Name: 染色と冬の休眠中に甘いチェリーの卵巣原基における澱粉を定量化する画像解析を組み合わせた (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: 学ぶ 甘いチェリーの卵巣原基における澱粉定量法。画像解析と組織化学的手法を組み合わせ、冬の休眠期の生理活性を評価します。Prunus aviumを用いたこの手法は、他の果樹種への応用も可能です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

著者は、マリア ・ エレーロと Eliseo リバスを役に立つ議論のアドバイス感謝してありがとうございます。この作品は Ministerio デ Economía y Competitividad によって支えられた、欧州地域開発基金、欧州連合 [許可番号 BES 2010 037992 e. f.];セルバンテス ナシオナル ・ デ ・危惧 y テクノロジー Agraria y Alimentaria [許可番号 RFP2015-00015-00 RTA2014-00085-00、RTA2017-00003-00];大統領府・ デ ・ アラゴン -欧州社会基金、欧州連合 [Grupo Consolidado A12-17R]。

1. 休眠決定と植物資料集
<ol><li>フィールドの花のつぼみをサンプルします。休眠研究長期実験大人芽を収集するために十分な大きさの木および次のばねの間に木の開発を損なうことがなくすべての冬の撮影を必要とされます。特別な果樹園経営がトレーニング システムによって要求されます。したがって、剪定は果実生産用より重症度の低い可能性があります。<ol>
<li>秋芽を破る、発病までの開始から、毎週収集し、花蕾が 10 の重量を量る。</li>
		<li>キャップ 10 mL ガラス管にそれらを配置することによって花の蕾を修正し、エタノール ・酢酸 (3:1) 4 ° C で、少なくとも 24 時間の固定液に試料を浸漬定着剤を破棄し、75% エタノール, 寛大サンプルをカバーしていることを確認を追加します。サンプルを使用するまで 4 ° C でこのソリューションで節約します。 注: 真空浸透は、芽の中の空気の泡を削除し、フローティングからそれらを防ぐために使用できます。これは組織への定着剤の浸透が容易になりますが、組織の構造に損傷を与える可能性があります。必要ではない場合、それを避けるようにします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>フィールドでの撮影をサンプルします。<ol>
<li>毎週、秋芽を破る、発病までの開始から、15-30 cm 長さ、5 mm 径、花蕾を少なくとも 10 を含む 3 つの芽を取る。22 ± 1 ° C 12 h 光日長成長チャンバ内の水に浸した花屋泡上に置きます。</li>
		<li>成長室で 10 日後で拾うし、新芽から花芽の 10 の重量を量る。</li>
	</ol>
</li>
	<li>芽の成長を評価し、休眠状態を確認します。サンプリング周期は場所の条件に調整すること。果樹園の条件で (スペイン、サラゴサ、41 ° 44'30"N, 0 ° 47'00"W と海抜 220 m)、シュートのサンプリングは、2 月の終わりか 3 月の初めまで 11 月 30 日から実施されました。<ol>
<li>春、芽まで秋の初めから室の適当な生育条件をフィールドから選んだ 10 芽の重量を比較することによって花の蕾の応答を評価する毎週。</li>
		<li>違いがないか、それらの違いは 30% 未満は、芽が、背筋が寒くなる要件に満たない、endodormant22であることを検討してください。違いは 30% 以上である場合は、芽が、背筋が寒くなる要件を満たしている、ecodormant22であることを検討してください。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 植物デンプン定量仕込み
<ol><li>各サンプリングから選択約 6 固定芽の日付 (手順 1.1 参照)。品種によっては、各甘い桜の花芽には最大 5 つの花原基が含まれています。<ol>
<li>外部芽スケールを削除するし、乾燥からそれを防ぐために 75% エタノールを時計のガラスに芽を配置します。</li>
		<li>芽を解剖し、精密鉗子のヘルプと実体顕微鏡下眼科メス芽あたりの少なくとも 1 つの花原基を抽出します。花原基は 4 ° c、75% エタノール 10 mL ガラス管に保存することができます。 または次のステップに進んでください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>第三ブチル アルコール シリーズのサンプルを脱水します。<ol>
<li>75% エタノール溶液を 75% 三級ブチル アルコール寛大サンプルをカバーし、それらをインキュベート 1.5 h (未定) 10 mL に置き換えます。パスツール ピペットは、ソリューションを破棄することができます。</li>
		<li>純粋なこの常温 (< 20 ° C) とは非常に揮発性で有毒なので空気抽出、30 ° C で乾燥ストーブで手順 2.2.1 上昇濃度 (85%、95%、100%、v/v; と純粋な未定 3 x) TBA を追加するを繰り返します。未定はこのサンプルと、組織を破損するしまうと。</li>
	</ol>
</li>
	<li>パラフィン18サンプルを埋め込みます。<ol>
<li>空気抽出前の日に 60 ° C で乾燥のストーブでパラフィン真珠を導入することにより、パラフィンを溶かします。パラフィン真珠、ホット プレートにも溶かすことができるが、流動パラフィンが 60 ° c および組織の損傷を避けるためより高い温度ではないことを確認します。</li>
		<li>置き換える、未定未定、パラフィン オイル (1:1) のミックスと 60 ° C で乾燥ストーブ内 24 時間インキュベートその後、未定のミックスを交換し、純粋なパラフィン オイル パラフィンを溶かすし、60 ° C で乾燥ストーブ内少なくとも 6 時間インキュベートそれを繰り返して 2 倍と、少なくとも 4-6 d の最後の変更を孵化させなさい。</li>
		<li>熱表面に小さな金型ベースの各サンプルを配置パラフィン ワックス、および埋め込みカセット ペース埋め込まれています。冷たい表面上に配置し、ワックスが凝固したらブロックを削除します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>セクションは、水分補給の準備。<ol>
