Name: マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量顕微鏡を用いたひと脳のアミロイド β の堆積物の可視化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: 学ぶ MALDI-IMSを用いたヒト脳組織中のアミロイドβタンパク質の可視化プロトコル。ギ酸前処理によりイオン化効率を向上させ、アルツハイマー病の病理学的分布を高解像度で解析する革新的な手法を解説します。

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この作品は文部省科学領域研究の部分で支えられました (脳タンパク質老化と認知症コントロール 26117004; インホーフと T.M.)。この研究は、部分的にサポート研究戦略推進プログラム日本代理店から脳科学医学研究と開発 (アメッド)。到着ガイドラインに準拠してすべての実験を行った。

ここでは、組織採取した日本の高齢者人口に地域密着型の医療サービスを提供する東京都老人医療センターで。研究で使用される脳解剖サンプルは故人の親戚のインフォームド コンセントとブレイン バンクに高齢化研究 (BBAR) 登録されました。BBAR は、東京都老人医療センターと老人総合研究所の倫理委員会によって承認されています。ブレイン バンクに登録されているすべての頭脳のため医学研究のための彼らの使用のための書面によるインフォームド同意を患者またはその家族から得られます。患者は、脳の死後変化を減らすために死の後 2 時間以内の風邪 (4 ° C) 部屋に置かれました。ここで説明したすべてのメソッドは、加齢医学研究、東京都老人医療センターと老人総合研究所同志社大学とブレイン バンクによって承認されています。
1 IMS のティッシュ セクションの準備
<ol><li>剖検脳組織標本の処理 注: は、IMS のサンプル準備の手順が、組織の元の状態を維持することを確認します。汚染と事後の変更を避けます。次のステップは重要です。<ol>
<li>削除、処理、および死後 8 時間以内-80 ° C で保存された脳から IMS の人間の皮質の標本を入手します。アトピーと年齢をマッチさせたコントロール21の後頭葉の皮質からの脳標本を取る。</li>
	</ol></li>
	<li>凍結するティッシュ セクションの準備
	<ol>
<li>クライオスタットに切片をカットします。クライオスタット21内の導電性の ito の顕微鏡用スライド グラスを置きます。</li>
		<li>-80 ° C から剖検脳標本をクリオスタット内-22 ° C に暖かい。</li>
		<li>すべての実験用クライオスタットに新しい替刃を取り付けます。常にブレードのきれいな部分を使用してください。</li>
		<li>10 月化合物の少量と一緒にステージで凍結剖検脳を置く (ステージの中央の領域をカバーする十分な材料の表を参照してください)。</li>
		<li>薄切片法のための条件を選択します。IMS、人間の脳のセクション 10-12 μ m の厚さを使用します。IMS は、IHC 各組織サンプルから 5 ~ 6 セクションをカットします。</li>
		<li>ブレードは、組織をカットし始めて、組織のすべてが公開されるまで、ホイールとブロックの「顔」が有効します。セクションを渡って小さな連勝または涙がある場合は、待ってもう少しクリオスタットで温度調整は自動的にそれを修正するまで。下にある組織と反のロールを開く前に、いくつか秒をカウントします。</li>
		<li>すぐにスライド ガラスの ito 側組織のスライスを配置します。伊藤の上塗を施してあるスライドの下に指を置くことによって組織スライスを解凍します。組織は、スライド領域に固執するだろう組織がないとしわをできるだけ平らを確認します。この手順では、室温で。 注: は人間のサンプルは、生物学的汚染物質を含むかもしれないので研究室ガウン、マスク、手袋を着用します。すべてのセクションは日のためになされた、クライオスタット、ブラシ、および研究室のおしりふきと 100% エタノール 200 mL のチャックをクリーンアップします。</li>
	</ol></li>
	<li>ティッシュ セクションを洗浄
	<ol>
<li>70% のエタノールの 30 の 40-100 mL のサンプルを浸す内因性脂質と無機塩を削除する s。染色瓶ガラスを使用します。</li>
		<li>30 の 100% エタノールの 40-100 mL のサンプルを洗う s、100% のエタノール 30 の 40-100 mL 3 分のカルノワのソリューションの 40-100 mL s、0.1% トリフルオロ酢酸 (TFA) 1 分の 40-100 mL、100% のエタノール 30 s. 使用ガラスの 40-100 mLjar を染色します。 注: カルノワのソリューションは 6 パーツ エタノール、酢酸を 3 つの部分、一部クロロホルムから成る定着剤です。</li>
		<li>30 分間、真空乾燥。</li>
	</ol></li>
	<li>剖検脳組織から a β タンパク質のイオン化がギ酸の蒸気とティッシュ セクションの治療
	<ol>
<li>100% ギ酸の 5 mL の後続の気化に使用されるオーブン、インキュベーションのガラス スライドを準備します。十分な酸治療を達成するため、このステップ全体を通じて飽和レベルで培養ガラス皿で空気湿度を保つし、60 ° C の温度を保つためにギ酸の水没を回避しながら培養ガラス皿に組織スライドを配置し、6 分間治療します。</li>
		<li>フィルムスキャナー、ゲルのスキャナーを使用してサンプルの光学像を取るまたはデジタル顕微鏡等は、室温でこの手順を実行します。サンプル ターゲット装置内に置くと、サンプルの光学イメージの配置が必要です。通常、マトリックス レイヤーの下にティッシュ セクションを認識できないでしょう。 注:光の画像を撮影する最も便利な方法は、オフィス スキャナーを使用することです。イメージングのデータ ストレージ フォルダーに画像を保存することをお勧めします。</li>
