Name: した Qdot 標識タンパク質と Site-specifically 変更された λ DNA の単一分子レベルでの相互作用の可視化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-17T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: 学ぶ単一分子イメージング法で、修飾λDNAとQdot標識タンパク質を用いてDNA-タンパク質相互作用を可視化する技術です。TIRFMを活用し、DNA複製や遺伝子修復の分子メカニズム解明に貢献します。

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我々 は博士・ ハサン ・ Yardimci に感謝し、種類のフランシスの Crick 研究所の Dr.Sevim Yardimci は、単一分子の実験博士ダニエル Duzdevich、コロンビア大学の博士エリック ・ グリーンの研究室から北京大学の博士タマ太陽との Chunlai ドクター有用な議論の清華大学。本研究は、国家自然科学基金、中国の 31371264、31401059、CA 学際的革新チームと、ニュートン高度な交わり (NA140085) 英国王立協会からによって支えられました。

1. λ ARS317 DNA 基板の作製
<ol><li>DNA 基板構成と包装形態<ol>
<li>Xhoを使用してネイティブ λ DNA を消化私酵素;新進の genomic DNA から ARS317 酵母 20 を含むプライマーを用いて 543 bp DNA フラグメント ベアリングを増幅する相同 bp 系列の上流と下流にXho私ラムダ DNA 上の酵素のサイト。追加 100 ng Xhoの λ DNA と 10 を消化され ng の DNA のフラグメントの相同組換え反応システムの 10 μ L と 30 分の 37 ° C で反応を孵化させなさい。</li>
		<li>再結合 λ DNA をパッケージ化、遺伝子組み替え品にラムダ包装エキスを 25 μ l 添加し、90 分の 30 ° C で反応を孵化させなさい。反応管にラムダ包装抽出物の追加 25 μ L を追加します。90 分の 30 ° C で反応をインキュベートし続けます。</li>
		<li>滅菌希釈バッファー (10 mM トリス-HCl (pH 8.3)、100 mM の NaCl、10 mM MgCl2) 500 μ L を反応システムに追加、チューブを数回上下に回して軽く混ぜます。クロロホルムを 25 μ l 添加、穏やかに混合し、4 ° C で保存</li>
		<li>パッケージ化されたバクテリオファージの 100 μ L と細菌 LE392MP の 100 μ L を追加 (養殖 0.8 - 1.0 10 mm MgSO4追加 LB 培地を使用して) 新しいチューブに。37 ° C で 15 分間インキュベートします。</li>
		<li>(LB 培地 + 0.7% 寒天 + 10 mM MgSO4、48 ° C に冷却) 4 mL oftop 寒天培地に菌ファージ混合物の 200 μ L を追加します。すぐにチューブを数回上下に回してミックスし、予め温めておいた (37 ° C) LB プレート上にそれを注ぐ。</li>
		<li>37 ° C でプレートを一晩インキュベート、λ ARS317 プラーク PCR を使用して、シーケンス処理の画面です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>液体の lysates11,18から DNA 基質浄化<ol>
<li>200 μ L の滅菌 ddH210 mm MgCl2 O と 10 nM CaCl2に 1 つのプラークを選択します。細菌 LE392MP の 200 μ L (LB 培地で培養一晩) で混合し、37 ° C、15 分インキュベートします。</li>
		<li>NZCYM の 100 mL に菌ファージ混合物を追加 (10 g/L 5 g/L、NZ アミン酵母エキス、5 グラム/L の NaCl、1 g/L カザミノ加水分解、2 g/L MgSO4·7H2O) 中、37 ° C で 7 h の文化文化にクロロホルムの 250 μ L を追加し、別の 10 分間振る。</li>
		<li>200 mL のフラスコに文化を転送します。NaCl (1 M 最終濃度) の 5.8 グラムを加えて、手で溶解する攪拌氷上で 30 分間インキュベートします。</li>
		<li>細胞の残骸を削除する 4 ° C で 10 分間、12,000 × g で遠心分離機します。200 mL のフラスコに上澄みを収集し、10% PEG8000 (m/V) を追加します。磁気攪拌装置で溶解し、氷上で 30 分間以上インキュベートにかき混ぜます。</li>
		<li>バクテリオファージの沈殿物に 4 ° C で 10 分間の 12,000 × g で遠心分離機します。上澄みを除去します。</li>
		<li>2 mL のバクテリオファージ希釈バッファーで沈殿物を再懸濁します。15 mL チューブに転送し、10 μ L (終濃度が 20 μ G/ml) RNase の (最終濃度は 5 μ G/ml) DNase の 40 μ L を追加します。37 ° c 30 分間インキュベートします。</li>
		<li>0.3 2 mL を加える M トリス-HCl (pH 9.0) 100 mM EDTA + 1.25 %sds、15 μ L プロティナーゼ K (最終濃度は 10 μ G/ml)。65 ° C で 10 分間インキュベートします。</li>
		<li>(3 M, pH 4.8)、予冷カリウム酢酸 2 mL を加えて 10 分間氷の上管を孵化させなさい。</li>
		<li>不溶性物質を削除する 4 ° C で 10 分間 8,000 × g で遠心分離機します。</li>
		<li>培養上清をイソプロパノール 0.7 x 量を追加します。チューブを数回上下に回して混ぜるし、室温 (RT) で 2 分間インキュベートします。</li>
		<li>DNA を沈殿させる常温 10 分 8,000 × g で遠心分離機します。上澄みを除去します。</li>
		<li>70% エタノールで 8,000 x g で 10 分間の遠心分離では、上澄みを除去したら DNA を洗浄します。</li>
		<li>優しく、500 μ L TE バッファー (10 mM トリス-HCl は、1 ミリメートルの EDTA、pH 8.0) を用いた DNA を溶出し、1.5 mL チューブに DNA を転送します。</li>
