Name: ゼブラフィッシュ ランゲルハンス島における単一セルの解像度カルシウム イメージングを用いた β-細胞機能の解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: 学ぶゼブラフィッシュランゲルハンス島β細胞の単一セル解像度カルシウムイメージング法。GCaMP6sを用いてグルコース刺激応答と細胞機能異質性をリアルタイムで解析し、糖尿病研究のメカニズム解明に貢献します。

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コメント Ninov 研究室のメンバーは、原稿、再生療法ドレスデン (CRTD) 魚と顕微鏡施設のテクニカル サポート センターのメンバーに感謝いたします。N.N. は、DFG CRTD、TU ドレスデン、ドイツ研究振興協会 (DFG)、ドイツ語センター糖尿病研究 (DZD) のために卓越性のクラスターからの資金によってサポートされます。

Landesdirektion ザクセン, ドイツ (AZ 24-9168.11-1/2013-14, T12/2016) の許可と動物福祉法による動物科目を含むすべてのプロシージャを承認されています。
1. 準備
メモ: このプロトコルは、ゼブラフィッシュ二重遺伝子導入 Tg から主膵島のex vivoイメージング (ins:nls-Renilla-mKO2; cryaa:CFP);Tg (ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) 19 ゼブラフィッシュ。このトランスジェニック行でインスリン プロモーター (ins) ドライブ 2 つの遺伝子の β 細胞特異的発現: nls-Renilla-mKO2、単量体の Kusabira オレンジ 2 (mKO2) と β 細胞の核にあたる蛍光;GCaMP6s15 は、細胞内カルシウム水準の上昇への応答で緑色の蛍光を発する。GCaMP6s のベータ細胞特異表現は、周囲の細胞のタイプのカルシウム変化から干渉されることがなく β 細胞のグルコース応答性を検討できます。
<ol><li>1 ml の Ca2 +/Mg2 +牛フィブリノーゲンの 10 mg を溶解することにより新鮮なフィブリノーゲン株式 (10 mg/mL) の準備-ハンクス平衡塩類溶液 (HBSS) 1.5 mL 遠心管中を含みます。渦フィブリノゲン粉末を完全に溶解するまで精力的に。少なくとも 15 分以上の室温でのソリューションを保持します。 注: ソリューションは、重合を開始し、粘性になる場合、在庫は 2-3 在庫破棄のため室温で保存できます。</li>
	<li>三重の HBSS フィブリノゲン株式を希釈してフィブリノゲン作業ソリューション (3.3 mg/mL) を準備します。たとえば、フィブリノーゲン フィブリノーゲン実用的なソリューションの 900 μ L を準備する HBSS の 600 μ L 入荷の 300 μ L をミックスします。</li>
	<li>10 を溶解することにより、トロンビン溶液 (10 U/mL) を準備 HBSS のリン酸 1 mL でトロンビンのユニット緩衝生理食塩水 (PBS)。 注: このソリューション 50 μ L パーツで検体、予め用意でき-20 ° C の凍結</li>
	<li>200 mM D グルコース溶液を準備するには、50 mL の水に D-グルコースの 1.8 g を溶解します。長期保存のための 4 ° C にしてください。</li>
	<li>300 mM KCl の解決策を準備するには、水 50 mL に KCl の 1.1 g 溶解します。長期保存のための 4 ° C にしてください。</li>
	<li>小島のマウント 35 mm 径ガラス底培養皿を調達します。</li>
	<li>郭清と膵島の取り付けは、蛍光ランプと赤のフィルター キューブを搭載したステレオ顕微鏡を使用 (TRITC: 励起: 532-554 nm、発光: 570-613 nm; またはテキサス赤: 励起: 540-580 nm、発光: 592-667 nm)。</li>
	<li>使用 (0.8 NA) X 20 倒立共焦点顕微鏡 (ツァイス LSM または類似の 780) 空気の目的および 35 mm 径ガラス底培養皿のプレート ホルダー装備 β 細胞内カルシウム流入のイメージングのため。</li>
	<li>ゼブラフィッシュを安楽死させるため tricaine メタンのスルフォン酸塩 (MS222) の 200 mg/L 溶液を準備します。</li>
	<li>ゼブラフィッシュ解離 90 mm シャーレを調達します。</li>
</ol>2. ゼブラフィッシュ主膵島郭清と取付
<ol><li>MS222 で長期間加温を使用して魚を安楽死させます。このため、優しく漁網を使用して水槽から魚を削除し、蓋 (えら) の動きを示しています動物まで、MS222 ソリューションを含むペトリ皿でインキュベート通常、これにかかる 5 分含む Ca2 +/Mg2 +HBSS 液シャーレに転送魚。</li>