		<li>光学センサー画像をサンプルに関連付けるするには、光学画像とカメラ光のマトリックス レイヤーの下に表示されますガイド マークを確認します。最も簡単な方法は、サンプルのまわりのスポットの少なくとも 3 つの補正流体マーク、光の画像を撮影する前に</li>
	</ol></li>
	<li>マトリックス アプリケーション
	<ol>
<li>
マトリックス溶液の調製
		<ol>
<li>0.1% と 50% アセトニ トリル (ACN) SA ソリューションの準備 10 mg/mL の有機溶媒耐性のマイクロ チューブ、TFA。徹底的に SA のボルテックスや使用まで 10 分間室温でソリューション ストア簡単な超音波処理によって化合物を溶解します。 注:行列を噴霧するための 3 つのオプションがあります: 自動噴霧器、超音波スプレーやエアブラシを使用して。</li>
		</ol>
</li>
		<li>
マトリックスをエアブラシで噴霧
		<ol>
<li>一定の室温 (20-23 ° C) と湿度 (40%-60%) で操作を実行します。最適な散布を調整するパラメーターには、液滴のサイズ、ミスト、スプレー ノズルとティッシュ セクションと研究室の温度と湿度との間の距離と角度の容量が含まれます。顕微鏡の結果を確認することによってこれらの条件を調整します。 注: 結晶のサイズとマトリックス カバレッジの均一性および analytes の望ましくない移行・拡散の制限要因としては、小さい方が良いドロップ サイズ。均一性、検査のポイントです。</li>
		</ol>
</li>
		<li>
マトリックスを超音波噴霧器で噴霧
		<ol>
<li>織ってから散布し、商工会議所の組織を削除します。組織はセンサーの窓をカバーしていないことを確認します。</li>
			<li>スタートボタンを押して準備を開始します。通常、準備時間は約 90 分です。準備は、マトリックスの膜厚および湿りの監視を介して自動的に調整されます。準備が完了したら、スライドを削除し、MALDI 装置でそれを読む前に 15 分のデシケーターに保管します。</li>
			<li>2-3 ml の MeOH スプレー ヘッドが表示されるまできれい 100% のスプレーをクリーンアップします。 注: マトリックス水滴の細かい霧重力シートによって組織にシンクする許可されます。20 μ m の平均液滴径が生成されます。未満 50 μ m です。</li>
		</ol>
</li>
		<li>
自動噴霧器でマトリックスを噴霧
		<ol>
<li>マトリックス ソリューションを組織表面に自動噴霧器とスプレーします。温水鞘ガス (n2 ガス、10 psi と 75 ° C に設定) の一定流量は、マトリックス溶液の噴霧と相まって配信されます。(10 psi、0.15 mL/分に設定) 溶剤用ポンプ システムを使用すると、マトリックス ソリューションを提供します。 注: は、最も重要なは、安全マトリックス エアロゾルの吸入を避けるためにキャビネットの下で働きます。部屋の温度と均一なマトリックス結晶化を再現する湿度をコントロールします。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. MALDI IMS
<ol><li>
超高速の質量分析を実行します。
	<ol>
<li>MALDI IMS 10 kHz Nd:YAG 装備で高スループットと高空間分解能イメージング実験を実行 (355 nm) レーザー。</li>
		<li>質量測定、MALDI コントロール ソフトウェアおよびデータ解析ソフトウェアを使用して組織の領域を定義します。</li>
		<li>M/z 2,000-20,000 の質量範囲の肯定的な線形モードのスペクトルと 20 〜 100 μ m の空間分解能を獲得します。</li>
		<li>校正を標準にするために、分解ペプチド校正標準と α-シアノ-4-ヒドロキシ-桂皮酸 (CHCA) TA30 ソリューションで 1:4 の比率の標準タンパク質校正 (ACN:0.1% TFA = 30: 70) しそれを希釈して 10 倍。4 つの異なる場所でスライド標準校正の 1 μ L を配置します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>分子組織学ソフトウェアを使用して (材料の表を参照)、オーバーレイ Sp と動脈壁に colocalizing 別の a β ペプチドなどの様々 な信号の空間的相関を見つける複数の単一イメージ。</li>
</ol>3. データ処理
<ol><li>スペクトルの配置前文書21から選択した m/z リストにすべてのスペクトルを配置します。</li>
	<li>統計解析ソフトウェアに MALDI IMS データ セットをインポート (材料の表を参照) と基線の減算。</li>
	<li>
対象 (ROIs) 組織学的知識に基づいて領域をトレースします。
	<ol>
<li>単変量解析を実行平均強度の標準偏差の m/z 値を結果識別 m/z-マーカー (roc)、仮説検定の発見の発掘します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
分割マップを作成します。
	<ol>
<li>大規模なデータセットと基本的な傾向の抽出のための成分分析の空間分割の教師なしの多変量解析を実行します。</li>
		<li>実質およびクモ膜下腔などの組織学的特徴に基づく解剖学的 Roi を選択します。</li>
		<li>個々 の Roi として構造を割り当て、領域の画像の領域分割を許可関連ペプチドを識別するために処理された MS データを関連付けます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