		<li>2 回/フェノールを用いる DNA を抽出: 8,000 g 10 分間遠心分離によってクロロホルム。</li>
		<li>0.7 x ボリューム イソプロパノールで沈殿させます。回して逆さま管優しく、ダウンし、8,000 × g 10 分間遠心分離機を混ぜます。</li>
		<li>70% エタノールで 1 回洗浄、TE の 200 μ L で再懸濁します。DNA 濃度を測定し、12.5 μ 因数で-20 ° C で保存します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. λ ARS317 DNA ビオチン化
<ol><li>ビオチン標識オリゴヌクレオチドをリン酸化する (5'-AGGTCGCCGCC-TEG-ビオチン-3') ネイティブの左の終わりに補足 λ DNA のオリゴヌクレオチドを ddH2O、1 μ L のリガーゼ バッファー x 10 の 7.5 μ L、T4 PNK 0.5 μ の 1 μ L (100 μ M) を追加。3 h の 37 ° C で反応を孵化させなさい。</li>
	<li>Λ ARS317 をリン酸化、λ ARS317 の 12.5 μ g、リガーゼ バッファー x 10 の 3 μ L を追加し、1 μ L の T4 PNK と ddH2O 30 μ L の総ボリュームには 3 h の 37 ° C で反応を孵化させなさい。</li>
	<li>Λ ARS317 とオリゴヌクレオチドをアニールするには、リン酸化オリゴヌクレオチドの 0.5 μ L、ddH2O、リン酸化 λ ARS317 チューブ 10 × リガーゼ バッファーを 25 μ l 添加の 195 μ L を追加します。チューブを逆さま回すことによって穏やかに混合し、65 ° C 5 分ターン、ブロック ヒーターとブロックの 33 ° C 以下にサンプル クールなオフで孵化させなさい。</li>
	<li>Λ ARS317 とオリゴヌクレオチドを縛ること T4 DNA リガーゼの 1 μ L と ATP (200 mM) の 0.63 μ L を追加します。チューブを逆さま回すことによって穏やかに混合し、一晩 2 時間または 4 ° C の室温で孵化させなさい。1 月に 4 ° C で保存します。 注: DNA を破損しないよう、すべての混合手順は優しくピペットを使用して混合ではなく、上下チューブを回すことによって行う必要があります。</li>
</ol>3. Coverslip のクリーニングと機能化
<ol><li>Coverslip クリーニング<ol>
<li>場所 20 coverslips 4 染色瓶 (5 coverslips/jar) には、エタノールに 30 分間超音波、純水 H2O 3 回と coverslips をすすいでください。</li>
		<li>1 M 水酸化カリウム (KOH) と 30 分間超音波、純水の H2O 3 回と coverslips をすすいでください。一度島の超音波処理とエタノールを繰り返します。</li>
		<li>30 分間、アセトンで超音波や超純水 H2O で徹底的に洗い流し (3 回以上)。 注: アセトン必要があります徹底的に洗浄によって除去する純水 H2O、有機溶剤 (アセトン) などが誤ってピラニア ソリューションと混合すると爆発を起こすかもしれないので14。</li>
		<li>ピラニア ソリューション、coverslips に配置 (H2の 3:1 の混合物など4と 30% H2O2) と 95 ° C 1 時間で孵化させなさい。 注: ピラニア ソリューションは非常にエネルギッシュで糜爛ので、注意してください。ピラニアのソリューションを準備しているとき 500 mL ガラス製ビーカーに最初 H2O2の 50 mL を追加し、だから H2の 150 mL を追加4ビーカーにゆっくりと。</li>
		<li>超純水 H2O coverslips 5 回をすすいでください。超純水 H2O 満ちている超純水 H2O 3 ビーカーを使用して徹底的に各 coverslip を洗浄し、乾燥 coverslip、カバーガラスの端から紙を使用します。染色瓶に、coverslip を置き、30 分間 110 ° C のオーブンで徹底的に coverslip を乾燥します。<ol>
<li>メタノール coverslip のリンスし、coverslip を徹底的に乾燥して 110 ° C のオーブンに染色の jar ファイルを配置します。 注: は、APTES は一度水19存在が可能な表面構造の多くを持っているので非常に重要です、coverslip を徹底的に乾燥します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coverslip の機能化<ol>
<li>シラン溶液 70 mL を追加 (93% メタノールの酢酸、%、2% の 5 APTES) 各瓶にスクリュー キャップと一晩室温で jar を残します。</li>
		<li>3.1.5、乾燥オーブンでそれらを配置する代わりに窒素ガスを使用して徹底的に coverslips 以外の手順で説明するように、coverslips を乾燥を洗って。</li>
		<li>徹底的に 1 mL の 0.1 M フレッシュ製 NaHCO3 (pH 8.2) に 150 mg の mPEG (メトキシ - ポリエチレング リコール)、ビオチン ・ ペッグ (ビオチン - ポリエチレング リコール) の 6 mg を溶解します。17 歳の時、遠心分離機、不溶性のペグを削除する 1 分 000 x g。 注: たて NaHCO3準備ができています。その pH を調整する必要はありません。</li>
		<li>ボックスに、シラン処理 coverslips を置き、シラン処理 coverslips の両端の上部にある 2 つの小さな coverslips を置きます。シラン処理 coverslip の中心に PEG 溶液 100 μ L をピペット、上に別のシラン処理 coverslip を配置します。</li>
		<li>湿気、それを保つためにボックスにいくつか超純水 H2O を追加し、暗闇の中で、少なくとも 3 時間は止め釘の解決と coverslips を孵化させなさい。一晩インキュベートは同様に動作することができます。</li>
		<li>Coverslip のペアを区切るとを機能面を維持、リンス coverslips 超純水 H2O を頻繁に使用して窒素ガスで乾燥させる.</li>
		<li>マーカー ペン保持機能側フェイス アップ、ボックスにそれらを置くし、1 ヶ月間の真空デシケータでボックスを格納を使用してコーナーの 1 つに coverslips の官能の側をマークします。</li>