	<li>
蛍光ランプと赤のフィルター キューブを搭載したステレオ顕微鏡、下膵臓を分離する動物の腹部の右側にあるを覆っている皮膚を切り裂きます。
	<ol>
<li>このため、シャープな鉗子を用いた臀鰭に口からゼブラフィッシュの皮膚をカットします。腹部を公開するカットの皮膚をはがすこの snipping 臓器の内部を公開します。Β 細胞の mKO2 式の赤い蛍光性を利用して、顕微鏡下で目視検査によって島の位置を確認します。必要な場合は、彼らは見つけるが難しく、膵島をカバーできるよう、肝臓の葉を削除します。 注: 主な膵島は腹部、通常右側の前歯の近くにあります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>肝臓や脂肪細胞などの周囲の組織を慎重に外して主膵島をきれい。けがや膵島; を突くしないように予防措置を取る周囲の組織のクリアした後島表面の個々 の細胞は認識になります。</li>
	<li>ガラス底皿の中央に HBSS の 30 μ L ドロップをピペットします。このドロップに切り裂かれたアイレットを転送します。</li>
	<li>小島 HBSS で一度とフィブリノゲン作業ソリューション (3.3 mg/mL) の 30 μ L を慎重に洗います。細胞死の結果をそう失敗のため洗浄のステップ中に膵島の乾燥を避けるためにことを確認します。</li>
	<li>ゆっくりと優しく、トロンビン溶液 (10 U/mL) を 10 μ L を追加します。小島と皿は 15-20 分、フィブリノーゲン-トロンビン ドロップなる粘性とわずかに不透明なこの時点で観察のためそのままのままにします。</li>
</ol>3 Ex Vivoでのゼブラフィッシュ プライマリ ランゲルハンス島における GCaMP の蛍光強度のライブ イメージング。
<ol><li>HBSS 金型上に 200 μ L を追加し、共焦点顕微鏡のプレート ホルダーに慎重に皿を置きます。共焦点レーザー顕微鏡の 20 倍、0.8 NA、航空目標を使用します。明視野観察オプションを使用して島を探します。</li>
	<li>赤い蛍光性のフィルターを使用して、ベータ細胞の核 mKO2 蛍光を見る、小島に焦点を当てます。個々 の核がはっきりと見えるはずです。</li>
	<li>手動で z 軸に沿って膵島の厚さを介して移動するために共焦点顕微鏡の焦点面を変更することによって明確な画像面を探します。画像平面 β 細胞イメージングのための十分な数 (50-100) を含んでいる、核 mKO2 蛍光の明るさは膵島の中心部で特に制服を確認します。</li>
	<li>「スマート セットアップ メニュー」で次設定を使用して GCaMP6s と mKO2 蛍光の連続集録のセットアップ: GCaMP6s、励起: 488 nm、排出: 500-555 nm、偽色: 緑 (Select"GFP");mKO2、励起: 561 nm (mCherry)、排出量: 570-630 nm、偽色: 赤 (選択"mCherry")。 注: この設定で、緑のチャネルは、GCaMP の蛍光強度を記録しながら、赤のチャネルによって β 細胞核の位置が記録されます。</li>
	<li>「アクイジション ・ モード」で 1,024 x 1,024 ピクセルで画像の解像度を設定 10 と 1 で平均速度。開始連続記録「時系列」のオプションを選択して、1 フレームあたり約 2 秒捕捉時間と 500 サイクルの「期間」を設定します。 注: タイム シリーズの最初の 50 のフレーム 5 mM のグルコース濃度で β 細胞の活動に対応します。これは、ベースラインの応答です。Β 細胞の応答時間で緑色の蛍光強度の満ち欠けが表示されます。我々 は、β 細胞の数 (1-5%) が 5 mM グルコースで振動することを観察しました。</li>
	<li>
イメージングのサイクルに目を離さない。最初の 50 フレーム後に、記録を停止せず 10 mm 周囲液のグルコース濃度を増やします。
	<ol>
<li>画像取り込みを混乱させないでそっと 200 mm 膵島を保持してゲルの上に D-グルコース溶液 5 μ L をピペットします。10 mM グルコース 150 フレームを取得します。 注: グルコース濃度の増加は、β 細胞の数を増加させる、緑のチャネルで GCaMP 蛍光振動を受けています。</li>
		<li>細胞の核は、プロセス中には安定を確認します。小島が広く集録時に揺れていて、フォーカル プレーンのうち核に移動、(必要なら) サンプルを破棄します。</li>
		<li>その後試料の安定性を確保するためにフィブリノーゲン-トロンビン金型の重合を有効にするのに十分な時間を待機します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>200 フレームでさらに軽く 200 mm D グルコース溶液 10 μ L をピペットで 20 mM に溶液の濃度を上げます。20 mM 濃度 150 フレームを取得します。</li>
