カフェイン抽出、酵素活性、植物細胞懸濁液からのカフェイン合成酵素の遺伝子発現
2018年10月2日
このプロトコルは、抽出と成木L の細胞懸濁液中のカフェインの定量のための効率的な方法論と表現レベルのカフェイン合成酵素の酵素活性を評価するための実験的プロセスについて説明します。この酵素を符号化する遺伝子。
この方法は、分析化学、生化学、バイオテクノロジー分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。カフェイン生合成に起こる変化はどのようなものである。この技術の主な利点は、カフェインを産生するインビトロ植物モデルに適用できることである。
まず、凍結乾燥した細胞に10ミリリットルのアセトンを加え、フラスコを密封してからボルテックスミキサーと30秒間混合します。次に、100rpmで試料を室温で5時間回転器と混合する。この後、25マイクロリットルのアセトンでサンプルを再懸濁する。
まず、前に調製したカフェイン抽出物の1マイクロリットルをシリカゲルプレートに塗布する。次いで、移動相の10ミリリットルのクロマトグラフィーチャンバー、シクロヘキサンアセトンでTLCを開発する。コンパクトなUVランプで、短波長の紫外線でカフェインバンドを視覚化します。
この後、273ナノメートルの密度測定でカフェインレベルを定量化します。ろ紙を用いて、以前に調製した細胞懸濁液を真空濾過する。次いで、磁器モルタルを使用して、液体窒素およびRNA単離試薬を用いて、均質化されるまで細胞試料を浸食する。
次に、サンプル500マイクロリットルを無菌マイクロ遠心管に移す。次いで、クロロホルムイソアミルアルコールの300マイクロリットル、および平衡フェノールの300マイクロリットルを加える。渦ミキサーでサンプルを混ぜ、20,000Gで摂氏4度で15分間遠心分離します。
この後、上相の300マイクロリットルをきれいなマイクロ遠心管に移す。その後、イソプロパノールの200マイクロリットルを追加し、マイナス20°Cで1時間チューブをインキュベートします。ペレットに1ミリリットルのエタノールを加えます。
次いで、チューブを12,000Gで10分間遠心し、液相をデカン化する。次に、試料を室温で1.5時間乾燥させます。次いで、25マイクロリットルのDEPC処理水でRNA抽出物を再中断する。
まず、全RNA抽出物の2マイクログラムを無菌マイクロ遠心管に加えます。次に、10X反応バッファーの1マイクロリットルとDNaseの1マイクロリットルを加えます。DEPC処理水で10マイクロリットルに反応の最終容積を持って来なさい。
その後、サンプルと遠心分離機を2,000Gで1分間混ぜます。次に、37°Cで30分間インキュベートします。この後、50ミクロモル二ナトリウムの1マイクロリットルをエチレンジアミンテトラセテートを加え、反応を停止させた。
サンプルを摂氏65度で10分間インキュベートします。次に、アガロースゲルに100ナノグラムのRNAを塗布し、ゲルを実行します。ゲル写真ドキュメンテーションシステムを使用してRNAの完全性を可視化します。
まず、マイクロ遠心分離管に合計RNAの2.5マイクログラムを加えます。次に、オリゴデオキシチミジンプライマーを1マイクロリットル加え、ヌクレアーゼを含まない水でチューブを13マイクロリットルの最終体積に充填します。サンプルを混ぜ、2,000Gで遠心分離機を1分間混ぜます。
サンプルを摂氏65度で5分間インキュベートします。そして、2分間摂氏4度で。次に、5X反応バッファーの4マイクロリットル、dNTPミックスの2マイクロリットル、および1マイクロリットルの逆転写酵素をサンプルに加える。
その後、サンプルを2,000Gで1分間軽く遠心分離機で混ぜます。この後、サンプルを摂氏45度で50分間インキュベートし、摂氏70度で10分間インキュベートします。7.5マイクロリットルの2X Taq DNAポリメラーゼと0.1マイクロモルのRAXを、PCRマイクロ遠心チューブに加えます。
次に、各フォワードおよびリバースプライマーを0.75マイクロリットル加え、CCS1遺伝子を増幅する。その後、600 ナノグラムの CDNA テンプレートを追加します。テキストプロトコルに記載されているように、増幅反応をリアルタイムPCRでプリフォームする。
次に、PCR ソフトウェアを使用してデータを分析します。細胞材料の1グラムを計量し、アルミホイルでそれをパックします。サンプルを浸食した後、ガラスバイアルに移し、2.5ミリリットルの抽出バッファーを加えます。
次に、試料を摂氏4度で20分間20,000Gで遠心分離する。500マイクロリットルのアリコートを極低温バイアルに移す。分光光度計を用いて、ビチンコニン酸アッセイを用いて562ナノメートルのサンプルのタンパク質濃度を測定し、牛セリックアルブミンを標準にします。
まず、テキストプロトコルに従って、マイクロ遠心分離管で反応混合物を調製する。その後、100 ミリモルトリス HCL で合計体積を 200 マイクロリットルに増やします。放射性物質との反応混合物の調製中に、あなた自身の安全が適切な予防措置に従うことを覚えておいてください。
氷の上にマイクロ遠心チューブを維持し、タンパク質の7〜9ミリグラムを含む可溶性分画の体積を追加します。その後、混合物をボルテックスし、30分間摂氏30度でインキュベートする。この後、サンプルを11,000Gで5分間遠心する。
次に、900マイクロリットルの体積を慎重に回収し、サンプルをシンチレーションバイアルに移す。次に、クロロホルムを蒸発させて、室温でボンネット内の乾燥を完了します。バイアルに5ミリリットルのシンチレーション液を加えます。
最後に、シンチレーションカウンターを用いてカフェインに組み込まれた放射能を分析する。このプロトコルでは、カフェインの吸光度のパターンをTLC濃度測定を介して分析し、可視光スペクトルを介して、273ナノメートルで最大吸収で読み取った。TLCプレート上のカフェインの分離曲線は、0.34、および0.39の間のRFを示した。
懸濁細胞由来のRNAは、28、18および5s RRNAサブユニットの明確な分離を示し、サンプルが高品質であることを示す。最後に、QPCR分析からメルト曲線を得て、カフェイン合成酵素遺伝子に対する単一の増幅産物を示した。その開発後、この技術は、バイオテクノロジーと生化学の分野の研究者がコーヒー、紅茶、ココから二次代謝組織培養を探求する道を開きました。
放射能や分子病理学を扱うことは非常に危険であり、この手順を実行する際には、手袋、ゴーグル、放射性物質の特別な機器の使用などの予防措置を常に講じなければならないことを忘れないでください。
完全なトランスクリプトを表示し、数千本の科学動画にアクセス
概要
このプロトコルは、C. arabica L.の細胞懸濁液からのカフェインの抽出と定量化のための効率的な方法論を記述し、カフェインシンターゼの酵素活性を評価します。この方法は、植物モデルにおけるカフェインの生合成の理解に役立ちます。
主要な研究要素
科学の分野
- 分析化学
- 生化学
- バイオテクノロジー
背景
- カフェインは様々な植物における重要な代謝産物です。
- その生合成を理解することで、植物代謝に関する洞察が得られます。
- 酵素活性の評価は代謝研究にとって重要です。
- この方法は、カフェインを生産するin vitroモデルに適用できます。
研究の目的
- C. arabica L.の細胞懸濁液からカフェインを抽出し、定量化する。
- カフェインシンターゼの酵素活性を評価する。
- カフェインの生合成の変化を調査する。
使用方法
- 凍結乾燥した細胞に10ミリリットルのアセトンを加えます。
- フラスコを密封し、ボルテックスミキサーで30秒間混合します。
- サンプルを室温で100 rpmで5時間混合します。
- サンプルを25マイクロリットルのアセトンで再懸濁します。
主な結果
- この方法は細胞懸濁液からカフェインを効果的に抽出します。
- カフェインシンターゼの酵素活性を評価できます。
- この方法を通じて、カフェインの生合成に関する洞察が得られます。
- この技術は様々なin vitro植物モデルに適用可能です。
結論
- このプロトコルはカフェイン抽出の信頼できる方法を提供します。
- 植物におけるカフェイン生合成の研究を促進します。
- 将来の研究は、これらの知見を基に代謝経路の探索を行うことができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This protocol enables quantitative assessment of caffeine biosynthesis in plant cell suspensions, supporting target validation in alkaloid pathway engineering. By linking enzymatic activity, transcript levels, and metabolite output, it provides mechanistic de-risking for metabolic engineering projects. The approach offers predictive confidence for prioritizing caffeine-related targets in natural product discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypothesis by quantifying caffeine synthase activity and gene expression in a disease-relevant system.