		<li>長い時間、coverslips を格納するには、そのキャップに 1 つの穴をドリル 50 mL のチューブに 1 つ coverslip の場所し、チューブをビニール袋に入れ、真空のシーラーを使用して袋をシールします。この方法で、coverslips 格納できます-20 ° C で約 3 カ月。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. フロー セル ・ アセンブリ
<ol><li>パンチャーを使用して両面テープ (30 mm × 12 mm) の部分の中央に 15 mm × 2 mm のチャンネルをカットします。</li>
	<li>紙側の両面テープをはがし、2 つの穴とスライド ガラスに貼り付けます。空気の泡を削除するキーを押します。我々 の経験に基づいて、用紙側両面テープのプラスチック面より剥離で空気の泡を削除する簡単です。</li>
	<li>官能 coverslip (60 mm × 24 mm) を切り 4 個 (30 mm × 12 mm) ダイヤモンドひっくり返されたガラスを使用して、スクライブし、窒素ガスを使用して残骸を取除きます。機能性を保つために覚えている側が立ち向かいます。</li>
	<li>両面テープのプラスチック面をはがし、官能の coverslip のスライドを貼り付けます。優しく、coverslip とテープの間の空気の泡を削除するキーを押します。徹底的に空気の泡を削除する一方、バッファーはそれに興奮した漏れからのフロー ・ セルを保護できます。</li>
	<li>それぞれ入口と出口の管を大小の穴に挿入します。エポキシを使用してチューブを修正します。</li>
	<li>手動で注射器を使用してフロー ・ セルにストレプトアビジン (0.2 mg/mL) の 20 μ L をポンプし、室温で 10 分間インキュベートします。フロー ・ セル、ストレプトアビジンを置き換えるためにポンプ ブロック バッファー10し部屋の温度でそれを維持します。</li>
</ol>5. 単一分子の可視化
<ol><li>532 nm レーザーと 640 nm のレーザーを使用した同時励起による蛍光顕微鏡テスト スライド #1 の A5 と遠赤の焦点の配置を取得します。(を参照してくださいテーブルの材料) の光学分割とデュアル波長画像を生成します。</li>
	<li>顕微鏡をフロー ・ セルを配置し、自動注入/撤退プログラム可能なポンプのインストール 10 mL 春と長いチューブ接続するそのアウトレット チューブを接続します。 注: は、フローセルのインレット チューブから注射器にバッファーを引き出す手段を下記のフロー ・ セルにバッファーをポンプします。</li>
	<li>500 μ L/分ですばやく空気を除去し、フローセル内のバッファーがブロックであることを確認するフロー ・ セルにブロック バッファーをポンプします。フロー ・ セルに 200 μ L/分でブロック バッファーをポンプし、徹底的にインレット チューブとフロー ・ セルから空気の泡を削除するアウトレット チューブを反転します。 メモ: フロー ・ セルに注入されるすべてのバッファーは真空デシケータで使用する前に、少なくとも 15 分間脱する必要があります。</li>
	<li>ブロック バッファーの 80 μ L にビオチン化 λ ARS317 DNA の 0.5 μ L を追加し、2 分の 25 μ L/分でフローセルにポンプします。50 μ L/分の速度で 200 μ L のブロック バッファーを用いた λ ARS317 DNA を洗い流し。</li>
	<li>ポンプのフロー ・ セルのブロック バッファーを削除する 50 μ L/分の速度でバッファー10をバインドを 200 μ l 添加します。</li>
	<li>ストレプトアビジン コーティングした Qdot705 (1 μ M) の 0.2 μ L を追加とビオチン化オークの 0.2 μ L (1.2 μ M)、チューブにし、5 分間室温でインキュベートします。チューブにバッファーをバインドの 20 μ L を追加し、氷の上に置きます。オークした Qdot705の最終濃度は約 10 nM。</li>
	<li>オークした Qdot705の 2 μ L を追加 (10 nM)、地デジ (100 mM) 1 μ L ATP (200 mM) の結合バッファーの 96 μ L に 1 μ L。オークした Qdot705の最終濃度が 0.2 nM。</li>
	<li>フロー ・ セルに 10 μ L/分の速度で 0.2 nM オークした Qdot705の 20 μ L をポンプします。過剰なオークした Qdot705を 100 μ L/分の速度で結合バッファーの 200 μ L を使用して洗い流します。30 nM SYTOX オレンジ色の結合バッファーを 100 μ L/分の速度で dna を染色するフロー ・ セルに、ポンプします。</li>
	<li>オークした Qdot705信号を興奮し、ステンド グラスの SYTOX オレンジ色 405 nm レーザーと 532 nm のレーザーをそれぞれ使用して DNA シグナル。クワッド バンド帯域通過フィルター (ff 01-446/510/581/703-25) を使用して 100 μ L/分の流量で、信号を同時に観測し、フレームあたりが 100 ms の EM CCD による画像を記録します。さまざまな分野から 20 の画像のスタックを収集します。</li>
</ol>6. データの分析
<ol><li>カリフォルニア大学サンフランシスコ校博士ロン ベールのラボが開発したイメージのプラグイン (OI_cut_RGBmerge) に基づいた自分自身で変更する新しいプラグインにフィジーのソフトウェアを使用して画像をトリミング。<ol>
<li>画像 (256 × 256 ピクセル) の 2 つのスタックに画像 (512 × 512 ピクセル) のスタックをトリミングします。1 つは、532 nm レーザー刺激的な結果および他は、405 nm レーザー エキサイティングな結果。</li>
	</ol>
</li>
	<li>フィジー-イメージ-スタック-Z プロジェクト (平均強度) を用いた 61 映像を処理します。</li>
	<li>メジャー (LDNA) DNA と DNA のオークした Qdot705 (Lオーク) バインディングのサイトから DNA のまでの距離の長さは手動で終了を係留しました。</li>
	<li>Lオーク/LDNAの結果を計算するを使用して excel、r、ブートス トラップ法を用いたデータ分析、ヒストグラムを作成し、ガウス分布に適合。</li>
</ol>