	<li>350 フレーム後 KCl の 30 ミリメートルを使用して島を脱分極します。このため、300 mM KCl 原液の 20 μ L を追加します。この段階で観察 GCaMP6s 蛍光振動を停止し、高強度の修正また β 細胞はグルコースに応じなかったことは、KCL の添加によってグリーン蛍光強度の増加を表示しました。</li>
</ol>4. 個々 の β-細胞の GCaMP 蛍光トレースの定量化
注: トレースは、グルコースの様々 なレベルに個々 の β-細胞の応答を定量化、イメージング期間全体の GCaMP 蛍光強度を定量化します。数量は、携帯電話の解像度で実行されます。このためには、画像 (4.1-4.6 のステップ)、およびスプレッドシート ソフトウェアまたは R21分析 (4.8 から 4.9 の手順) を実行するから GCaMP の蛍光性の強度の値を抽出するフィジー20を使用します。
<ol><li>フィジー「LSM ツールボックス」を使用してイメージ ファイルを開きます。このため、選択"プラグイン |LSM ツールボックス |"LSM ツールボックスを表示します。「LSM ツールボックス」で"オープン LSM"をクリックし、イメージ ファイルを選択します。 注:「LSM ツールボックス」でサポートされていない形式の tiff を分析のために最初にそれらを変換します。</li>
	<li>フィジーの関心領域 (ROI) ツールを使用して細胞の応答を抽出します。「ツール」の下で「分析」メニューで「ROI マネージャー」を開きます。ツールバーにある「多角形選択ツール」を使用して投資収益率を手動で描画します。</li>
	<li>ベータ細胞核が表示されます赤のチャネルに投資収益率を描画します。それは細胞の細胞質の一部を含めるためには細胞の核より大きい領域をカバーして、投資収益率を選択します。ROI 位置がフレーム間で一貫していることを確認し、必要に応じて位置を調整します。</li>
	<li>「ROI マネージャー」に「[t] を追加する」ボタンをクリックしてして選択した Roi を追加します。選択し、複数のセルでデータを取得する投資収益率に複数 roi 結合相関を追加します。</li>
	<li>次に、「解析」メニューから「測定を設定」を選択します。領域内の合計の蛍光強度の抽出を指定するためには、「集積密度」を選択します。</li>
	<li>GCaMP 蛍光を含む緑のチャンネルに移り、「ROI マネージャー」で「マルチ メジャー」を選択。 注: これは時間シリーズを通して細胞の強度の測定を提供します。</li>
	<li>ROI 位置は膵島の動きのために調整する必要があります、場合に別のフレームで強度の測定を手動でコンパイルします。コピーして別のスプレッドシートに値を貼り付けます。</li>
	<li>「LSM ツールボックス」からイメージ フレームのタイムスタンプを取得します。使用"スタンプを適用 |T スタンプを適用 |ファイル名 |ダンプ テキストファイルに"タイムスタンプを取得します。「として保存」オプションを使用してタイムスタンプを保存またはスプレッドシートにそれらをコピーします。</li>
	<li>すべてのセルの強度値をコンパイル時に分析 1 つのセル、または自動的に (例えばExcel の数式または R を使用) を実行します。</li>
	<li>
2 つのステップの個々 のセルを分析します。
	<ol>
<li>最初のステップで、ベースラインの上の蛍光強度を計算します。このため、最初の 50 フレーム (5 mM グルコース) の蛍光強度の平均として基準蛍光強度 (F0) を計算します。全体の時系列からベースライン (F0) を減算 (– F F0)。 注: いくつかのセルは、通常高濃度で刺激を続けているクリアの GCaMP 振動基底グルコース下を表示できます。このような細胞の細胞が蛍光性の低下を示した初期フレームの平均強度を生かして F0を見積もることができるだけです。</li>
		<li>分析の 2 番目のステップで蛍光強度を正規化することで最終的な GCaMP の蛍光強度を取得します。 注: これは異なる動物から島の違いが削除されます。個々 の島は、グルコース刺激による蛍光発光のさまざまなレベルを表示します。</li>
		<li>最高の強度値で割ることによって蛍光強度を標準化します。これ、ピーク強度 (F最大– F0) を算出し、最終的な GCaMP の蛍光強度を降伏するピーク強度の基準減算値の除算 (F – F0)/(F最大– F0)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>不健全なまたは破損しているかもしれないので変更を KCl 刺激強度に示さない細胞を破棄します。</li>
	<li>R で分析 (4.9-4.10 の手順) を実行するため使用する R スクリプト (plotcelltrace。R) この原稿を提供しました。</li>
</ol>