著者が明らかに何もありません。

広告といくつかの剖検脳から詳しいプロトコルおよび a β とそのアイソ フォームの可視化の結果を示した私たちここや MALDI IMS と CAA。Aβs の蒸着プロファイルは、その N 末端と C 末端のバリエーションに Aβ1 42 から大幅に変更されました。Aβ1 41 が初めて識別し現在のプロトコルと人間の脳の視覚化、IHC21さらに検証されました。IMS によって堆積した a β の形態高分解能解析 (20 μ m) と IHC とよい一致にあることを考えると、IMS と IHC 均等に貢献する場所や蛋白質量, およびその形態によって a β 預金を区別します。後頭皮質のここで示した全体の実験を行ったと今後の実験計画が現在のプロトコルを使用して脳のすべての領域にわたって種 β-アミロイドのローカリゼーションを勉強が一般化するでしょう。
プロトコルの中で重要なステップは、人間の脳組織に集約されたタンパク質の効果的なイオン化を取得する組織の準備手順です。マトリックスの層はレーザー エネルギーを吸収し、脱離と検体のイオン化を誘発する必要があります。このプロセスでは、全体の切片均一小さな結晶でコーティングされています。行列と、試料の均一な cocrystallization は高感度とアーチファクトのない画像の処理にとって重要です。3 スプレー法のそれぞれは、独自の利点があります。手動スプレー コーティングは、最もよく使用される方法の 1 つです。エアブラシは便利です。しかし、巧みな操作が必要です。正確かつ再現性のある実験手法が不可欠であるとは現在のプロトコルで説明超音波噴霧器および/または自動噴霧器を使用することをお勧めします。超音波噴霧器に関してそれに左右されない湿度と部屋の温度の部屋にスプレーため。一方、自動の噴霧器, 再現性の良い空間分解能比較的保存状態が得られます。一般に、分解能は、エアブラシ 1)、2) 自動装置、3) 超音波噴霧器の順で 3 つの方法増加で得られました。
最も重要なは、このプロトコルを検出、剖検脳のサンプルで Aβs を表示する生成されました。人間のアプリのスウェーデン型突然変異に基づく広告の動物モデルとして生成 APP23 マウス MALDI IMS と Aβs の視覚化は、既存法18,19他の人が以前報告されています。しかし、APP23 に適用される元のプロトコルは、横方向の分解能と感度で a β を視覚化するための十分なでした。以前の作品は、組織の境界外の高 a β 濃度はそのプロトコル18,19イメージング APP23 のアーティファクトで、明らかにについて説明します。つまり、いわゆる 'ぼかし' 本当の Sp と IMS との間マトリックス抽出手順のため画像は MALDI 型イメージングと避けられない。しかし、現在のプロトコルのぼかしが消えて、各スペクトルは脳実質内のすべての単一の SP を表されます。
広告で初めて Aβ1 41 をトレースできるようにここと私たち自身の世代21によって特定の抗体と CAA 脳 MALDI IMS、IHC、とともに。一方、γ セクレターゼ段階的な胸の谷間27,28,29,30,31 Aβ1 45 由来 Aβ1 41 の Aβ1 45を介してAβ1-42 から Aβ1 38 a β 処理モデルによると派生します。.これは現在のプロトコルがこのモデルをサポートしていることを意味します。この技法の制限として人体病理剖検脳からサンプルの不均一性を考慮しなければなりません。、ある意味で、最も重要なステップは、倫理的な証拠と修飾の剖検脳組織を調べることです。それらの修飾された剖検脳組織の現在のプロトコルと MALDI IMS は個別にまだ AD の病態を制御する未知の因子と同様、複数の変更を持っている複雑な分子の分布を追跡します。定義されています。さらに、高齢者の脳に様々 な病理の全体的な病態を理解する上では、神経疾患の臨床的、遺伝子および病理組織学的観察との組み合わせでの標準的なアプローチとして MALDI IMS を採用する可能でする必要があります。.
MALDI IMS のもう一つの重要なステップが取得したデータ セットからデータ マイニング プロセスは常に時間がかかるです。各ピークの分布の手動でのデータ マイニングには、すべての画像をクリックして、分析サンプルの形態相関分布を探すユーザーが必要です。自動空間分割は、データ マイニング、データ セットの概要を提供する、顕著な特徴の迅速な検出を許可の最初のステップとして使用できます。このアプローチで与えられた領域のスペクトル間の類似点の決定統計的に、および同じようなスペクトルは、1 つのクラスターにグループ化されます。すべてのピクセルは、クラスターの割り当て (図 5) に従って色分けされます。本広告/CAA 研究に関心のある領域は実質プラークとクモ膜下および実質の血管構造の a β 沈着のスペースをあります。IHC と検証されてさらに 2 つの独特のピークが Aβ1 40 から Aβ1 4221m/z 値。したがって、コードして, m/z Aβ1 40 とはすでにさらなる分析のための不明なペプチドと同様に N と C 末端に注釈付きの切り捨てられた β Aβ1-42 を見つけやすいです。
・ ウェラーと同僚は、動脈静脈21の周りよりも周りより、血管壁に a β が蓄積を報告しています。また、それが間質液 (ISF) が Aβs、リンパ節を介して血管周囲の排水経路22,23,24,25 に脳実質内から排泄を含まれている提案されています。 ,26。20 μ m の解像度で MALDI IMS データ セットに基づいて分割マップを生成する現在のプロトコル サポート広告21 CAA に大幅に貢献する (図 5)、脳の血管周囲の排水経路の存在の可能性,32します。 さらに、各 m/z 値の相関を計算することによってプラークとクモ膜の血管, マーカー蛋白質を見出すことができます。高齢者の脳に様々 な病理の全体的な病態を理解する上でそれは臨床、遺伝、確立された IHC データとの組み合わせで強力なアプローチとして MALDI IMS と神経の病理学的観察を採用可能する必要があります。病気。