<li>ハウプトの接着剤の準備: プレーンのノックス ゼラチン 30 ° c; 蒸留水 100 mL に 1 g を溶解2 g フェノール緩んで結晶 (C6H5オハイオ州) とグリセリン 15 mL を加えます。ハウプトの接着剤をブラシでスライド ガラスに広がる、1% ホルムアルデヒド溶液のドロップを追加します。</li>
		<li>セクション各パラフィン回転ミクロトームで 10 μ m でブロックし、スライド ガラス上にセクションを配置は、ハウプトの接着剤で覆われています。</li>
		<li>まで乾燥; 35-40 ° C で熱表面上のセクションにスライド ガラスを配置します。その後、スライド ガラスをスライド ラックに移動します。</li>
		<li>Dewax と補水ソリューションを準備します。3 ガラス染色料理、もう 1 つの Histoclear の II:ethanol (1:1、v/v)、エタノール シリーズに Histoclear II の 200 mL (100%, 70%, 40 %v/v)、および最終的な蒸留水洗浄。</li>
		<li>3 つの洗浄、各 5 分、Histoclear II および Histoclear II:ethanol (1:1、v/v) でセクションを dewax します。確保ソリューションが完全にスライドを覆うガラス染色料理内スライド ラックを置き、その後、1 つのソリューションのスライド ラックを次に移動します。</li>
		<li>2 分洗浄の次シリーズでセクションを水分補給: エタノール シリーズ (100%, 70%, 40 %v/v) と最終的な蒸留水洗浄。最後に、常温ガラス スライドを乾燥させます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>セクション18を染色します。<ol>
<li>私2KI 染色の準備: 2 g、ヨウ化カリウム (KI) とヨウ素の 0.2 g を溶解 (私2) 100 mL の蒸留水で。新鮮な滴を適用私25 分のセクション上氣と、あぶらとり紙で吸収することによって、汚れの余分は切り捨てます。すぐに次のステップに進みます。</li>
		<li>合成実装メディアの小滴を適用の上に、小さなカバー ガラスを配置し、ハードを押します。一度メディアをマウントは乾燥、卵巣澱粉の予備的評価の明視野顕微鏡下で観察します。 注: 澱粉と背景のコントラストが得られるが、この手順する必須ではありません。セクションに他の汚れとデンプン定量後再利用することがある場合汚れのドロップ上カバーのガラスを置き、あぶらとり紙で吸収することによって余分は切り捨てる (2.5.1 を参照)。デンプン定量後、洗浄に2KI は蒸留水と場所熱上準備は 35-40 ° C で乾燥するまで表面ステインです。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 澱粉含量の定量
<ol><li>光の条件を調整します。 注: デンプンを検出する画像解析装置を用いた検出レベルは直接光の条件と、顕微鏡の倍率に依存してしたがって、評価のすべての準備のためのこれらの条件を修正します。利用可能な顕微鏡と光の条件をここで提案された調整を適応します。<ol>
<li>X 倍率と明るさコントロールまたは光強度 20 で絞りを調整します。</li>
		<li>フィルター ホルダーにフィルターされていないことを確認し、顕微鏡で明るいフィールド条件を選択します。(例えば甘果オウトウ卵巣原基の 40 X) 適切な倍率を選択します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>画像取得条件を制御します。組織を介して画像なしステンド グラスの準備とカメラの設定を調整する |買収 |前に表示。<ol>
<li>50%、1.0 の利得で明るさを修正 x とガンマ値 1.00 0 - のコントラスト、ヒストグラムの指標 100、輝度分布ヒストグラムの限界と並べる。</li>
		<li>露出オーバー/アンダー関数をアクティブにし、露出オーバーの制限で露光時間を調整します。</li>
		<li>ホワイト バランス機能を修正と同質なイメージを作成する完全な画像に任意の色のトーンやシェーディング補正なしのイメージのすべての中立着色されたコンポーネントを表示する完全な画像に適用されます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>透過率 (T) の値によって取得される別の光学密度 (OD) の灰色のレベル (0、黒; 255、白) のコントロール値を取得する画像解析システムを調整します。<ol>
<li>白、コントロールを考慮せず組織、染色準備のイメージを取得し、黒と白のイメージを介してメジャーの灰色レベルを測定 |灰色の測定 |グレーの調整 |基準値 = 0 |メジャー |校正 |OK。これは 100% の透過率; に対応します。このように、OD によると 0 の光学密度 = 2 - t. をログに記録</li>
		<li>4 光の量を減らす 4 n フィルターと同じ準備のイメージを取得 x、および測定の黒と白のイメージを介してメジャー グレー レベル |灰色の測定 |グレーの調整 |基準値 0.6 を = |メジャー |校正 |OK。これは 25% の透過率; に対応します。このように、OD によると 0.6 の光学密度 = 2 - t. をログに記録</li>
		<li>光、考え抜かれた黒なしと同じ準備のイメージを取得し、黒と白のイメージを介してメジャーの灰色レベルを測定 |灰色の測定 |グレーの調整 |基準値 = 1 |メジャー |校正 |OK。これは透過率が 0% で; に対応します。このように、OD によると、1 の光学密度 = 2 - t. をログに記録</li>
	</ol>
</li>
	<li>デンプンを検出します。<ol>
<li>少なくとも 300 ドット/インチ (dpi) の解像度で TIFF 形式で測定するフィールドのカラー画像を取得します。</li>
		<li>染色領域に対応するバイナリ イメージを作成します。3 色の閾値を設定 (0 - の間の値ごとの 255) バイナリ イメージをまさに反射を介して画像, デンプン顆粒まで |検出 |赤、青、緑のしきい値を選択 |OK。様々 な準備や組織最終的な検出レベルを調整する繰り返し視覚的比較を行います。格納し、すべての準備のためのこれらのレベルを使用します。</li>
		<li>澱粉を定量化します。画像解析システムと黒と白の画像に元のカラー画像を変換します。黒と白のイメージにを介して画像重畳マスクとしてバイナリ イメージを使用 |バイナリ編集。マスクを介して測定の下のすべてのピクセルの光学濃度の合計を測定 |灰色のレベル |OK 、測定フィールド内デンプン含量としてこの値を考慮します。</li>