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</ol>

著者は競合する金銭的な利益を宣言しません。

単一セルの解像度で β 細胞のグルコース応答性の定量化のための手法を示します。これは遺伝子にコードされたカルシウム インジケーター、GCaMP6s を使用して細胞内カルシウム濃度を監視することによって可能です。ベータ細胞の活性は、フィブリノーゲン-トロンビン金型で小島をマウントすることによってキャプチャされた前のヴィヴォです。プロトコルの重要なステップは、金型の安定性です。十分な時間は、フィブリノゲン HBSS 溶液中で溶解するために与えられる必要があります。これがなければ、金型が重合していないので十分にイメージング セッション中に安定性を提供します。小島フィブリノーゲン-トロンビン金型にマウントされ、細胞培養媒体に没頭して残ることが実行可能な少なくとも週 (データは示されていない)。フィブリノーゲン-トロンビン金型、低溶解アガロースなどの選択肢を活用して、膵島22をマウントすることできます。もう一つの重要なパラメーターは、膵島の郭清です。このステップでは、周囲の膵島組織が負傷または膵島を突っついことがなく削除する必要があります。巧みな郭清は実際に付属しています。
イメージングのプロトコルの制限は、膵島の 1 共焦点平面に制限です。これは、ベータ細胞内カルシウム流入の力強さを表現します。膵島の全体の厚さ Z スタックは低画像の速度と個々 の細胞からの振動信号の損失に します。この制限は、3 次元のカルシウム動態をキャプチャを有効にするなど回転ディスクの顕微鏡検査、共焦点レーザー顕微鏡のより高速な手段を用いて改善できます。生体内でカルシウム イメージング12別のフロンティア。ゼブラフィッシュ胚の透明な性質や色素少ないゼブラフィッシュ大人23系統の使用は、将来的に生体内イメージングの可能性を開くことができません。
高時空間分解能でベータ細胞活性のイメージングにより、個々 の β-細胞間の機能的多様性を調査します。このアプローチは、β 細胞集団の存在に光を当てることができます。最近では、複数の研究は名目上均質な β 細胞24,25,26のサブ集団の存在を示しています。Ex vivoイメージングは、グルコースのサブ集団の応答の特性を遺伝的記者と組み合わせることができます。さらに、薬理学的刺激とイメージング セットアップを組み合わせることを β 細胞機能を向上させることができる化合物のスクリーニングを許可できます。
要約すると、ここで紹介しているテクニックは、定量化と個々 の β 細胞のグルコース応答性の比較をことができます。それは β 細胞機能、糖尿病の開発の重要なパラメーターに直接ウィンドウを提供します。