<ol><li>Fu, Y. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+Bypass+of+a+Lagging+Strand+Roadblock+by+the+Eukaryotic+Replicative+DNA+Helicase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Selective Bypass of a Lagging Strand Roadblock by the Eukaryotic Replicative DNA Helicase.</a> Cell. 146 (6), 930-940 (2011).</li>
<li>Qi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequence+alignment+by+microhomology+sampling+during+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination.</a> Cell. 160 (5), 856-869 (2015).</li>
<li>Chong, S., Chen, C., Ge, H., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+transcriptional+bursting+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanism of transcriptional bursting in bacteria.</a> Cell. 158 (2), 314-326 (2014).</li>
<li>Wegner, K. D., Hildebrandt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+dots%3A+bright+and+versatile+in+vitro+and+in+vivo+fluorescence+imaging+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Quantum dots: bright and versatile in vitro and in vivo fluorescence imaging biosensors.</a> Chemical Society Reviews. 44 (14), 4792-4834 (2015).</li>
<li>Gao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+molecular+and+cellular+imaging+with+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+biotechnology%22%5BJournal%5D)">In vivo molecular and cellular imaging with quantum dots.</a> Current opinion in biotechnology. 16 (1), 63-72 (2005).</li>
<li>Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+interrogation+by+the+CRISPR+RNA-guided+endonuclease+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9.</a> Nature. 507 (7490), 62(2014).</li>
<li>Lee, J. Y., Finkelstein, I. J., Arciszewska, L. K., Sherratt, D. J., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+imaging+of+FtsK+translocation+reveals+mechanistic+features+of+protein-protein+collisions+on+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">Single-molecule imaging of FtsK translocation reveals mechanistic features of protein-protein collisions on DNA.</a> Molecular cell. 54 (5), 832-843 (2014).</li>
<li>Wang, H., Tessmer, I., Croteau, D. L., Erie, D. A., Van Houten, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+and+atomic+force+microscopy+of+a+DNA+repair+protein+conjugated+to+a+quantum+dot%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+letters%22%5BJournal%5D)">Functional characterization and atomic force microscopy of a DNA repair protein conjugated to a quantum dot.</a> Nano letters. 8 (6), 1631-1637 (2008).</li>
<li>Redding, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surveillance+and+processing+of+foreign+DNA+by+the+Escherichia+coli+CRISPR-Cas+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Surveillance and processing of foreign DNA by the Escherichia coli CRISPR-Cas system.</a> Cell. 163 (4), 854-865 (2015).</li>
<li>Xue, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+Biotinylated+Proteins+Expressed+in+Yeast+to+Visualize+DNA-Protein+Interactions+at+the+Single-Molecule+Level%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+microbiology%22%5BJournal%5D)">Utilizing Biotinylated Proteins Expressed in Yeast to Visualize DNA-Protein Interactions at the Single-Molecule Level.</a> Frontiers in microbiology. 8, 2062(2017).</li>
<li>Duzdevich, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+eukaryotic+replication+initiation%3A+origin+specificity%2C+licensing%2C+and+firing+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">The dynamics of eukaryotic replication initiation: origin specificity, licensing, and firing at the single-molecule level.</a> Molecular cell. 58 (3), 483-494 (2015).</li>
<li>Hughes, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+single-molecule+imaging+reveals+a+direct+interaction+between+UvrC+and+UvrB+on+DNA+tightropes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Real-time single-molecule imaging reveals a direct interaction between UvrC and UvrB on DNA tightropes.</a> Nucleic acids research. 41 (9), 4901-4912 (2013).</li>
<li>Kad, N. M., Wang, H., Kennedy, G. G., Warshaw, D. M., Van Houten, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collaborative+dynamic+DNA+scanning+by+nucleotide+excision+repair+proteins+investigated+by+single-molecule+imaging+of+quantum-dot-labeled+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">Collaborative dynamic DNA scanning by nucleotide excision repair proteins investigated by single-molecule imaging of quantum-dot-labeled proteins.</a> Molecular cell. 37 (5), 702-713 (2010).</li>
<li>Chandradoss, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+Passivation+for+Single-molecule+Protein+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Jove-Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Surface Passivation for Single-molecule Protein Studies.</a> Jove-Journal of Visualized Experiments. (86), (2014).</li>
<li>Chen, X. Q., Zhao, E. S., Fu, Y. V. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2095927317301020">Using single-molecule approach to visualize the nucleosome assembly in yeast nucleoplasmic extracts.</a> Science Bulletin. 62 (6), 399-404 (2017).</li>
<li>Yardimci, H., Loveland, A. B., van Oijen, A. M., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+of+DNA+replication+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis of DNA replication in Xenopus egg extracts.</a> Methods. 57 (2), 179-186 (2012).</li>
<li>Tanner, N. A., Loparo, J. J., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+single-molecule+DNA+replication+with+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Visualizing single-molecule DNA replication with fluorescence microscopy.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (32), (2009).</li>
<li>Lockett, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bacteriophage+%CE%BB+DNA+purification+procedure+suitable+for+the+analysis+of+DNA+from+either+large+or+multiple+small+lysates%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">A bacteriophage λ DNA purification procedure suitable for the analysis of DNA from either large or multiple small lysates.</a> Analytical biochemistry. 185 (2), 230-234 (1990).</li>
<li>Smith, E. A., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+prevent+the+loss+of+surface+functionality+derived+from+aminosilanes%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">How to prevent the loss of surface functionality derived from aminosilanes.</a> Langmuir. 24 (21), 12405-12409 (2008).</li>
<li>Kim, Y., Torre, A., Leal, A. A., Finkelstein, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+modification+of+%CE%BB-DNA+substrates+for+single-molecule+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Efficient modification of λ-DNA substrates for single-molecule studies.</a> Scientific reports. 7 (1), 2071(2017).</li>
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ここでは、した Qdot 標識タンパク質およびフロー セル内の観察を使用して site-specifically 変更された λ DNA 間の相互作用を観察するためのプロトコルを提案する.必要な手順には DNA 基板、ビオチン化 DNA、coverslip 洗浄し高機能化、フロー セル準備、および単一分子イメージング サイト固有の変更が含まれます。注意すべき 2 つの重要なポイントがあります。まず、すべての λ DNA と手順は、例えば、任意の可能な被害を減らすため優しく操作する必要があります繰り返し上下にピペッティングにより混合を避けること。第二に、非常に、coverslip がそのバック グラウンド ノイズを最小限に抑えるため十分にきれいであることを確認することが重要です。Coverslip のクリーニングと機能化プロセス中に水超純水レベルに到達する必要があり、空気であるべきほこり無料します。Coverslip の高機能化・ クリーン ベンチのフロー セル ・ アセンブリを行うことをお勧めします。
蛋白質 DNA 相互作用を研究するため単一分子アッセイ、λ D...