診断を下すためと神経変性疾患の病態を理解するには、病理学的堆積物の正確な同定は重要な1です。広告の過程で a β は脳実質内で Sp を円滑にする、血管に沈着病発症2,3,4,5,6の前に長い。Aβ1 42 は AD 脳の SP で優勢なペプチドが、N 末端や C 末端など、他の a β 亜種切り捨てまたは Aβs を修正、影響を受ける広告脳7,8,9で識別されます。 10。全体像、人間の脳の広い範囲の a β 種の特に広告と脳アミロイドアンギオパチー (CAA)11、役立つ a β の生産・代謝・沈着を理解する科学者。
神経病理学の古典的なアプローチとして免疫組織染色 (IHC) は脳組織12,13,14,15Aβs の場所を決定する最も決定的な方法をされています。一般に、複数のエピトープが同時に共存する、IHC は分子を区別できません。対照的に、新興の質量分析を用いたプロテオーム解析、特に様々 な a β 種抗体16,17と区別できないが、脳組織を分析するための貴重なアプローチです。脳 lysates と免疫沈澱サンプルの従来の質量分析を用いた解析マイナーした a β ペプチドの検出に失敗し、脳組織における a β の分布の情報が失われます。
以前の作品でマウスの脳で β 預金を可視化は、APP23 など広告のトランスジェニック動物モデルを使用して成功しました。ただし、このプロセスは、IMS と IHC を分解能と感度の18,19,20に関して比較する技術の進歩を必要があります。人間の脳の神経病理学の広告を検討すべきし、我々 は包括的なタンパク質マッピング21を取得する人体病理剖検脳組織の MALDI IMS 技術を使用します。この目的のため、我々 は速度、感度、再現性で利点がある質量分析の高度なタイプのプロトコルを開発しました。

<table><tbody><tr><td>クライオスタット</td><td>ライカ マイクロシステムズ(ドイツ、ウェッツラー)</td><td>CM1950</td><td></td></tr><tr><td>酸化インジウムスズ(ITO)コーティング顕微鏡 スライド</td><td>ガラス ブルカー ダルトニクス</td><td>#237001</td><td></td></tr><tr><td>ブレード(使い捨て)</td><td>ライカ マイクロシステムズ(ドイツ、ウェッツラー</td><td>)#117394</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. コンパウンド</td><td>ライカマイクロシステムズ(ドイツ、ウェッツラー)</td><td>FSC 22 ブルー</td><td></td></tr><tr><td>スキャナー</td><td>EPSON</td><td>GT-980</td><td></td></tr><tr><td>エアブラシ</td><td>GSI Creos</td><td>PS274</td><td></td></tr><tr><td>コンプレッサー</td><td>MRHOBBY</td><td>Mr.Linear コンプレッサー L5</td><td></td></tr><tr><td>超音波噴霧器</td><td>Bruker Daltonics</td><td>ImagePrep</td><td></td></tr><tr><td>自動噴霧器</td><td>HTX Technologies</td><td>TM 噴霧</td><td></td></tr>器 <tr><td>共焦点レーザー走査顕微鏡</td><td>Carl Zeiss Inc.</td><td>LSM 700</td><td></td></tr><tr><td>超高速MALDI装置</td><td>Bruker Daltonics</td><td>rapifleX MALDI Tissuetyper</td><td></td></tr><tr><td>MALDI 制御ソフトウェア</td><td>Bruker Daltonics</td><td>FlexControl 3.8</td><td></td></tr><tr><td>データ解析ソフトウェア</td><td>Bruker Daltonics</td><td>FlexImaging 5.0</td><td></td></tr><tr><td>Molecular histology software</td><td>SCiLS, Bremen, Germany</td><td>SciLS Lab 2016a</td><td></td></tr><tr><td>統計ソフトウェア</td><td>SCiLS, Bremen, Germany</td><td>SciLS Lab 2016a</td><td></td></tr><tr><td>Sinapinic acid (SA)</td><td>Nacalai tesque</td><td>30494-91</td><td></td></tr><tr><td>Alpha-Cyano-4-hydroxyl-cinamic acid (CHCA)</td><td>Wako</td><td>037-19261</td><td></td></tr><tr><td>Calibration standard</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotinylated anti-mouse IgG antibodies</td><td>Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ビオチン化抗ウサギIgG抗体</td><td>Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Avidin and biotinated HRP complex.</td><td>Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA</td><td>Vectastain Elite ABC kit</td><td></td></tr><tr><td>3,3-diaminobenzidine (DAB)</td><td>Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA</td><td>Vectastain Elite ABC kit</td><td></td></tr></tbody></table>

マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量顕微鏡を用いたひと脳のアミロイド β の堆積物の可視化

Visualization of Amyloid &#946; Deposits in the Human Brain with Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging Mass Spectrometry

