した Qdot 標識タンパク質と Site-specifically 変更された λ DNA の単一分子レベルでの相互作用の可視化

ここでは、site-specifically 変更された λ DNA 基板とタンパク質をラベル量子ドットを用いた全反射蛍光顕微鏡 (TIRFM) による DNA 蛋白質の相互作用を研究するためのプロトコルを提案する.

この方法は、DNA複製、遺伝子修復、染色体構造の維持など、DNAタンパク質相互作用の単一分子イメージングの分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、修飾ラムダDNAの高コラーゲンを取得し、標識されたタンパク質を迅速に硬化させることができることです。この方法は、フローセルの組み立てステップを学ぶのが難しいため、視覚的なデモンストレーションが重要です。

カバースリップを洗浄するには、20枚のカバースリップを4つの染色ジャーに入れ、それらにエタノールを注ぎ、エタノールで30分間超音波処理します。次に、カバーガラスを超純水で3回すすぎます。次に、カバーガラスを1モルの水酸化カリウムで30分間超音波処理し、カバーガラスを超純水で3回すすぎます。

その後、エタノールと水酸化カリウムの超音波処理を一度繰り返します。カバーガラスをアセトンで30分間超音波処理し、超純水で十分にすすいでください。次に、カバーガラスをピラニア溶液に入れ、摂氏95度で1時間インキュベートします。

インキュベーション後、カバーガラスを超純水で5回すすいでください。次に、各カバーガラスを超純水で広範囲に洗浄します。紙を使用してカバースリップを端から乾かし、カバースリップを染色ジャーに入れます。

カバーガラスを摂氏110度のオーブンで完全に乾かします。次に、カバーガラスをメタノールですすぎ、染色ジャーを摂氏110度のオーブンに戻し、カバーガラスを乾燥させます。カバースリップの機能化を行うには、各ジャーに70ミリリットルのシラン溶液を加え、キャップをねじ込み、ジャーを室温で一晩放置します。

超純水を入れた3つのビーカーを使用してカバースリップを洗います。カバースリップを窒素ガスで十分に乾かします。150ミリグラムのメトキシPEGと6ミリグラムのビオチンPEGを、新たに調製した0.1モル重炭酸ナトリウム1ミリリットルに溶解します。

不溶性PEGを除去するために1分間17, 000倍gで遠心分離機にかけます。次に、シラン化されたカバースリップの中央に100マイクロリットルのPEG溶液をピペットで移し、その上に別のシラン化されたカバースリップを置きます。カバースリップをPEG溶液で暗所で少なくとも3時間インキュベー

カバースリップのペアを分離し、機能化された表面を上向きに保ちます。カバーガラスは超純水で十分にすすぎ、窒素ガスで乾燥させます。次に、マーカーペンを使用して、カバースリップの1つの角に機能化された面をマークします。

キャップに1つの穴が開けられた50ミリリットルのチューブに1つのカバースリップを置きます。チューブをビニール袋に入れ、真空シーラーで袋を密封し、マイナス20°Cで保管します。フローセルを組み立てるには、パンチャーを使用して両面テープの中央にチャネルを切り取ります。

両面テープの紙面をはがし、2つの穴が空いたガラス面に貼り付けます。両面テープのプラスチック面よりも紙面を剥がすと気泡が取りやすくなります。テープを押して気泡を取り除きます。

次に、先端がダイヤモンドのガラススクライブを使用して機能化されたカバースリップを4つに切断し、機能化された面を上にしたまま窒素ガスを使用して破片を取り除きます。両面テープのプラスチック面をはがし、機能化されたカバースリップにスライドを貼り付けます。カバースリップとテープの間の気泡を軽く押して取り除きます。

気泡を完全に除去することで、バッファーが注入されている間、フローセルが漏れるのを防ぐことができます。次に、インレットチューブを小さな穴に挿入し、アウトレットチューブを大きな穴に挿入します。エポキシを使用してチューブを固定します。

シリンジを使用して、0.2ミリグラム/ミリリットルのストレプトアビジンを20マイクロリットルをフローセルに手動でポンプで送り込み、室温で10分間インキュベートします。次に、ブロッキングバッファーをフローセルにポンプで送り込み、ストレプトアビジンを置き換えて室温に保ちます。蛍光顕微鏡テストスライド番号1で、532ナノメートルレーザーと640ナノメートルレーザーを同時に励起することにより、A5で赤と遠赤の焦点位置合わせを取得します。

分割光学系で2波長の画像を生成します。フローセルを顕微鏡に置き、その出口チューブを、自動輸液回収プログラム可能なポンプに取り付けられた10ミリリットルのスプリングに接続された長いチューブに接続します。ブロッキングバッファーを注入し、出口チューブを反転させることにより、フローセル内の気泡を取り除きます。

0.5マイクロリットルのビオチン化ラムダ-ARS317 DNAを80マイクロリットルのブロッキングバッファーに加えます。調製した混合物を毎分25マイクロリットルでフローセルに2分間ポンプで送り込みます。次に、200マイクロリットルのブロッキングバッファーを使用して、毎分50マイクロリットルの速度でラムダ-ARS317 DNAをフラッシュします。

次に、200マイクロリットルの結合バッファーを毎分50マイクロリットルの速度でポンプで送り込み、フローセル内のブロッキングバッファーを除去します。次に、2マイクロリットルのORC-Qdot705、1マイクロリットルのDTT、および1マイクロリットルのATPを96マイクロリットルの結合バッファーに加えます。ORC-Qdot705の最終的な濃度は0.2ナノモルです。

テキストプロトコルに詳述されているように結合バッファーをポンピングした後、調製したORC-Qdot705溶液の20マイクロリットルを毎分10マイクロリットルの速度でフローセルにポンプで送ります。200マイクロリットルの結合バッファーを使用して、毎分100マイクロリットルの速度で過剰なORC-Qdot705を洗い流します。次に、30ナノモルのSYTOX Orangeを配合した結合バッファーをフローセルにポンプで注入し、毎分100マイクロリットルの速度でDNA基質を染色します。

最後に、405ナノメートルのレーザーでORC-Qdot705の信号を励起し、532ナノメートルのレーザーでSYTOX Orange染色したDNAの信号を励起します。クワッドバンドバンドパスフィルタを使用して、毎分100マイクロリットルの流れで信号を同時に観察します。EMCCDで100ミリ秒/フレームで画像を記録します。

ここでは、lambda-ARS317 DNA基質の図を示します。Qdot705で標識されたORCは、405ナノメートルのレーザーによって励起されました。SYTOX Orange染色DNAを532ナノメートルレーザーで励起しました。

マージされた結果は、Qdot705で標識されたORCがARS317に結合することを示唆しています。ラムダ-ARS317 DNA上のORC結合分布の結果は、ORCがARS317に高濃度で結合することを示しています。この手順に続いて、タンパク質間相互作用やタンパク質ダイナミクスに関する追加の質問に答えるために、単一分子FRETなどの他の方法を実行できます。

その開発後、この技術は、単一分子蛍光イメージングの分野の研究者が、in vitroでDNA複製およびDNA修復の再構成システムにおけるDNAタンパク質相互作用を探索する道を開きました。ピラニア溶液での作業は非常に危険であり、この手順を実行する際には常に保護フェイスマスクの着用などの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。