真核生物の転写エラーのゲノム全体の監視

この方法は、どのRNAポリメラーゼサブユニットまたは生物学的プロセスが転写の忠実度を制御するかなど、転写突然変異誘発の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、真核生物のトランスクリプトームにおける内因性転写エラーの測定を可能にすることです。一般に、このプロトコルに不慣れな個人は、アッセイの長さと複雑さ、およびデータを解釈するための高度なバイオインフォマティクスの必要性のために苦労します。

プロトコールを開始するには、以前に調製したサンプルの20マイクロリットルを摂氏65度で1分間加熱変性することにより、RNAフラグメントを環状化します。1分後、すぐにサンプルを氷の上に2分間置きます。次に、4マイクロリットルの10x T4 RNAリガーゼバッファー、4マイクロリットルの10ミリモルATP、1マイクロリットルのRNase阻害剤、1マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水、および8マイクロリットルの50%ポリエチレングリコール(PEG)を追加します。

次に、ボルテックスによってサンプルを完全に混合します。次に、T4 RNAリガーゼ1のマイクロリットルあたり10ユニットの2マイクロリットルを追加します。ピペッティングでサンプルを再度混合し、蓋の温度を摂氏30度に設定したサーモサイクラーで摂氏25度で2時間インキュベートします。

2時間のインキュベーション後、10マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水をサンプルに加え、オリゴクリーンアップおよび濃縮キットでサンプルを洗浄します。サンプルを20マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水で溶出します。環状RNA分子を逆転写するには、4マイクロリットルの10ミリモルdNTP、4マイクロリットル/マイクロリットルのランダムヘキサマー50ナノグラム、および9マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を9マイクロリットルのRNAに加えます。

ピペッティングで十分に混合し、サンプルを摂氏65度で1分間変性させます。サンプルを変性させた後、氷上に2分間置きます。8マイクロリットルの5xファーストストランド合成バッファー、2マイクロリットルの0.1ミリモルDTT、および4マイクロリットル/マイクロリットル/マイクロリットルの逆転写酵素をサンプルに加え、ピペッティングで混合します。

サンプルを摂氏25度で10分間インキュベートし、蓋をインキュベーション温度より摂氏5度高く設定します。次に、蓋を摂氏47度にセットした状態で、サンプルを摂氏42度で20分間インキュベートします。クリーンアップおよび濃縮器キットでクリーンアップした後、42マイクロリットルの溶出溶液でサンプルを溶出します。

2本鎖合成キットを使用して、二本鎖cDNAライブラリーを作製します。サンプルを氷の上に置き、サンプルの38マイクロリットルに30マイクロリットルのNF水を追加します。次に、8マイクロリットルの10xセカンドストランドバッファーと4マイクロリットルのセカンドストランド酵素を加え、穏やかなピペッティングでサンプルを混合してから、摂氏16度で2時間半インキュベートします。

100マイクロリットルの反応用のオリゴクリーンアップおよび濃縮キットでサンプルをクリーンアップし、38マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水でサンプルを溶出します。ピペッティングで末端修復反応を混合し、摂氏20度で30分間インキュベートします。摂氏20度のインキュベーションに続いて、摂氏65度で30分間のインキュベーションを行います。

まず、次世代シーケンシング用アダプターを10ミリモルトリスHClで10倍に希釈し、最終濃度を1.5マイクロモルにします。次に、2.5マイクロリットルの希釈アダプターと1マイクロリットルのライゲーションエンハンサーを各サンプルに加え、ボルテックスして混合します。次に、15マイクロリットルの鈍いTAリガーゼマスターミックスを追加します。

サンプルを上下にピペットで動かして混合し、摂氏20度で15分間インキュベートします。次に、3マイクロリットルのウラシル特異的切除試薬酵素を加え、サンプルを摂氏37度で15分間インキュベートします。ライゲーションが完了したら、13.5マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水をサンプルに加えて総容量100マイクロリットルにし、サイズ選択に進みます。

