トルイジン ブルー染色樹脂埋め込まれたセクションの末梢神経形態の評価

この方法は、末梢神経の形態測定とは何か、軸索がいくつ存在するか、髄鞘形成の状態は何か、線維性組織が存在するかなど、末梢神経損傷と再生の分野における重要な質問に答えるのに役立つ可能性があります。この技術の主な利点は、神経の特徴を高解像度で視覚化できることです。まず、麻酔をかけたラットを解剖マットの上の腹臥位に置きます。

1〜2%イソフルランで麻酔を維持するためにノーズコーンを置きます。適切な麻酔の深さを確保するために、ペダルの離脱と後足の眼瞼反射について動物をテストします。適切な麻酔深度に達したら、後肢の毛を剃り、剃った部分を70%エタノールで滅菌します。

大腿骨を触診して、切開の適切な位置を特定します。大腿骨は、坐骨神経の最もアクセスしやすい部分のすぐ近位に位置しています。膝から大転子まで後肢に沿って皮膚を2〜3センチ切開した後、大腿二頭筋と大殿筋の間の平面を見つけます。

次に、マイクロダイセクションハサミを使用して、下にある筋膜を分離し、下にある坐骨神経の2〜3センチメートルを露出させます。リトラクターを使用して、2つの筋肉の間のギャップを広げます。細い鉗子と虹彩ハサミで、神経を圧迫したり切断したりしないように細心の注意を払いながら、神経を周囲の結合組織から慎重に分離します。

次に、露出した神経をトランプの固定剤で覆い、10分間放置します。必要に応じて、後肢の下にガーゼを置き、角度を改善して、より多くの固定剤を空洞に追加できるようにします。10分後に固定液を取り出し、この手順をさらに2回繰り返します。

解剖顕微鏡の下で、神経を伸ばしたりつまんだりしないように、細かい解剖ハサミを使用して坐骨神経を両側から切断します。すぐに神経切片をトランプ固定剤が入った15mLチューブに入れ、摂氏4度で1週間固定し、48時間ごとに固定液を交換します。固定後、神経から残っている脂肪と結合組織を慎重に取り除き、鋭利なメスを使用して神経を約5ミリメートルの長さに切断します。

神経セグメントは、異なるラベル付きチューブに分離できます。新たに調製した2%四酸化オスミウムに神経セグメントを2時間浸します。エポキシ包埋キットを使用して、最終的な包埋混合物を調製します。

エポキシ包埋媒体をDDSA溶液と混合し、エポキシ包埋媒体をNMA溶液と混合します。両方の溶液をマグネチックスターラーで少なくとも20分間混合します。使用直前に、アクセラレータDPMをソリューションBに組み合わせ、次にこれをソリューションAと組み合わせて、アクセラレータの最終的な比率が総体積の5〜2%になるようにします。

神経セグメントを1点5ミリリットルチューブに移し、PBSで洗浄した後、PBSをアセトンと蒸留水の濃度を上げてそれぞれ10分間交換し、次に100%アセトンに10分間ずつ3回交換することにより脱水プロセスを開始します。重要なステップの1つは、組織の脱水です。水と樹脂は相互作用しないため、組織に残っている水は樹脂に浸透せず、組織学的性質を欠いた切片に穴が開

樹脂浸潤の場合は、まず神経セグメントを埋め込み混合物と100%アセトンの1対1の混合物に30分間置きます。30分後、セグメントを包埋混合物と100%アセトンの2対1の混合物に30分間移します。神経セグメントをシリコーンゴム埋め込み型に入れ、神経の上に樹脂をそっと追加し、気泡を避けながら神経セグメント全体を覆うようにします。

樹脂を摂氏60度で一晩重合させます。神経が埋め込まれた樹脂ブロックを台形面を上にしてウルトラミクロトームホルダーに入れます。ウルトラミクロトームスコープを通して見ながら、片刃のブレードを使用して神経組織を囲む余分な樹脂をトリミングします。

四酸化オスミウムによる暗い染色によって認識できる神経セグメントの縦方向の表面に侵入しないでください。.ウルトラミクロトームにプレーンガラスナイフを使用して、神経の均一な断面表面を露出させるために複数の断面を作成します。これが終わったら、室温で蒸留水で満たされたボートでガラスナイフに切り替え、ウルトラミクロトームを1〜2ミクロンに調整して薄い切片を切断します。

金属ループを使用して、ガラスナイフボートから浮遊する薄い切片をスライドガラス上の脱イオン水滴に移します。もう一つの重要なステップは、ガラスナイフからスライドへの薄い切片の移し替えです。これらの薄い部分は非常に壊れやすく、壊れたり折りたたまれたりする可能性があります。

切片化後、切片が過熱しないように、スライドを炎の上に数回通してスライドの切片を乾かします。スライドは、トルイジンブルーですぐに染色しない場合、室温で数日間保存できます。神経切片を染色するには、プラスチック製のピペットまたはマイクロピペットを使用して、神経切片の上部にトルイジンブルー溶液を一滴加えます。

20〜30秒後、スライドを脱イオン水の瓶にそっと浸し、切片が透明になるまで3〜4回繰り返して、余分なトルイジンブルー溶液をすべて洗い流します。スライドを摂氏60度で少なくとも15分間、または室温で一晩乾燥させます。乾燥後、通常の封入用剤を加え、部分をカバースリップで覆います。

最後に、取り付けられた部分を光学顕微鏡で調べます。詳細な画像では、g比を計算するために100倍油浸レンズが推奨されます。レジンメディウムに包埋し、トルイジンブルーで染色した坐骨神経切片は、10倍から20倍、40倍、60倍に拡大し、最適な解像度で鮮明な画像を示しました。

この方法は、神経構造を維持し、高解像度、高倍率イメージングを可能にし、G比、例えばいくつかのパラメータの測定を容易にする、軸索直径の比は、Bとラベル付けされた矢印で示され、全繊維径に、A.A.Aの様々な要因は、神経の不適切な取り扱いによるセクションの亀裂の存在を含む、最適ではない末梢神経セクションにつながる可能性があります。脱水が不十分なために、セクションに穴が開くこともあります。この手順で考えられる別のエラーは、切片の折り畳みであり、これはスライドガラスへの切片移動に接種ループを使用することで改善できます。

この手順に続いて、軸索の定量化などの他の方法を実行して、再生神経の再生の程度などの追加の質問に答えることができますか?このビデオを見た後、神経形態測定を評価するために1〜2ミクロンの末梢神経切片を取得する方法をよく理解しているはずです。