タンパク質と DNA の相互作用は、DNA 複製、DNA 修復および転写など、多くの複雑な生物学的プロセスに不可欠です。従来のアプローチは、これらのプロセスのプロパティに光を当てるが、多くの主なメカニズムはまだ明らかではありません。最近では、急速に成長の単一分子技術メカニズムのいくつかは対処1,2,3をされています。
主にリアルタイムで蛋白質 DNA 相互作用の視覚化の単一分子蛍光顕微鏡の応用は、蛍光検出蛍光プローブの開発に依存します。単一分子研究のため適切な蛍光プローブ蛍光検出システム、ほとんど商業的に利用可能なので興味の蛋白質にラベルすることが重要です。
蛍光タンパク質は、分子生物学の一般的使用されます。ただし、低蛍光輝度とフォトブリーチングに対する安定性は、多くの単一分子アッセイへの応用を制限します。量子ドット (Qdots) は、小さな発光ナノ粒子4。彼らのユニークな光学特性のため Qdots は 10-20 倍明るく、数千倍より安定したよりも広く使われている有機染料5。さらに、Qdots は大きなストークス シフト (励起と放射のピークの位置差)5にあります。したがって、彼らは定量的アッセイに利用することはできませんしながら Qdots を長年観察 (時間分) の高い信号対雑音比を持つ画像の取得使用できます。
日には、site-specifically Qdots と標的タンパク質をラベルに 2 つのアプローチがある: ラベリングした Qdot 共役のプライマリまたはセカンダリ抗体6,7,8; の助けを借りてやラベル、ターゲット蛋白質 Qdots と直接、ビオチンとストレプトアビジン9,10、11,12,13間の強い相互作用に基づいています。ストレプトアビジン コーティング Qdots 市販されています。最近の研究では、site-specifically 高効率で出芽酵母のビオチン化タンパク質により精製された・ ビラと avi ファイルのタグ付きタンパク質の過剰発現の co体内10。次一分子アッセイ14,15,16,17を最適化することで我々 は単一分子のレベルを使用した Qdot 標識タンパク質と DNA の相互作用を観察観察10。
ここで、我々 は出芽を選択興味の私達の蛋白質として原点認識複合体 (オーク) を具体的に認識して自律的に複製シーケンス (ARS) バインドできますの酵母。次のプロトコルは、観察を使用してアルスした Qdot というラベルの付いたオークの相互作用を視覚化するステップバイ ステップの手順を示します。Site-specifically 変更された DNA の基質、DNA ビオチン化、coverslip のクリーニングし機能化、フロー セル ・ アセンブリおよび単一分子イメージングの準備を説明します。