- Operational Value: Enables biological de-risking through direct measurement of enzyme function and transcript levels in caffeine-producing cells.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by correlating CCS1 expression with caffeine yield, informing target confidence.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by standardizing caffeine extraction and quantification via TLC densitometry at 273 nm.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility through normalized protein quantification using BCA assay and radioactive tracer incorporation.
- Scalability Value: Facilitates platform reuse across in vitro plant models producing caffeine, enabling cross-species comparative analysis.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects discovery to preclinical continuity by measuring caffeine synthase activity as a functional biomarker of pathway engagement.
- Operational Value: Supports risk-adjusted advancement decisions through quantitative dependent variable measurements of enzyme activity and transcript levels.
- Translational Biomarker: Uses caffeine synthase gene expression (CCS1) as a mechanistic readout for pathway modulation in disease-relevant systems.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification by providing quantitative outputs on enzyme activity and gene expression in caffeine biosynthesis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by measuring changes in caffeine biosynthesis through enzymatic activity and transcript analysis.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs via densitometry-based caffeine quantification and scintillation counting of radioactive incorporation.
- Analytics: Enables comparative condition analysis through RF value separation (0.34–0.39) on TLC plates and melt curve validation of QPCR specificity.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by establishing caffeine synthase activity as a functional readout for metabolic pathway validation.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for alkaloid pathway engineering across multiple in vitro plant models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in alkaloid biosynthesis.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of caffeine extraction and enzyme activity assays.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in metabolic engineering.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative enzyme activity and transcript data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in radiolabel handling, RNA isolation, and enzymatic assay protocols.
- Needs access to TLC plates, scintillation counter, UV visualization, and qPCR instrumentation.
- Demands cross-team standardization for radioactive sample handling and data normalization.
- Involves adaptation considerations for different plant cell suspension models and extraction efficiencies.
- Includes practical limitations related to radioactivity safety protocols and RNA integrity requirements.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:28
Caffeine Extraction in Cell Suspension of C. arabica L.
0:55
Conditions for the Assessment of Caffeine by Thin Layer Chromatography (TLC) Denistometry
1:29
Ribonucleic Acid (RNA) Isolation
2:55
Incubation of RNA Transcript with Deoxyribonuclease (DNase)
3:59
Complementary Deoxyribonucleic Acid (cDNA) Synthesis
5:03
Real-Time Quantitative PCR (qPCR) to Amplify the Gene CCS1
5:43
Total Protein of Cell Suspensions of C. arabica L.
6:26
Enzymatic Assay for Caffeine Synthase
7:39
Results: Enzymatic Activity of Caffeine Synthase Gene Evaluated via qPCR
8:30
Conclusion