私たちの血糖は、内分泌の膵臓の機能のための大きい部分の狭い範囲に保持されます。膵臓の内分泌の役割は、ランゲルハンス島、ホルモン分泌細胞を含んだによって実行されます。インスリン分泌 β 細胞は、血糖値炭水化物を含む食事を次のレベルを減らします。不十分なインスリン分泌 β 細胞からは、糖尿病1、持続的な高血糖によって特徴付けられるで起因できます。タイプ 1 とタイプ 2 糖尿病は、現在世界中で以上 4 億人を苦しめる、罹患率と死亡率の2に します。Β 細胞機能不全に貢献する分子や環境要因を調査してには、2 型糖尿病を起動し、進行状況をよりよく理解され我々。さらに、ベータ細胞の in vitroに人間の幹細胞を分化する能力は、1 型糖尿病でセル置換療法の新しいベータ細胞のソースを提供できます。このため、ベータ細胞の機能と遺伝モデル有機体の成熟を皿にベータ細胞を作るために必要な知識を得るために勉強することが重要です。
Β 細胞機能は、グルコース刺激による分泌されるインスリン量を定量化することで全体島レベルで監視できます。この累積的なアプローチは、個々 のセルのプロパティを区別せず細胞の単一のグループとして膵島を研究します。ただし、個々 の β 細胞のグルコース応答の解析には、ベータ細胞の機能特性と不均一性3の存在の多様性が明らかにしました。個々 のベータ細胞の機能を評価するためにインスリン分泌4につながる細胞内の変更を監視することが可能です。インスリン分泌 β 細胞にブドウ糖のエントリの前します。Β 細胞に入ったグルコースは atp 急速に代謝されます。高い細胞内 ATP 濃度は、β 細胞の脱分極に導く ATP 感受性カリウム イオン チャネルのオープンの確率を減少させます。脱分極電位感受性カルシウム イオン チャンネルが開き、細胞内カルシウムを増加させます。ターンでは、カルシウムは循環で解放され、グルコース利用5,6,7を促進することにより血糖値を下げるインスリンの分泌をトリガーします。
いくつかの戦略は、β-細胞膜の潜在的な8インスリン小胞のエキソサイトーシス9の直接可視化と細胞内 Ca2 +の定量の監視などの機能を調査するために適用されています。グルコース応答性10のプロキシとして流入。中でも、細胞内 Ca2 +のイメージングはスケール アップ同じ膵島11,12日間グルコース応答性の直接比較を可能にする内の複数の個々 のセルに、分析の利点を提供します。個々 の β-細胞。細胞内 Ca2 +濃度は、カルシウム感受性蛍光色素13または遺伝子にコードされたカルシウム指標 (GECIs)14を使用して監視できます。一方、カルシウム インジケーター色素欠乏細胞型特異性、GECIs は、特定のプロモーターによって特定のセル型で表現できます。また、GECIs、GCaMP6 などの新世代高速ダイナミクス15と共により高い信号対雑音比を提供します。ここ GECIs 単一セルの解像度で β 細胞中のカルシウムを視覚化するための特定の GCaMP6s での新しい世代の有用性を述べる.選択の私達のモデルとして、ゼブラフィッシュを主島に本手法を適用.萌芽期の開発の間に主な膵島のベータ細胞に属します、背側と腹側膵芽16。簡単識別・分離を有効にするゼブラフィッシュ膵臓内のステレオタイプ的な解剖学的位置に主な島があります。主な膵島のベータ細胞は、血糖17,18につながる彼らの遺伝的アブレーション血糖の調節に必要です。さらに、これらのベータ細胞は、早いゼブラフィッシュ開発19中グルコース応答性になります。このプロトコルは、ポスト萌芽期の段階の間に形作る二次の小島をイメージングにも適用できます。プロトコルは定義されたグルコース濃度下の開発の後の段階で画像の β-細胞前のヴィヴォ、することができます。