アルツハイマー病 (AD) の病理は、蓄積し、脳の細胞外のプラクにアミロイド β (a β) の集計が特徴です。40 のアミノ酸からなる a β ペプチドがアミロイド前駆体タンパク質 (APP) β、γ セクレターゼにより生成されます。A β は、脳実質内のみならず髄膜と脳アミロイドアンギオパチー (CAA) として知られている、脳血管壁に堆積されています。一方、様々 な a β ペプチドが同定された詳細な生産と流通 AD の病理学的組織の個々 の a β ペプチドの CAA 完全に対処されていないと。ここでは、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化に基づくイメージング質量分析法 (MALDI IMS) 包括的なタンパク質マッピングを取得する人体病理剖検脳組織でのプロトコルを開発します。この目的のため人間の皮質の標本は東京都老人研でブレイン バンクから得られました。冷凍凍結切片の切断、インジウム-スズ酸化物 (ITO) に転送-スライド ガラスをコーティングします。スペクトルを用いている MALDI システム空間分解能最大 20 μ m. Sinapinic 酸 (SA) は、自動または手動の噴霧器を使用してスライドに堆積した均一に。MALDI IMS の現在の技術的な利点と特定のプローブなしひと剖検脳の同じセクションの中で様々 な a β の種の典型的なデータ セットを取得できます。さらに、高解像度 (20 μ m) AD 脳の重度の CAA サンプル画像は明らかに Aβ1 42, Aβ1 43 老人斑 (SP) として脳実質内に堆積した中に、Aβ1 41 Aβ1 36 が髄膜血管に堆積したことを示しています。CAA、AD の病態を理解する上で臨床的、遺伝的、及び病理学的所見との組み合わせで標準的なアプローチとして、MALDI IMS を採用することは、現在の戦略に基づいて他の神経疾患。

