間置きます。8マイクロリットルの5xファーストストランド合成バッファー、2マイクロリットルの0.1ミリモルDTT、および4マイクロリットル/マイクロリットル/マイクロリットルの逆転写酵素をサンプルに加え、ピペッティングで混合します。サンプルを摂氏25度で10分間インキュベートし、蓋をインキュベーション温度より摂氏5度高く設定します。次に、蓋を摂氏47度にセットした状態で、サンプルを摂氏42度で20分間インキュベートします。クリーンアップおよび濃縮器キットでクリーンアップした後、42マイクロリットルの溶出溶液でサンプルを溶出します。2本鎖合成キットを使用して、二本鎖cDNAライブラリーを作製します。サンプルを氷の上に置き、サンプルの38マイクロリットルに30マイクロリットルのNF水を追加します。次に、8マイクロリットルの10xセカンドストランドバッファーと4マイクロリットルのセカンドストランド酵素を加え、穏やかなピペッティングでサンプルを混合してから、摂氏16度で2時間半インキュベートします。100マイクロリットルの反応用のオリゴクリーンアップおよび濃縮キットでサンプルをクリーンアップし、38マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水でサンプルを溶出します。ピペッティングで末端修復反応を混合し、摂氏20度で30分間インキュベートします。摂氏20度のインキュベーションに続いて、摂氏65度で30分間のインキュベーションを行います。まず、次世代シーケンシング用アダプターを10ミリモルトリスHClで10倍に希釈し、最終濃度を1.5マイクロモルにします。次に、2.5マイクロリットルの希釈アダプターと1マイクロリットルのライゲーションエンハンサーを各サンプルに加え、ボルテックスして混合します。次に、15マイクロリットルの鈍いTAリガーゼマスターミックスを追加します。サンプルを上下にピペットで動かして混合し、摂氏20度で15分間インキュベートします。次に、3マイクロリットルのウラシル特異的切除試薬酵素を加え、サンプルを摂氏37度で15分間インキュベートします。ライゲーションが完了したら、13.5マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水をサンプルに加えて総容量100マイクロリットルにし、サイズ選択に進みます。磁気ビーズを室温に順応させます。30マイクロリットルの順応し、再懸濁した磁気ビーズを各サンプルに加え、ピペッティングで混合します。サンプルを1.5ミリリットルのチューブに移し、室温で5分間インキュベートします。サンプルを磁気スタンドに5分間置き、ビーズを上清から分離します。上清を新しい1.5ミリリットルのチューブに移し、磁気ビーズを廃棄します。各サンプルに15マイクロリットルの磁気ビーズの新鮮なアリコートを追加します。ピペッティングで十分に混合し、室温で5分間インキュベートします。サンプルを磁気ラックに置き、室温で5分間インキュベートします。次に、ビーズを乱さないように注意しながら、上澄み物を慎重に取り除いて廃棄します。ペレット化された磁気ビーズを乱さずに、各サンプルに200マイクロリットルの80%新たに調製したエタノールを加え、30秒間インキュベートします。次に、サンプルから微量のエタノールを完全に取り除き、ビーズを5分間風乾しますが、ビーズを過度に乾燥させないように注意してください。ビーズからサンプルを溶出するには、チューブを磁気スタンドから取り外します。19マイクロリットルの10ミリモルトリスHClを加え、混合物を複数回上下にピペットで動かしてビーズを再懸濁し、サンプルを室温で5分間インキュベートします。サンプルを磁気スタンドに戻し、5分間インキュベートしてビーズを上清から分離します。精製されたサイズ選択型cDNAライブラリーを含む上清15マイクロリットルをチューブから慎重に取り出し、新しい1.5ミリリットルのチューブに移します。精製した各cDNAライブラリーに5マイクロリットルのユニバーサルプライマーと5マイクロリットルのユニークインデックスプライマーを加え、ピペッティングで十分に混合します。ポリメラーゼマスターミックスに結晶やその他の沈殿物がないか注意深く確認し、沈殿物が溶解するまで手でマスターミックスを温めます。25マイクロリットルのポリメラーゼマスターミックスをサンプルに加えます。ピペッティングでサンプルを混合し、PCR増幅の添付のテキストプロトコールに記載されているサイクリング条件に従ってください。45マイクロリットルの再懸濁磁気ビーズをPCR反応に直接加えて、最終的なライブラリをクリーンアップします。ピペッティングで混合し、室温で5分間インキュベートします。サンプルを1.5ミリリットルのチューブに移し、磁気スタンドに5分間置きます。インキュベーション後、上清を捨て、新たに調製した80%エタノールで30秒間2回洗浄します。2回目の洗浄後、サンプルからエタノールを完全に除去し、ビーズペレットを5分間風乾します。次に、35マイクロリットルの0.1x TEで溶出します。ビーズをピペッティングして再懸濁し、室温で5分間インキュベートします。チューブを磁気スタンドに5分間置いた後、上清30マイクロリットルを新しい1.5ミリリットルのチューブに移します。図書館はマイナス80°Cで保管してください。RNAの単離後、電気泳動図上に2つの異なるrRNAピークが見えます。RNAの断片化により、50〜70塩基対のRNAフラグメントが生成されます。ローリングサークル逆転写法を用いて、環状RNAテンプレートの少なくとも3つのタンデムリピートからなるcDNA分子を作製しました。磁気ビーズによるサイズ選択により、適切なサイズのライブラリを精製できます。単一のC-seqライブラリーのシーケンシング情報によると、ほとんどのリピートの長さは45〜80塩基である傾向があります。シーケンシングされた塩基の約50%は、これらのリピートの一部です。これらの塩基のほとんどは、3 つ以上の繰り返しを含むレートで存在するため、配列決定される一意の塩基の数は、配列決定された塩基の総数の約 3 分の 1 になります。一度習得すれば、このテクニックは適切に実行されれば2〜3日で完了します。この手順を試みるときは、作業に支障をきたす可能性のあるRNAsのない無菌の作業環境を常に維持することが重要です。また、手順中に間違いを犯さないように、各手順を注意深く実行することも重要です。このビデオを見れば、C-seqアッセイを使用して真核生物の転写エラーを測定する方法について十分に理解できるはずです。