		<li>3.4.1 - 花原基の卵巣のデンプン含量の代表的な値を取得する卵巣原基 3.4.3 で 4 場所の手順を繰り返します。</li>
		<li>各収集日の別の花で 3.4.5 をステップ、手順 3.4.1 - 3.4.3 繰り返します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Kurokura, T., Mimida, N., Battey, N. H., Hytönen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+seasonal+flowering+in+the+Rosaceae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">The regulation of seasonal flowering in the Rosaceae.</a> Journal of Experimental Botany. 64 (14), 4131-4141 (2013).</li>
<li>Rohde, A., Bhalerao, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+dormancy+in+the+perennial+context%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Plant dormancy in the perennial context.</a> Trends in Plant Science. 12 (5), 217-223 (2007).</li>
<li>Fadón, E., Rodrigo, J. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0098847217302794">Unveiling winter dormancy through empirical experiments.</a> Environmental and Experimental Botany. 152, 28-36 (2018).</li>
<li>Fadón, E., Rodrigo, J., Herrero, M. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s00468-018-1735-7">Is there a specific stage to rest? Morphological changes in flower primordia in relation to endodormancy in sweet cherry (Prunus avium L.).</a> Trees - Structure and Function. , In Press (2018).</li>
<li>Fadón, E., Herrero, M., Rodrigo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dormant+flower+buds+actively+accumulate+starch+over+winter+in+sweet+cherry%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Dormant flower buds actively accumulate starch over winter in sweet cherry.</a> Frontiers in Plant Science. 9 (171), (2018).</li>
<li>Loescher, W. H., Mccamant, T., Keller, J. D. <a target="_blank" href="http://hortsci.ashspublications.org/content/25/3/274.full.pdf">Carbohydrate reserves, translocation and storage in woody plant roots.</a> HortScience. 25 (3), 274-281 (1990).</li>
<li>Hedhly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Starch+turnover+and+metabolism+during+flower+and+early+embryo+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Starch turnover and metabolism during flower and early embryo development.</a> Plant Physiology. , (2016).</li>
<li>Rodrigo, J., Hormaza, J. I., Herrero, M. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1034/j.1399-3054.2000.108001035.x">Ovary starch reserves and flower development in apricot (Prunus armeniaca).</a> Physiologia Plantarum. 108 (1), 35-41 (2000).</li>
<li>Julian, C., Rodrigo, J., Herrero, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stamen+development+and+winter+dormancy+in+apricot+%28Prunus+armeniaca%29%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Stamen development and winter dormancy in apricot (Prunus armeniaca).</a> Annals of Botany. 108 (4), 617-625 (2011).</li>
