ゼブラフィッシュ ランゲルハンス島における単一セルの解像度カルシウム イメージングを用いた β-細胞機能の解析

この方法は、ベータ細胞分野の重要な問題を理解するのに役立ちます。例えば、膵島内の個々のベータ細胞間のヘテロゲンITという機能。この技術の主な利点は、ベータ細胞のライブイメージングによって提供される空間的および時間的解像度です。

個々のβ細胞内のカルシウムの振動を捉えることができます。テキストプロトコルに従って魚を安楽死させた後、カルシウムとマグネシウムを含むHBSS溶液を含むペトリー皿に移します。次に、蛍光ランプと赤いフィルターキューブを備えた実体顕微鏡で、鋭利な鉗子を使用して口から臀鰭までの皮膚を切断します。

右側の切り取った皮膚を剥がすと腹部が露出し、内臓が露出します。次に、赤色蛍光を使用してベータ細胞のmKO2発現を同定し、膵島を特定します。肝臓や脂肪細胞などの周囲の組織を慎重に取り除いて、一次膵島を清掃します。

小島を傷つけたり突いたりしないように注意してください。次に、30マイクロリットルのHBSSをガラス底の皿の中央にピペットで滴下します。次に、解剖した膵島をドロップに移します。

HBSSでは、膵島を一度丁寧に洗い、その後、30マイクロリットルのフィブリノーゲン作業溶液を使用して一度洗います。洗浄ステップ中に膵島を乾燥させることは、細胞死につながる可能性があるため避けてください。トロンビン溶液1ミリリットルあたり10マイクロリットルをゆっくりと穏やかに島に加えます。

小島と皿を15〜20分間そのままにしておきます。フィブリノゲントロンビンドロップが粘性があり安定することを確認します。トロンビンがフィブリノーゲン溶液中で重合するには、十分な時間を与える必要があります。.

そうしないと、イメージングセッション中に金型が安定性を提供しません。GCaMP蛍光のex vivoライブイメージングを行うには、型の上に200マイクロリットルのHBSSを追加し、共焦点顕微鏡のプレートホルダーに皿を慎重に置きます。次に、20X 0.8 NA の誤差対物レンズと明視野オプションを使用して、島を特定します。

赤色蛍光フィルターを使用して、ベータ細胞の核mKO2蛍光を観察すると、膵島に焦点を当てます。個々の核がはっきりと見える必要があります。明確なイメージング平面を見つけるには、Z軸に沿って小島の厚さを手動で移動します。

イメージング面にイメージング用の50〜100個のベータセルが含まれていること、および核mKO2蛍光の明るさが特に島の中心で均一であることを確認してください。次に、スマートセットアップメニューで、以下の設定を使用して、GCaMP6 および mKO2 蛍光のシーケンシャル取得をセットアップします。GCaMP6の場合、励起は488ナノメートル、発光は約500〜555ナノメートルを選択します。

「偽色」で「GFP」を選択します。mKO2の場合、561ナノメートルの励起と570〜630ナノメートルの発光を選択します。偽色の場合は、mCherryを選択します。

取得モードでは、画像解像度を1, 024 x 1, 024ピクセル、速度を10、平均化を1に設定します。連続記録を開始するには、[Time Series] のオプションを選択し、期間を 500 サイクルに設定し、フレームあたり約 2 秒の取得時間を設定します。イメージングサイクルに注意してください。

画像取得を乱さずに最初の50フレームを行った後、膵島を保持しているゲルの上に5マイクロリットルの200ミリモルソーD-グルコース溶液を静かにピペットで移します。次に、10ミリモルコースで150フレームを取得します。時系列の最初の50フレームは、5ミリモルグルコースでのベータ細胞活性に対応します。

これが基礎的な活動です。応答するβ細胞は、時間とともに緑色蛍光の増減を示します。200フレームで、10マイクロリットルの200ミリモルダーD-グルコースを穏やかに追加して、グルコース濃度を20ミリモルに増やします。

次に、20ミリモルの濃度で150フレームを取得します。FIJIで画像ファイルを開くには、[プラグイン]、[LSM Toolbox]、[LSM Toolboxの表示]の順に選択します。LSM Toolbox で [Open LSM] をクリックし、イメージ ファイルを選択します。

[分析] メニューの [ツール] で、ROI マネージャーを開きます。ツールバーにあるポリゴン選択ツールを使用して、ROIを手動で描画します。赤チャネルにROIを描画して、細胞の細胞質の一部を含む核よりも広い領域をカバーするようにします。

ROIの位置がフレーム間で一貫していることを確認し、必要に応じて位置を調整します。[追加] ボタンをクリックして、選択した ROI を ROI マネージャーに追加します。複数の ROI を選択して追加し、複数のセルに関するデータを取得します。

次に、「分析」メニューから「測定の設定」を選択します。次に、領域内の全蛍光強度の抽出を指定するために、Integrated densityを選択します。GCaMP 蛍光を含む緑色のチャンネルに移動し、ROI マネージャーで Multi Measure を選択します。

これにより、時系列全体のセルの強度測定値が提供されます。FIJI出力をコンマ区切りのテキストファイルとして保存します。LSM Toolbox から、イメージ フレームのタイム スタンプを取得します。

タイムスタンプを取得するには、Apply Stamps、Apply t-stamps、File Name、Dump to textfileを使用します。[名前を付けて保存] オプションを使用してタイム スタンプを保存するか、タイム スタンプをスプレッドシートにコピーします。すべてのセルの強度値をコンパイルしたら、一度に1つのセルずつ、または自動的に解析を実行します。

詳細については、テキストプロトコルを参照してください。この実験では、β細胞に特異的に核mKO2およびGCaMP6を発現する45 DPFトランスジェニック系統の個々の初代膵島β細胞をグルコースランプで刺激し、次に塩化カリウムで脱分極させた。細胞の活性を解析した。

FIJIとデータ解析ソフトウェアを使用して、個々のベータ細胞のGCaMP6蛍光強度を抽出し、正規化しました。この微量の蛍光強度からわかるように、個々のβ細胞はグルコースで刺激を受けるとGCaMP6蛍光に振動を示し、塩化カリウムを添加することで蛍光が安定します。この技術は、ベータ細胞のグルコース応答性の細胞分解能と、その機能への窓を提供します。

このテクニックを習得すると、正しく行えば45分で完了します。この手順を実行する際には、ベータ細胞の生存率を確認することが重要です。この手順に続いて、遺伝子操作などの他の方法を実行して、ベータ細胞機能に対する特定の遺伝子の役割を理解することができます。

このビデオを見れば、個々のベータ細胞内のグルコース反応を測定する方法についてよく理解できるはずです。