genome-wide-surveillance-transcription-errors-eukaryotic

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

転写因子(TF)DNA結合に影響を与える非コード遺伝的変異を特定するための戦略的な計画とプロトコルを提示します。遺伝子型依存性TF...

機能電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）を用いた非コーディング遺伝的変異体およびDNA親和性沈殿アッセイ（DAPA）のスクリーニング

ここでは、タンパク質-DNA相互作用の近塩基対分解能を達成するためのプロトコルを提示します。これは、クロマチン免疫沈降(ChIP-exo)によって選択的に濃縮されたDNA断片のエキソヌクレアーゼ処理と、それに続くハイスループットシーケンシングによって得られます。...

ChIP-エキソ方法：近く塩基対の精度でタンパク質 -  DNA相互作用を同定します

出芽酵母における鎖特異的転写ランオン(TRO)アプローチによるBrUTPを用いたin...

BrUTP本鎖特異的転写ランオン（TRO）のアプローチを使用した転写の終結の分析

ミクロコッカスヌクレアーゼ（MNase）融合タンパク質でゲノムワイドのタンパク質結合部位をマッピングするためのクロマチン免疫沈降（ChIP） - 直交方法であるハイスループット配列決定（ChEC-seq）と結合したクロマチン内在性切断について記載する。...

ChEC-seqとのタンパク質 - DNA相互作用のゲノムワイドマッピング<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

このプロトコルは、チップ seq、4sU seq、総 RNA シーケンス、およびリボソームが細胞および細胞のためプロファイリングの組合せの使用を説明します。転写因子のバインド、 de novo転写、RNA...

転写因子の結合、細胞活性中に事象を表示する転写、翻訳、回転率のリアルタイム解析

組立 Cas9 を利用した複雑なリボ核タンパク質 (RNP)...

強化されたゲノム細胞や生物の多様な Cas9 リボ核蛋白質と編集

次世代シーケンス (NGS)、プラットフォーム (~0.5–2.0%) の高い誤り率によって制限されるゲノム解析の強力なツールです。NGS のエラーレートを未然に防ぐし、バリアント アレル分 0.0001 のようにまれに突然変異を検出するエラー修正のシーケンスの我々...

エラー修正 DNA ・ RNA シーケンスを用いた珍しいイベント検出

私たちは、ネイティブのγH2A.Xクロマチン免疫沈降(ChIP)を通じて、一般的な脆弱部位のブレークを検出するための迅速かつ効率的な方法を提示します。このアプローチにより、従来のγH2A.X...

ネイティブγH2Aによる一般的な脆弱サイトブレークのキャプチャ。X ChIPの

挿入突然変異誘発は、機能的なゲノム要素を特定するための前方遺伝学において不可欠なツールです。ここでは、レンチウイルスベースの挿入突然変異誘発細胞ライブラリー内のレンチウイルス統合部位を検出する方法であるInSET(Insertion-based Screen for functional Elements and...

挿入型突然変異誘発細胞ライブラリーにおける機能関連レンチウイルス組み込み部位の同定

この原稿では、細菌の転写を標的とする抗菌剤の転写と阻害活性を機能的に調べるためのプロトコールについて記載します。...

in vitro転写アッセイおよび創薬への応用

学ぶC-seqアッセイによる真核生物の転写エラー測定法。RNAサークル化とローリングサークル逆転写を用いて、転写忠実性と転写変異誘発をゲノム規模で解析する革新的バイオインフォマティクス手法です。

真核生物の転写エラーのゲノム全体の監視

さらに動画を探す