<table><tbody><tr><td>ラムダDNA</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>N3011</td><td>ストア25 &mu;Lアリコートは-20°Cです。</td></tr><tr><td>XhoI酵素</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>FD0694</td><td></td></tr><tr><td>クイックフュージョンクローニングキット</td><td>Biotool</td><td>B22611</td><td></td></tr><tr><td>MaxPlax Lambda 包装 抽出物</td><td>Epicentre</td><td>MP5110</td><td>細菌株 LE392MP は、このパッケージに含まれています。</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sinopharm化学試薬Co.、株式会社</td><td>10013092</td><td>どのブランドでも受け入れられます。</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco</td><td>0497-5KG</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>北京化学作品</td><td>N/A</td><td>どのブランドでもかまいません。</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sinopharm化学試薬Co.、株式会社</td><td>10012818</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>北京化学作品</td><td>N/A</td><td>任意のブランドが受け入れられます。</td></tr><tr><td>NZアミン</td><td>アムレスコ</td><td>J853-250G</td><td></td></tr><tr><td>カサミノ酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22090-500G</td><td></td></tr><tr><td></td><td>PEG8000 Beyotime</td><td>ST483</td><td></td></tr><tr><td>磁気攪拌装置</td><td>IKA</td><td>KMO2 塩基性</td><td></td></tr><tr><td>15 mL エッペンドルフ チューブ</td><td>エッペンドルフ</td><td>30122151</td><td>15 mL 滅菌、バルク、500pcs</td></tr><tr><td>Rnase</td><td>SIGMA</td><td>R4875-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Dnase</td><td>SIGMA</td><td>D5319-500UG</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Amresco</td><td>0706-100MG</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン化プライマー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNAリガーゼ、T4 DNAリガーゼ、反応バッファー (10x)</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>M0202</td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>22266882</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>Sinopharm化学試薬Co.、Ltd</td><td>10009259</td><td></td></tr><tr><td>水酸化カリウム(KOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>306568-100G</td><td></td></tr><tr><td>アセトン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A949-4</td><td></td></tr><tr><td>H2SO4</td><td>Sinopharm化学試薬Co.、Ltd</td><td>80120891</td><td>硫酸</td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td><td></td><td>10011218 30% 過酸化水素</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>322415-2L</td><td></td></tr><tr><td>酢酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900798</td><td></td></tr><tr><td>APTES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>mPEG (メトキシポリエチレングリコール)</td><td>Lysan</td><td>mPEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン-PEG (ビオチン-ポリエチレングリコール)</td><td>Lysan</td><td>Biotin-PEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31437-500G</td><td></td></tr><tr><td>真空乾燥器</td><td>天津分公社 Billion Lung Experimental Equipment Co., Ltd.</td><td>IPC250-1</td><td></td></tr><tr><td>真空シーラー</td><td>マジックシール</td><td>WP300</td><td></td></tr><tr><td>ダイヤモンドチップガラススクライブ</td><td>電子顕微鏡 SCIENCES</td><td>70036</td><td></td></tr><tr><td>ガラススライド</td><td>セイル ブランド</td><td>7101</td><td></td></tr><tr><td>インレットチューブ</td><td>SCI(サイエンティフィックコモディティーズ)</td><td>BB31695-PE/2</td><td>内径0.38mm、外径1.09mm。</td></tr><tr><td>アウトレットチューブ</td><td>SCI(サイエンティフィック・コモディティーズ社)</td><td>BB31695-PE/4</td><td>内径0.76mm、外径1.22mm。</td></tr><tr><td>両面テープ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GBL620001-1EA</td><td></td></tr><tr><td>エポキシ</td><td>LEAFTOP</td><td>9005</td><td>5分 エポキシ</td></tr><tr><td>ストレプトアビジン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4762</td><td></td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>注入/回収 プログラム可能なポンプ</td><td>ハーバード大学装置</td><td>70-4504</td><td></td></tr><tr><td>532 nm レーザー</td><td>Coherent</td><td>Sapphire-532-50</td><td></td></tr><tr><td>640 nm レーザー</td><td>Coherent</td><td>OBIS-640-100</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD カメラ</td><td>Andor</td><td>DU-897E-CS0-BV</td><td></td></tr><tr><td>W-View Gemini Imaging splitting optics</td><td>浜松ホトニクス</td><td>A12801-01</td><td></td></tr><tr><td>TIRF照明システム</td><td>オリンパス</td><td>IX2-RFAEVA2</td><td></td></tr><tr><td>60回;TIRF対物</td>レンズオ<td>リンパス</td><td>APON60XOTIRF</td><td></td></tr><tr><td>クアッドエッジレーザーダイクロイック ビームスプリッターSemrock</td><td></td><td>Di01-R405 / 488 / 532 / 635-25x36</td><td></td></tr>ク<tr><td>ワッドバンドバンドパスフィルターSemrock</td><td></td><td>FF01-446 / 510 / 581 / 703-25</td><td></td></tr>ダイ<tr><td>クロイックビームスプリッターSemrock</td><td></td><td>FF649-Di01-25x36</td><td></td></tr><tr><td>蛍光フィルター</td><td>クロマ技術Corp</td><td>ET585/65m</td><td></td></tr><tr><td>蛍光フィルター</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>ET665lp</td><td></td></tr><tr><td>FocalCheck 蛍光、顕微鏡テストスライド #1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F36909</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Orange</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S11368</td><td></td></tr><tr><td>Qdot705 Streptavidin Conjugate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q10163MP</td><td>Store4時とordmで。C、凍結しないでください。</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Amresco</td><td>0220-25G</td><td>ddH2Oを使用して200 mM ATP溶液を調製し、pHを7.0に調整し、10 &mu;Lアリコートは-20°Cです。</td></tr><tr><td>DTT</td><td>アムレスコ</td><td>M109-5GddH</td><td>2Oを使用して1M溶液を準備し、10&mu;-20°Cのアリコート</td></tr></tbody></table>。