CAA 散発的なアトピー患者さん (n = 5; 平均年齢 = 83.2 y) 無料 (SP O) や CAA 老人斑と科目を高齢者と (n = 5; 平均年齢 77.2 を = y) された (表 1) を分析しました。患者 #3 の CAA の表現型は本研究で最も顕著であった。Aβ1 40 と Aβ1 42 #3 の患者から脳組織鉱床の分布は、MALDI IMS (図 1) で視覚化しました。死別コントロール脳 (患者 #9、#10) に重要な信号がなかった図 1に示すように。ここでは、MALDI IMS の Aβ1 42 が脳実質内で優先的に Sp として預託された明確に可視化。対照的に、Aβ1-36 1 - 41 などの短い Aβs は髄膜血管領域 (図 1) に優先的に沈殿させた。
Aβ40 と Aβ42 の分布は、隣接する凍結組織切片を用いた IHC とさらに検証されました。抗 Aβ40 抗体は、CAA (図 2 bの矢印)、Sp として脳実質内における Aβ42 の分布に明確な対照にある標識。Aβ1-41、私たちは、人間の脳でこのフラグメントを検出する最初と Aβ41 の Aβ40 andAβ4221を区別することができます特定の抗体を生成しています。
MALDI IMS の空間分解能は一般に改良する最も重要な要因です。図 1と図 2で 100 μ m ピッチ分解能と MALDI IMS を表示し、比較的広いエリア21の全体的な分布を得る。まさに血管構造を含む、くも膜下腔にアミロイド沈着を定義することは困難です。くも膜下の血管の微細組織構造と大脳皮質の表面を描写する高解像度の MALDI イメージング (40 μ m:図 3; 20 μ m:図 4および図 5) を行った。その結果、MALDI IMS は、IHC と対等である、動脈の壁に Aβ1-36 1 - 41 などの短い Aβs、分散を示した。
MALDI IMS Aβx 40 および Aβx-42 の詳細な分布を示した (x = 2、4、5、6、7、8、9、および 11pE) CAA 脳に伴う広告で。たとえば、Aβx 40 種は、Aβ1 40 に似たような分布を示し、一方、Aβx 42 種は Aβ1 4221別の分布パターンを示した。現在のプロトコルによって単一イオン MALDI 分子研で観測された個々 の a β ペプチドのイメージは a β 種に割り当てられます。対照的に、画像データは未定義タンパク質の詳細な分析のための興味の解剖学的領域のセグメンテーションを得るために教師の多変量統計を使用して調査することができますを取得しました。図 5患者 #321からの同じセクションに適用 bisecting k 平均解析で得られた分割マップを示しています。このクラスタ リング手法は、くも膜下腔 (図 5の緑色) 血管プラークのような構造 (図 5の青) の実質の物に正常に識別されます。小細動脈 (図 5の紫) クモ膜下腔だけでなく、実質の周りだけが検出される実質の小さな円形の部分を見つけるは興味深いです。これは、図 5にこれらの個々 の a β ペプチドの単一イオンのイメージによって検証-5 階。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57645/57645fig1.jpg"> 図 1: 冷凍広告/CAA の MALDI IMS 脳セクション。様々 な C 末端切り捨て a β ペプチド重度 CAA (患者 #3) に伴う広告の右側のパネルで左パネルとコントロール (患者 #9 右と左側のすべての画像の患者 #10) で可視化します。Aβ1 41 Aβ1 36 は、Aβ1 42, Aβ1 43 として析出されます脳実質内に老人斑 #3 のコントロール患者の信号がなかった脳 (#9 と #10 の場合) に備えて、髄膜血管に優先的に置かれます。分解能 100 μ m を =。スケール バー = 5 mm。この図は、角田ら21からの許可と変更されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57645/57645fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57645/57645fig2.jpg"> 図 2: 冷凍広告/CAA の MALDI IMS 脳セクションおよび広告の頭脳から後頭皮質の隣接するセクションです。(A ~ C) 凍結広告/CAA 脳切片と AD 脳から後頭皮質の (DとE) の隣接したセクションだった免疫染色し、細動脈と Aβ40 に対する抗体を用いて、脳の実質内に焦点を当てて (d:BA27) または Aβ42 (E: ポリクローナル抗-Aβ42)。両方の分析は、Aβ40 は髄膜血管 (パネルDの矢印) とクモ膜下腔と CAA を形成する脳実質内細動脈に沈着して優先的にことを示した。対照的に、Aβ42 は主に Sp に堆積されています。Ims、解像度 = 100 μ m。スケール バー 5 mm (A B、およびC) を = = 5 mm、500 (D ・ E)。この図は、角田ら21からの許可と変更されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57645/57645fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57645/57645fig3.jpg"> 図 3: 冷凍広告/CAA のモルディブ IMS 脳 40 μ m の解像度で (患者 #3) セクション。各種の C 末端と N 末端切り捨てられ、厳しい CAA (患者 #3) に伴う広告でした a β ペプチドを変更します。Aβ1-36 Aβ1 41 には、老人斑として脳実質内に蒸着 Aβ1 42 と Aβ1 43 間優先的に髄膜血管に置かれます。スケール バー = 1 mm (A ・ B)、2 mm (左上)。分解能 40 μ m を =。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57645/57645fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57645/57645fig4.jpg"> 図 4: 冷凍広告/CAA の MALDI IMS 脳で 20 μ m の解像度のセクション (患者 #3).このパネルには、様々 なの C 末端と N 末端切り捨てられ、厳しい CAA (患者 #3) に伴う広告でした a β ペプチドを変更が表示されます。Aβ1-36 Aβ1 41 には、老人斑として脳実質内に蒸着 Aβ1 42 と Aβ1 43 間優先的に髄膜血管に置かれます。スケール バー = 200 μ m (a、b、c) 1 mm (左上)。解像度 = 20 μ m。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57645/57645fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57645/57645fig5.jpg"> 図 5: 分割地図、広告の脳が凍結部 MALDI IMS で得られると推定される老人斑、大きな容器でくも膜下の構造、および小さい実質細動脈を明らかにします。(A) MALDI IMS データの多変量イメージ解析から得られた分割マップ。(B) Bisecting k-平均クラスタ リングに基づく分析は後頭葉の皮質におけるプラークのような血管のような構造を識別します。クラスターと下部構造との関係が (e.g.,1-0-0) のノードとして表示されます。似た斑 (青), (C) 明確な a β ペプチド ローカリゼーション パターンくも膜下容器 (緑)、および細動脈 (赤) 構造。いくつかの赤い集りはくも膜下腔に分布も注意してください。これは、20 μ m の解像度でこれらの個々 の a β ペプチドの単一イオン画像による検証: (D) a β 1-40、(E) a β 1-41、および (F) a β 1-42。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57645/57645fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>ケース</td>
			<td>性別</td>
			<td>死亡時年齢します。</td>
			<td>ブラーク SP</td>
			<td>CAA</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>M</td>
			<td>83</td>
			<td>C</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>M</td>
			<td>88</td>
			<td>C</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>M</td>
			<td>84</td>
			<td>C</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>M</td>
			<td>78</td>
			<td>C</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>M</td>
			<td>83</td>
			<td>C</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>M</td>
			<td>84</td>
			<td>O</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>M</td>
			<td>78</td>
			<td>O</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>M</td>
			<td>70</td>
			<td>O</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>M</td>
			<td>73</td>
			<td>O</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>M</td>
			<td>81</td>
			<td>O</td>
			<td>0</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: CAA の場合 SP O 齢と AD の臨床・病理学的データ。東京都老人総合研究所でブレイン バンクから IMS と IHC の人間の皮質標本が得られました。それぞれの脳の標本は、5 つの AD 患者と年齢をマッチさせたコントロールが 5 つの後頭皮質から取られました。A β モノクローナル抗体によるアミロイド沈着の程度は、ブラーク SP (アミロイド) 段階によって定義されました。O の段階で、isocortex 全体でほとんどの老人斑がありません。C の段階で事実上すべての isocortical の領域が影響を受けます。C. の段階で不変な広告の頭脳このテーブルは、角田ら21からの許可と変更されています。

マトリックス支援レーザー脱離/イオン化に基づくイメージング質量分析法 (MALDI 分子研) 分子イメージングは、生体試料中の複数検体の同時マッピングをことができます。ここでは、アルツハイマー病、脳アミロイドアンギオパチー サンプル MALDI IMS を使用しての脳組織のアミロイド β タンパク質の可視化と検出のためのプロトコルを提案する.

The neuropathology of Alzheimer&#39;s disease (AD) is characterized by the accumulation and aggregation of amyloid &#946; (A&#946;) peptides into ...