磁気ビーズを室温に順応させます。30マイクロリットルの順応し、再懸濁した磁気ビーズを各サンプルに加え、ピペッティングで混合します。サンプルを1.5ミリリットルのチューブに移し、室温で5分間インキュベートします。

サンプルを磁気スタンドに5分間置き、ビーズを上清から分離します。上清を新しい1.5ミリリットルのチューブに移し、磁気ビーズを廃棄します。各サンプルに15マイクロリットルの磁気ビーズの新鮮なアリコートを追加します。

ピペッティングで十分に混合し、室温で5分間インキュベートします。サンプルを磁気ラックに置き、室温で5分間インキュベートします。次に、ビーズを乱さないように注意しながら、上澄み物を慎重に取り除いて廃棄します。

ペレット化された磁気ビーズを乱さずに、各サンプルに200マイクロリットルの80%新たに調製したエタノールを加え、30秒間インキュベートします。次に、サンプルから微量のエタノールを完全に取り除き、ビーズを5分間風乾しますが、ビーズを過度に乾燥させないように注意してください。ビーズからサンプルを溶出するには、チューブを磁気スタンドから取り外します。

19マイクロリットルの10ミリモルトリスHClを加え、混合物を複数回上下にピペットで動かしてビーズを再懸濁し、サンプルを室温で5分間インキュベートします。サンプルを磁気スタンドに戻し、5分間インキュベートしてビーズを上清から分離します。

精製されたサイズ選択型cDNAライブラリーを含む上清15マイクロリットルをチューブから慎重に取り出し、新しい1.5ミリリットルのチューブに移します。精製した各cDNAライブラリーに5マイクロリットルのユニバーサルプライマーと5マイクロリットルのユニークインデックスプライマーを加え、ピペッティングで十分に混合します。ポリメラーゼマスターミックスに結晶やその他の沈殿物がないか注意深く確認し、沈殿物が溶解するまで手でマスターミックスを温めます。

25マイクロリットルのポリメラーゼマスターミックスをサンプルに加えます。ピペッティングでサンプルを混合し、PCR増幅の添付のテキストプロトコールに記載されているサイクリング条件に従ってください。45マイクロリットルの再懸濁磁気ビーズをPCR反応に直接加えて、最終的なライブラリをクリーンアップします。

ピペッティングで混合し、室温で5分間インキュベートします。サンプルを1.5ミリリットルのチューブに移し、磁気スタンドに5分間置きます。インキュベーション後、上清を捨て、新たに調製した80%エタノールで30秒間2回洗浄します。

2回目の洗浄後、サンプルからエタノールを完全に除去し、ビーズペレットを5分間風乾します。次に、35マイクロリットルの0.1x TEで溶出します。ビーズをピペッティングして再懸濁し、室温で5分間インキュベートします。チューブを磁気スタンドに5分間置いた後、上清30マイクロリットルを新しい1.5ミリリットルのチューブに移します。

図書館はマイナス80°Cで保管してください。RNAの単離後、電気泳動図上に2つの異なるrRNAピークが見えます。RNAの断片化により、50〜70塩基対のRNAフラグメントが生成されます。

ローリングサークル逆転写法を用いて、環状RNAテンプレートの少なくとも3つのタンデムリピートからなるcDNA分子を作製しました。磁気ビーズによるサイズ選択により、適切なサイズのライブラリを精製できます。単一のC-seqライブラリーのシーケンシング情報によると、ほとんどのリピートの長さは45〜80塩基である傾向があります。

シーケンシングされた塩基の約50%は、これらのリピートの一部です。これらの塩基のほとんどは、3 つ以上の繰り返しを含むレートで存在するため、配列決定される一意の塩基の数は、配列決定された塩基の総数の約 3 分の 1 になります。一度習得すれば、このテクニックは適切に実行されれば2〜3日で完了します。

この手順を試みるときは、作業に支障をきたす可能性のあるRNAsのない無菌の作業環境を常に維持することが重要です。また、手順中に間違いを犯さないように、各手順を注意深く実行することも重要です。このビデオを見れば、C-seqアッセイを使用して真核生物の転写エラーを測定する方法について十分に理解できるはずです。