した qdot 標識タンパク質と site-specifically 変更された λ dna の単一分子レベルでの相互作用の可視化

Visualizing the Interaction Between the Qdot-labeled Protein and Site-specifically Modified &#955; DNA at the Single Molecule Level

蛍光顕微鏡は、単一分子レベルでの複雑な生物学的過程のメカニズムを解剖に多大な貢献をしました。単一分子アッセイ DNA 蛋白質の相互作用を研究するため、検討のための 2 つの重要な要因がある: 十分な長さの簡単な観察と適切な蛍光プローブを用いたタンパク質を標識 DNA 基板。48.5 kb λ DNA は DNA の基質の良い候補です。量子ドット (Qdots)、蛍光プローブのクラスとして長年観察 (時間分) と高品質画像の取得を許可します。Site-specifically 変更された λ DNA を準備して、ラベリング、ストレプトアビジン コーティング Qdots と標的タンパク質など分子レベルで DNA 蛋白質の相互作用を研究するためのプロトコルを提案します。コンセプトの証明、我々 興味の蛋白質として出芽酵母におけるオーク (原点認識複合体) を選択し、観察を使用して、アルス (自律的複製シーケンス) との相互作用を視覚化します。他の蛍光プローブと比較して、Qdots は退色、に対して高い安定性のための単一分子の研究で明白な利点を持っているが、定量的アッセイへの応用をこのプロパティに制限に注意してください。

初めてした Qdot というラベルの付いたオークと、アルスの相互作用を視覚化するには、λ ARS317 DNA 基板を構築します。ARS317 を含んでいる DNA のフラグメントは統合されたXhoに私は (図 1 a) の相同組み換えによるネイティブ λ DNA の (33.5 kb) をサイトします。遺伝子組み替え品はエキスを使用してパッケージ化され、パッケージ化されたバクテリオファージの粒子は LB プレート (図 1 b) で培養しました。肯定的な phage プラークは PCR によって選別され、(図 1) の配列によって確認します。Λ ARS317 DNA は液体の溶解液 (図 1) から精製した.
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ここでは、site-specifically 変更された λ DNA 基板とタンパク質をラベル量子ドットを用いた全反射蛍光顕微鏡 (TIRFM) による DNA 蛋白質の相互作用を研究するためのプロトコルを提案する.

した Qdot 標識タンパク質と Site-specifically 変更された λ DNA の単一分子レベルでの相互作用の可視化

The fluorescence microscopy&#160;has made great contributions in dissecting the mechanisms of complex biological processes at the single molecule level. ...