私たちの論文の主な貢献は、MALDIイメージング質量分析のイメージング技術を用いて、アルツハイマー病脳のアミロイドベータ病理の正確で細かい景観を探求したことです。組織スライドの前処理を行うギ酸を用いた特別なプロトコルを生成し、技術の進歩を達成しました。MALDI-IMSに続いて、セグメンテーションマップが生成され、プラークおよびくも膜下血管系と共局化した新規マーカータンパク質またはペプチドを発見するための計算が行われる。IMSのヒト皮質標本を、死後8時間以内に取り出し、処理し、マイナス80度で保存した脳から取得する。AD患者の後頭部皮質と年齢に一致したコントロールから脳標本を取る。クライオスタット上の組織切片を切断するために、第一位の導電性インジウム酸化スズまたはITOコーティング顕微鏡ガラスは、クライオスタットの内側にスライドします。検死脳標本をマイナス80度から低温検査中にマイナス22度まで温めます。すべての実験のためにクライオスタットに新しい使い捨てブレードを取り付けます。常にブレードのきれいな部分を使用してみてください。少量の最適な切断温度化合物と一緒にステージ上に凍結解剖脳を置きます。IMSおよび免疫組織化学の場合、各組織サンプルから5〜6切片を切断する。ブレードがティッシュを切り始めたばかりのら、車輪を回し、すべての組織が露出するまでブロックに向かいます。セクション全体に小さな筋や涙がある場合は、温度調整が自動的に修正されるまでクライオスタットで待ちます。下の組織でアンチロールを開く前に数秒を数えます。すぐに、ガラススライドのITOコーティング側に組織スライスを置きます。非ITOコーティング側のスライドの下に指を置くことによって、組織スライスを解凍します。組織はスライドに固執します。ティッシュはしわなしでできるだけ平らであることを確認してください。組織切片をすすくい、ガラス染色瓶に70%エタノールの40〜100ミリリットルのサンプルを浸し、内因性脂質および無機塩を除去する。テキストプロトコルに記載されている洗浄シーケンスを使用してサンプルを洗浄します。その後、真空中で30分間乾燥させます。さて、検死脳組織からのアミロイドベータタンパク質のより良いイオン化のためにギ酸蒸気で組織切片を治療する。これを行うには、オーブンを摂氏60度で準備し、5ミリリットルの100%ギ酸をインキュベーショングラス皿に準備します。インキュベーションガラス皿の空気湿度を飽和度に保ちます。培養ガラス皿に組織スライドを入れ、ギ酸中の水没を避け、6分間治療します。フィルムスキャナー、ゲルスキャナー、またはデジタル顕微鏡を使用してサンプルの光学画像を撮影します。このステップは室温で実行します。サンプルターゲットが機器の内部に配置される場合、サンプルの光学画像の位置合わせが必要です。通常、マトリックス層の下の組織部を認識することはできない。光学画像をサンプルと関連付けるには、光学画像とカメラ光学のマトリックス層の下の両方に表示されるガイドマークを作成します。最も簡単な方法は、光学画像を撮影する前に、サンプルの周りに少なくとも3つの補正流体マークを見つけることです。超音波噴霧器でマトリックスをスプレーするには、デシケータから噴霧する組織を取り出し、チャンバーに置きます。組織がセンサーのウィンドウを覆っていないか確認してください。[スタート]ボタンを押して準備を開始します。通常、準備時間は約90分です。準備はマトリックス層の厚さおよび湿気の監視によって自動的に調節される。あるいは、自動噴霧器で組織表面にマトリックス溶液を噴霧するために、1分あたり10 psiと0.15ミリリットルに設定された溶媒ポンプシステムを使用してマトリックス溶液を送達する。加熱されたシースガスの一定の流れはマトリックスの解決のスプレーと共同で渡される。MALDI-IMS を使用して、ハイスループットおよび高空間分解能イメージング実験を行います。質量分析測定では、MALDI制御ソフトウェアとデータ解析ソフトウェアを使用して組織領域を定義します。質量対電荷比の範囲が2,000~20,000、空間分解能が20~100ミクロンの正の線形モードでスペクトルを取得します。校正規格を作るために、ペプチド校正標準とタンパク質較正標準をCHCAおよびTA30溶液と1~4倍の比率で溶解し、それを10倍希釈します。4つの異なる場所のスライドにキャリブレーション標準の1マイクロリットルを置きます。分子構造ソフトウェアを用いて、複数のシグナル画像を重ね、異なるアミロイドベータペプチドが老人斑や動脈壁に同局化するなどの様々なシグナルの空間的相関を見つける。患者番号3の脳アミロイド血管症またはCAAフェノタイプは、この研究で最も顕著であった。この患者の脳組織のMALDI-IMSは、アミロイドベータ1-42およびアミロイドベータ1-43が脳のパレンチマにおいて老人斑として優先的に沈着したことを明確に可視化した。対照的に、アミロイドβ1-36〜1-41のような短いアミロイドベータは、レプトメニンゲ血管領域に優先的に沈着した。非病理学的制御には有意なシグナルはなかった。アミロイドβ1-40およびアミロイドβ1-42の分布は、組織の隣接する凍結切片を用いて免疫組織化学でさらに検証された。抗アミロイドβ1-40抗体標識CAAおよびアミロイドβ1-40は、レプトメニンゲザル血管に優先的に沈着しており、これは、老人斑としての脳小板中のアミロイドベータ1-42の分布とは対照的である。ここに示されているのは、患者番号3から同じセクションに適用される二分k-平均分析で得られたセグメンテーションマップである。このクラスタリング法は、くも膜下腔内のパレンチマおよび血管構造におけるプラーク様構造の同定に成功した。パレンチマの小さな動脈の周りだけでなく、くも膜下の空間で検出されるパレンチマの小さな円形の領域を見つけることは興味深いです。これは、これらの個々のアミロイドベータペプチドの単一のイオン画像によって検証される。特定の抗体を使用する場合でも、アミロイドベータの広い範囲を同時に追跡する限界があります。ここでは、最先端のMALDIイメージング質量分析法を用いてヒト脳におけるアミロイドベータの分布を示す。この報告書は、ヒト検死された脳におけるアミロイドベータタンパク質の完全なセットの特徴付けを提供するので、この貢献はアルツハイマー病研究にブレークスルーを行うと考えています。最も印象的な発見は、アミロイドベータタンパク質のC末端で1つのアミノ酸変化だけがその分布に劇的な変化を起こしていることである。組織調製工程は、ヒト脳組織中の凝集タンパク質の有効なイオン化を得るために重要である。高感度および人工物のないイメージングに不可欠なマトリックスを有する検体の均質な同結晶化。