<li>Alcaraz, M. L., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pistil+starch+reserves+at+anthesis+correlate+with+final+flower+fate+in+avocado+%28Persea+americana%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pistil starch reserves at anthesis correlate with final flower fate in avocado (Persea americana).</a> PLoS One. 8 (10), e78467(2013).</li>
<li>Smith, A. M., Zeeman, S. C. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/nprot/journal/v1/n3/abs/nprot.2006.232.html">Quantification of starch in plant tissues.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1342-1345 (2006).</li>
<li>Eliceiri, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+Imaging+Software+Tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Biological Imaging Software Tools.</a> Nature Methods. 9 (7), (2013).</li>
<li>Rodrigo, J., Herrero, M. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s004970050124">Influence of intraovular reserves on ovule fate in apricot (Prunus armeniaca L.).</a> Sexual Plant Reproduction. 11, 86-93 (1998).</li>
<li>Zhou, J., Spallek, T., Faulkner, C., Robatzek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CalloseMeasurer%3A+A+novel+software+solution+to+measure+callose+deposition+and+recognise+spreading+callose+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">CalloseMeasurer: A novel software solution to measure callose deposition and recognise spreading callose patterns.</a> Plant Methods. 8 (1), (2012).</li>
<li>Faulkner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+quantitative+image+analysis+tool+for+the+identification+of+microtubule+patterns+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">An automated quantitative image analysis tool for the identification of microtubule patterns in plants.</a> Traffic. 18 (10), 683-693 (2017).</li>
<li>Kuhn, B. F. <a target="_blank" href="http://www.pubhort.org/ejhs/2006/file_338662.pdf">Determination of starch in ovules of the sour cherry cv. &#34;Stevnsbaer.&#34.</a> European Journal of Horticultural Science. 71 (3), 120-124 (2006).</li>
<li>Johansen, D. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJohansen%2C+DA+%22Plant+microtechnique%22">Plant microtechnique</a>. , McGraw-Hill. New York, NY. (1940).</li>
<li>Ruzin, S. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRuzin%2C+SE+%22Plant+microtechnique+and+microscopy%22">Plant microtechnique and microscopy</a>. , Oxford University Press. New York, NY. (1999).</li>
<li>Rodrigo, J., Rivas, E., Herrero, M. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/j.1399-3054.1997.tb03437.x">Starch determination in plant tissues using a computerized image analysis system.</a> Physiologia Plantarum. 99 (1), 105-110 (1997).</li>
<li>Alcaraz, M. L., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovary+starch+reserves+and+pistil+development+in+avocado+%28Persea+americana%29%5BTitle%5D)+AND+%22Physiologia+Plantarum%22%5BJournal%5D)">Ovary starch reserves and pistil development in avocado (Persea americana).</a> Physiologia Plantarum. 140 (4), 395-404 (2010).</li>