<table><tbody><tr><td>トランスジェニックゼブラフィッシュ系統: Tg(ins:nls-Renilla-mKO2; cryaa:CFP);Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry)</td><td></td><td></td><td>著者からの要請により</td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>ZEISS</td><td>495015-0001-000</td><td>SteREO Discovery.V8</td></tr><tr><td>蛍光ランプ</td><td>ZEISS</td><td>423013-9010-000</td><td>イルミネーター HXP 120 V</td></tr><tr><td>レッドフィルターキューブ</td><td>ZEISS</td><td>000000-1114-462&nbsp;</td><td>フィルターセット45HQテキサスレッド</td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>ZEISS</td><td>LSM 780</td><td></td></tr><tr><td>ウシフィブリノーゲン</td><td></td><td>Sigma F8630</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (ハンクス平衡塩溶液)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>14025092</td><td></td></tr>トロン<tr><td>ビン</td><td></td><td>Sigma T4648</td><td></td></tr><tr><td>D-グルコース</td><td></td><td>Sigma G8270</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>35 mm直径ガラス底皿</td><td>サーモフィッシャー</td><td>150680</td><td></td></tr><tr><td>トリカインメタンスルホン酸</td><td>シグマ</td><td>E10521&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ファイン鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11445-12</td><td></td></tr><tr><td>FIJI、ImageJバージョンを使用:2.0.0-rc-43 / 1.50e</td><td></td><td></td><td>https://fiji.sc/</td></tr> <tr><td>R、バージョン3.2.4</td><td></td><td></td><td>https://www.r-project.org/</td></tr> <tr><td>RStudio</td><td></td><td></td><td>https://www.rstudio.com/</td></tr> <tr><td>plotcelltrace。R</td><td></td><td></td><td>原稿に付属するカスタムスクリプト</td></tr></tbody></table>

ゼブラフィッシュ ランゲルハンス島における単一セルの解像度カルシウム イメージングを用いた β-細胞機能の解析

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

膵 β 細胞は、ホルモンのインスリンを分泌増加の血中グルコース濃度に対応します。Β 細胞の機能不全は、高血糖と、生命を脅かす深刻な結果に します。Β 細胞が生理学的な条件の下で動作する方法とどのような遺伝および環境要因は彼らの機能不全を引き起こす可能性があります理解することは、糖尿病患者のためのより良い治療の選択肢に 。Β 細胞中のカルシウム濃度を測定する能力は、カルシウム イオン トリガー インスリン放出の流入としての β-細胞機能の重要な指標として機能します。ここで GCaMP6s、カルシウムの遺伝的コード化センサーを用いたゼブラフィッシュ β 細胞のグルコース刺激性カルシウム流入を監視するためのプロトコルについて述べる。メソッドは、単一セルの解像度ex vivoマウント島で細胞内カルシウム動態を監視できます。内同じ膵島 β 細胞のグルコース応答をキャプチャできます同時に別グルコース濃度下でゼブラフィッシュ β-細胞間の機能的多様性の存在を示唆しています。さらに、技術は、グルコース刺激によるカルシウム流入の振動の性質を明らかにする高い時間的・空間的解決を提供します。我々 のアプローチは、モデルとしてのゼブラフィッシュを使用してベータ細胞の機能と機能障害に遺伝および環境要因の貢献を調査する扉を開きます。