visualization-amyloid-deposits-human-brain-with-matrix-assisted-laser

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

ナノ粒子の細胞の生体内分布を評価するために使用されるバイオイメージングの方法はnanoformulated化合物の治療と診断監視に適用できます。本明細書に記載の方法は、組織学的coregistrationで評価した場合、感度と特異性です。方法論は、げっ歯類から人間のアプリケーションへの翻訳経路を提供しています。...

診断と治療モニタリングのためのナノ材料の登録バイオイメージング

L-DOPAを用いたドーパミン補充薬物療法は、パーキンソン病の最も一般的に使用される対症療法ですが、不随意の異常な動き、と呼ばれる運動障害などの副作用が付属しています...

パーキンソン病における神経ペプチドのMALDIイメージングマススペクトロメトリー

このビデオは、アルツハイマー病患者からアミロイドベータ(Aβ)ペプチドの沈着を分析するためのヒト皮質脳スライスを準備する手順を示しています。マトリックス支援レーザー脱離イオン化イメージング質量分析(MALDI-IMS)を使用して。ステップには、スライドの準備、イオン化を促進するための組織の処理、およびアミロイドベータペプチドの空間分布の分析が含まれます。...

ヒト皮質脳切片におけるアミロイドβペプチドの可視化

出典: Bisht, K., et.al.β-アミロイドプラークとのミクログリア相互作用を研究するための相関光顕微鏡と電子顕微鏡. J. Vis. Exp. (2016)...

アルツハイマー病マウス脳切片におけるメトキシX04標識アミロイドプラークの可視化とマッピング

この原稿が縦2光子顕微鏡を用いたin vivoでのアミロイド斑の蓄積の間に脳血管系のリモデリングを追跡するための手順を説明します。間引き頭蓋骨製剤は、アルツハイマー病のマウスモデルにおける脳損傷の進行を評価するために、蛍光色素の可視化を可能にします。...

縦<em&gt;インビボ</em&gt;脳血管系のイメージング：中枢神経系疾患との関連

MALDIイメージング質量分析を使用してガングリオシドを検出するためのラット脳組織へのDANマトリックスの昇華のためのプロトコルが提示されます。...

MALDIイメージングマススペクトロメトリーのためのラット脳組織におけるガングリオシドの検出と可視化のためのDANマトリックスの昇華

アミロイドの沈着は、さまざまな病気の最大の特徴し、多くの異なった器官を苦しめます。本稿では、発光性共役オリゴチオフェン蛍光蛍光顕微鏡技術との組み合わせで染色の応用について説明します。この染色法は、検出と臨床的および科学的設定でタンパク質凝集体の探査のための強力なツールを表します。...

アミロイド組織イメージング ステンド グラス ハイパー スペクトルで発光共役オリゴチオフェンと共焦点顕微鏡と蛍光寿命イメージング

このプロトコルは、脳の寄付プログラムと脳の適切な特性を通じて個々の脳老化軌道を追跡する方法を記述する。脳のドナーは、連続多次元評価を含む長期的な縦断的研究に関与しています。プロトコルは、脳処理の詳細な説明と正確な診断方法論が含まれています。...

老化脳の収集、処理、特徴付けのためのアッビアテグラッソブレインバンクプロトコル

脳オルガノイドの質量分析イメージング(MSI)のための高度な方法が開発され、これらのモデル内の代謝物分布をマッピングできるようになりました。この技術は、初期発生時や疾患における脳の代謝経路や代謝物の特徴に関する洞察を提供し、ヒトの脳機能のより深い理解を約束します。...

質量分析法を用いたヒト脳オルガノイドの分子イメージング 

このプロトコールでは、蛍光ガイド下シングルセルMALDI-2質量分析にmicroMSを使用することを概説し、初代ラット神経細胞の分子プロファイリングを強化します。...

レーザー誘起位置イオン化質量分析によるラット神経細胞の蛍光ガイド下マトリックス支援レーザー脱離イオン化

このプロトコルは、質量分析イメージングを用いてグリコーゲンおよびN結合糖団の厳密かつ再現性のある測定を可能にするための主要なステップを詳述しています。...

グリコムの質量分析を用いた空間分子イメージング

学ぶ MALDI-IMSを用いたヒト脳組織中のアミロイドβタンパク質の可視化プロトコル。ギ酸前処理によりイオン化効率を向上させ、アルツハイマー病の病理学的分布を高解像度で解析する革新的な手法を解説します。

マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量顕微鏡を用いたひと脳のアミロイド β の堆積物の可視化

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