この方法は、DNA複製、遺伝子修復、染色体構造の維持など、DNAタンパク質相互作用の単一分子イメージングの分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、修飾ラムダDNAの高コラーゲンを取得し、標識されたタンパク質を迅速に硬化させることができることです。この方法は、フローセルの組み立てステップを学ぶのが難しいため、視覚的なデモンストレーションが重要です。カバースリップを洗浄するには、20枚のカバースリップを4つの染色ジャーに入れ、それらにエタノールを注ぎ、エタノールで30分間超音波処理します。次に、カバーガラスを超純水で3回すすぎます。次に、カバーガラスを1モルの水酸化カリウムで30分間超音波処理し、カバーガラスを超純水で3回すすぎます。その後、エタノールと水酸化カリウムの超音波処理を一度繰り返します。カバーガラスをアセトンで30分間超音波処理し、超純水で十分にすすいでください。次に、カバーガラスをピラニア溶液に入れ、摂氏95度で1時間インキュベートします。インキュベーション後、カバーガラスを超純水で5回すすいでください。次に、各カバーガラスを超純水で広範囲に洗浄します。紙を使用してカバースリップを端から乾かし、カバースリップを染色ジャーに入れます。カバーガラスを摂氏110度のオーブンで完全に乾かします。次に、カバーガラスをメタノールですすぎ、染色ジャーを摂氏110度のオーブンに戻し、カバーガラスを乾燥させます。カバースリップの機能化を行うには、各ジャーに70ミリリットルのシラン溶液を加え、キャップをねじ込み、ジャーを室温で一晩放置します。超純水を入れた3つのビーカーを使用してカバースリップを洗います。カバースリップを窒素ガスで十分に乾かします。150ミリグラムのメトキシPEGと6ミリグラムのビオチンPEGを、新たに調製した0.1モル重炭酸ナトリウム1ミリリットルに溶解します。不溶性PEGを除去するために1分間17, 000倍gで遠心分離機にかけます。次に、シラン化されたカバースリップの中央に100マイクロリットルのPEG溶液をピペットで移し、その上に別のシラン化されたカバースリップを置きます。カバースリップをPEG溶液で暗所で少なくとも3時間インキュベートします。カバースリップのペアを分離し、機能化された表面を上向きに保ちます。カバーガラスは超純水で十分にすすぎ、窒素ガスで乾燥させます。次に、マーカーペンを使用して、カバースリップの1つの角に機能化された面をマークします。キャップに1つの穴が開けられた50ミリリットルのチューブに1つのカバースリップを置きます。チューブをビニール袋に入れ、真空シーラーで袋を密封し、マイナス20°Cで保管します。フローセルを組み立てるには、パンチャーを使用して両面テープの中央にチャネルを切り取ります。両面テープの紙面をはがし、2つの穴が空いたガラス面に貼り付けます。両面テープのプラスチック面よりも紙面を剥がすと気泡が取りやすくなります。テープを押して気泡を取り除きます。次に、先端がダイヤモンドのガラススクライブを使用して機能化されたカバースリップを4つに切断し、機能化された面を上にしたまま窒素ガスを使用して破片を取り除きます。両面テープのプラスチック面をはがし、機能化されたカバースリップにスライドを貼り付けます。カバースリップとテープの間の気泡を軽く押して取り除きます。気泡を完全に除去することで、バッファーが注入されている間、フローセルが漏れるのを防ぐことができます。次に、インレットチューブを小さな穴に挿入し、アウトレットチューブを大きな穴に挿入します。エポキシを使用してチューブを固定します。シリンジを使用して、0.2ミリグラム/ミリリットルのストレプトアビジンを20マイクロリットルをフローセルに手動でポンプで送り込み、室温で10分間インキュベートします。次に、ブロッキングバッファーをフローセルにポンプで送り込み、ストレプトアビジンを置き換えて室温に保ちます。蛍光顕微鏡テストスライド番号1で、532ナノメートルレーザーと640ナノメートルレーザーを同時に励起することにより、A5で赤と遠赤の焦点位置合わせを取得します。分割光学系で2波長の画像を生成します。フローセルを顕微鏡に置き、その出口チューブを、自動輸液回収プログラム可能なポンプに取り付けられた10ミリリットルのスプリングに接続された長いチューブに接続します。ブロッキングバッファーを注入し、出口チューブを反転させることにより、フローセル内の気泡を取り除きます。0.5マイクロリットルのビオチン化ラムダ-ARS317 DNAを80マイクロリットルのブロッキングバッファーに加えます。調製した混合物を毎分25マイクロリットルでフローセルに2分間ポンプで送り込みます。次に、200マイクロリットルのブロッキングバッファーを使用して、毎分50マイクロリットルの速度でラムダ-ARS317 DNAをフラッシュします。次に、200マイクロリットルの結合バッファーを毎分50マイクロリットルの速度でポンプで送り込み、フローセル内のブロッキングバッファーを除去します。次に、2マイクロリットルのORC-Qdot705、1マイクロリットルのDTT、および1マイクロリットルのATPを96マイクロリットルの結合バッファーに加えます。ORC-Qdot705の最終的な濃度は0.2ナノモルです。テキストプロトコルに詳述されているように結合バッファーをポンピングした後、調製したORC-Qdot705溶液の20マイクロリットルを毎分10マイクロリットルの速度でフローセルにポンプで送ります。200マイクロリットルの結合バッファーを使用して、毎分100マイクロリットルの速度で過剰なORC-Qdot705を洗い流します。次に、30ナノモルのSYTOX Orangeを配合した結合バッファーをフローセルにポンプで注入し、毎分100マイクロリットルの速度でDNA基質を染色します。最後に、405ナノメートルのレーザーでORC-Qdot705の信号を励起し、532ナノメートルのレーザーでSYTOX Orange染色したDNAの信号を励起します。クワッドバンドバンドパスフィルタを使用して、毎分100マイクロリットルの流れで信号を同時に観察します。EMCCDで100ミリ秒/フレームで画像を記録します。ここでは、lambda-ARS317 DNA基質の図を示します。Qdot705で標識されたORCは、405ナノメートルのレーザーによって励起されました。SYTOX Orange染色DNAを532ナノメートルレーザーで励起しました。マージされた結果は、Qdot705で標識されたORCがARS317に結合することを示唆しています。ラムダ-ARS317 DNA上のORC結合分布の結果は、ORCがARS317に高濃度で結合することを示しています。この手順に続いて、タンパク質間相互作用やタンパク質ダイナミクスに関する追加の質問に答えるために、単一分子FRETなどの他の方法を実行できます。その開発後、この技術は、単一分子蛍光イメージングの分野の研究者が、in vitroでDNA複製およびDNA修復の再構成システムにおけるDNAタンパク質相互作用を探索する道を開きました。ピラニア溶液での作業は非常に危険であり、この手順を実行する際には常に保護フェイスマスクの着用などの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。

visualizing-interaction-between-qdot-labeled-protein-site

Research

JoVE Journal

Biology

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