上記で説明したプロトコルを使用して 45 日後受精 (dpf) ゼブラフィッシュから島の β 細胞のグルコース応答を行った。このため、主な膵島 euthanized 動物から切開し、ガラス底皿にフィブリノーゲン-トロンビン金型にマウントされています。小島は 5 mM グルコースを含む HBSS に没頭していた。グルコース濃度は、10 mM と 20 mM を段階的に増加しました。Β 細胞のグルコース濃度を上げるレスポンスを記録しました。最後に、ベータ細胞は 30 mM KCl (図 1) を使用して脱分極されました。KCl を使用して脱分極は、健康なベータ細胞のカルシウム エントリを誘導します。
フィジーおよびデータ解析ソフトウェアを使用して、個々 の β-細胞の GCaMP6s の蛍光強度は抽出し、正規化 (図 2)。蛍光強度のトレースから見ると、個々 の β 細胞はグルコース刺激による、KCl 刺激を停止する GCaMP6s 蛍光性の振動を表示します。テクニックは、その機能に β 細胞のグルコース応答ウィンドウ携帯電話の解像度を提供します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57851/57851fig1.jpg"> 図 1:前のヴィヴォライブ イメージング カルシウム流入ゼブラフィッシュ β-細胞の GCaMP6s を使用しています。Tg(ins:nls-Renilla-mKO2); から主な島Tg(ins:GCaMP6s)ゼブラフィッシュ (45 dpf) がフィブリノーゲン-トロンビン金型でマウントされ、5 mM (基底) グルコースと孵化させます。GCaMP6s 蛍光は緑のチャンネルにある β 細胞は赤い核マーカーと標識しました。小島は、グルコース ランプの 10 mM と 20 mM D-グルコースとシーケンシャルの孵化から成る刺激と 30 mM KCl。 矢印マークその活動を行った個々 の β-細胞の脱分極します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57851/57851fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57851/57851fig2.jpg"> 図 2: GCaMP6s 蛍光強度 - 個々 の β-細胞のトレースを正規化します。正規化された GCaMP6s 蛍光強度 - のトレース図 1の矢印でマークされた β-細胞。X 軸は、時間 (秒) を示します。上部のバーは HBSS 中グルコースと KCl の濃度を表しています。Y 軸は、タイム シリーズの間に正規化蛍光強度を示します。このため、基準強度 (F0) は 5 mM グルコースで孵卵中平均強度として計算されます。これは全体の時系列データから減算 (F ・ F0)。セルに表示される最大の強度によって強度の基準を正規化 (F ・ F0)/(F最大- F0)。正規化されたトレースは、グルコース、30 mm KCl 細胞が脱分極するときに安定化する β 細胞の振動応答を示しています<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57851/57851fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。</a> 。

Β 細胞機能カルシウム流入の遺伝的コード化の記者を使用して単一セルの解像度で評価される血糖値の恒常性に重要です。

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

この方法は、ベータ細胞分野の重要な問題を理解するのに役立ちます。例えば、膵島内の個々のベータ細胞間のヘテロゲンITという機能。この技術の主な利点は、ベータ細胞のライブイメージングによって提供される空間的および時間的解像度です。個々のβ細胞内のカルシウムの振動を捉えることができます。テキストプロトコルに従って魚を安楽死させた後、カルシウムとマグネシウムを含むHBSS溶液を含むペトリー皿に移します。次に、蛍光ランプと赤いフィルターキューブを備えた実体顕微鏡で、鋭利な鉗子を使用して口から臀鰭までの皮膚を切断します。右側の切り取った皮膚を剥がすと腹部が露出し、内臓が露出します。次に、赤色蛍光を使用してベータ細胞のmKO2発現を同定し、膵島を特定します。肝臓や脂肪細胞などの周囲の組織を慎重に取り除いて、一次膵島を清掃します。小島を傷つけたり突いたりしないように注意してください。次に、30マイクロリットルのHBSSをガラス底の皿の中央にピペットで滴下します。次に、解剖した膵島をドロップに移します。HBSSでは、膵島を一度丁寧に洗い、その後、30マイクロリットルのフィブリノーゲン作業溶液を使用して一度洗います。洗浄ステップ中に膵島を乾燥させることは、細胞死につながる可能性があるため避けてください。トロンビン溶液1ミリリットルあたり10マイクロリットルをゆっくりと穏やかに島に加えます。小島と皿を15〜20分間そのままにしておきます。フィブリノゲントロンビンドロップが粘性があり安定することを確認します。トロンビンがフィブリノーゲン溶液中で重合するには、十分な時間を与える必要があります。.そうしないと、イメージングセッション中に金型が安定性を提供しません。GCaMP蛍光のex vivoライブイメージングを行うには、型の上に200マイクロリットルのHBSSを追加し、共焦点顕微鏡のプレートホルダーに皿を慎重に置きます。次に、20X 0.8 NA の誤差対物レンズと明視野オプションを使用して、島を特定します。赤色蛍光フィルターを使用して、ベータ細胞の核mKO2蛍光を観察すると、膵島に焦点を当てます。個々の核がはっきりと見える必要があります。明確なイメージング平面を見つけるには、Z軸に沿って小島の厚さを手動で移動します。イメージング面にイメージング用の50〜100個のベータセルが含まれていること、および核mKO2蛍光の明るさが特に島の中心で均一であることを確認してください。次に、スマートセットアップメニューで、以下の設定を使用して、GCaMP6 および mKO2 蛍光のシーケンシャル取得をセットアップします。GCaMP6の場合、励起は488ナノメートル、発光は約500〜555ナノメートルを選択します。「偽色」で「GFP」を選択します。mKO2の場合、561ナノメートルの励起と570〜630ナノメートルの発光を選択します。偽色の場合は、mCherryを選択します。取得モードでは、画像解像度を1, 024 x 1, 024ピクセル、速度を10、平均化を1に設定します。連続記録を開始するには、[Time Series] のオプションを選択し、期間を 500 サイクルに設定し、フレームあたり約 2 秒の取得時間を設定します。イメージングサイクルに注意してください。画像取得を乱さずに最初の50フレームを行った後、膵島を保持しているゲルの上に5マイクロリットルの200ミリモルソーD-グルコース溶液を静かにピペットで移します。次に、10ミリモルコースで150フレームを取得します。時系列の最初の50フレームは、5ミリモルグルコースでのベータ細胞活性に対応します。これが基礎的な活動です。応答するβ細胞は、時間とともに緑色蛍光の増減を示します。200フレームで、10マイクロリットルの200ミリモルダーD-グルコースを穏やかに追加して、グルコース濃度を20ミリモルに増やします。次に、20ミリモルの濃度で150フレームを取得します。FIJIで画像ファイルを開くには、[プラグイン]、[LSM Toolbox]、[LSM Toolboxの表示]の順に選択します。LSM Toolbox で [Open LSM] をクリックし、イメージ ファイルを選択します。[分析] メニューの [ツール] で、ROI マネージャーを開きます。ツールバーにあるポリゴン選択ツールを使用して、ROIを手動で描画します。赤チャネルにROIを描画して、細胞の細胞質の一部を含む核よりも広い領域をカバーするようにします。ROIの位置がフレーム間で一貫していることを確認し、必要に応じて位置を調整します。[追加] ボタンをクリックして、選択した ROI を ROI マネージャーに追加します。複数の ROI を選択して追加し、複数のセルに関するデータを取得します。次に、「分析」メニューから「測定の設定」を選択します。次に、領域内の全蛍光強度の抽出を指定するために、Integrated densityを選択します。GCaMP 蛍光を含む緑色のチャンネルに移動し、ROI マネージャーで Multi Measure を選択します。これにより、時系列全体のセルの強度測定値が提供されます。FIJI出力をコンマ区切りのテキストファイルとして保存します。LSM Toolbox から、イメージ フレームのタイム スタンプを取得します。タイムスタンプを取得するには、Apply Stamps、Apply t-stamps、File Name、Dump to textfileを使用します。[名前を付けて保存] オプションを使用してタイム スタンプを保存するか、タイム スタンプをスプレッドシートにコピーします。すべてのセルの強度値をコンパイルしたら、一度に1つのセルずつ、または自動的に解析を実行します。詳細については、テキストプロトコルを参照してください。この実験では、β細胞に特異的に核mKO2およびGCaMP6を発現する45 DPFトランスジェニック系統の個々の初代膵島β細胞をグルコースランプで刺激し、次に塩化カリウムで脱分極させた。細胞の活性を解析した。FIJIとデータ解析ソフトウェアを使用して、個々のベータ細胞のGCaMP6蛍光強度を抽出し、正規化しました。この微量の蛍光強度からわかるように、個々のβ細胞はグルコースで刺激を受けるとGCaMP6蛍光に振動を示し、塩化カリウムを添加することで蛍光が安定します。この技術は、ベータ細胞のグルコース応答性の細胞分解能と、その機能への窓を提供します。このテクニックを習得すると、正しく行えば45分で完了します。この手順を実行する際には、ベータ細胞の生存率を確認することが重要です。この手順に続いて、遺伝子操作などの他の方法を実行して、ベータ細胞機能に対する特定の遺伝子の役割を理解することができます。このビデオを見れば、個々のベータ細胞内のグルコース反応を測定する方法についてよく理解できるはずです。

analysis-beta-cell-function-using-single-cell-resolution-calcium

Research

JoVE Journal

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ゼブラフィッシュランゲルハンス島における単一セルの解像度カルシウムイメージングを用いた β-細胞機能の解析

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