<li>Suarez, C., Castro, A. J., Rapoport, H. F., Rodriguez-García, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological%2C+histological+and+ultrastructural+changes+in+the+olive+pistil+during+flowering%5BTitle%5D)+AND+%22Sexual+Plant+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Morphological, histological and ultrastructural changes in the olive pistil during flowering.</a> Sexual Plant Reproduction. 25, 133-146 (2012).</li>
<li>Lang, G. A., Early, J. D., Martin, G. C., Darnell, R. L. <a target="_blank" href="https://www.scienceopen.com/document?vid=72cb57c5-ade2-4529-b2ff-f7987d4b215e">Endodormancy, paradormancy, and ecodormancy - Physiological terminology and classification for dormancy research.</a> HortScience. 22 (3), 371-377 (1987).</li>
<li>Hedhly, A., Vogler, H., Eichenberger, C., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+clearing+and+staining+of+arabidopsis+flower+organs+and+siliques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole-mount clearing and staining of arabidopsis flower organs and siliques.</a> Journal of Visualized Experiments. 2018 (134), 1-10 (2018).</li>
<li>Kaufmann, H., Blanke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+carbohydrate+levels+and+relative+water+content+%28RWC%29+to+distinguish+dormancy+phases+in+sweet+cherry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Changes in carbohydrate levels and relative water content (RWC) to distinguish dormancy phases in sweet cherry.</a> Journal of Plant Physiology. 218 (July), 1-5 (2017).</li>
<li>Herrero, M., Dickinson, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pollen-pistil+incompatibility+in+Petunia+hybrida%3A+changes+in+the+pistil+following+compatible+and+incompatible+intraspecific+crosses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Pollen-pistil incompatibility in Petunia hybrida: changes in the pistil following compatible and incompatible intraspecific crosses.</a> Journal of Cell Science. 36, 1-18 (1979).</li>
<li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. 7 (10), R100(2006).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

木質の多年生植物の休眠は休眠の背後にある生物学的プロセスは不明のままが果実生産の明確な含意と気候変動で森林を提示します。休眠研究は別の観点から近づくことができるが、最後の年にわたって冬の休眠の生物学的マーカーを探して研究を強めました。しかし、芽が休眠を壊れているときを示す明確な指標を見つけるほとんどの試みは失敗した3をされています。画像解析と組織化学的テクニック18を組み合わせること、記載方法は特定組織の貯蔵炭水化物と甘果オウトウの芽の生理活性の関係を明らかに非常に有用されています。休眠5のさまざまなフェーズで、他種と組織10,13,20に対しても適用できます。
デンプンの形で貯蔵炭水化物が花器の発育と生殖過程7</su...

温帯木本は、その成長と発展を調節することによって、季節に適応します。彼らは春と夏の間作成し、彼らは冬1で休止状態に行く秋の間に成長を停止します。休眠により低い冬の温度で生き残るために、低温春2の適切な芽のための前提条件です。温帯果実生産・林業における休眠の重要な意味は、多様な取り組みを決定し、休眠期間3を予測するにつながっています。実証実験条件と開花のデータに基づいて統計的に予測を強制的に撮影を転送するは、フルーツの木の種を推定する研究を可能にする休眠打破の日付を決定する現在のアプローチ、各品種のための要件をゾッと。ただし、生物学的プロセスに基づく休眠状態を確認する方法不明3のままです。
甘果オウトウ (セイヨウミザクラl.) などの温帯果樹の開花は年に一度が発生し、約 2 週間続きます。ただし、花を区別し、前の夏4の間に約 10 ヶ月前を開発開始します。花原基は、冬の間に芽内休眠する秋の間に成長を停止します。この期間の各品種は、適切な開花4特定温要求量を蓄積する必要があります。冬の間に芽のフェノロジーの変化の欠乏にもかかわらず花原基が、休眠中に生理活性や低温処理温度の蓄積、最近デンプン蓄積の動的な関連付けられているまたは短縮卵巣原基の細胞内で休眠決定5の新しいアプローチを提供しています。ただし、サイズが小さいと卵巣原基の場所特別な方法論が必要です。
澱粉の木本種6の主要なストレージの炭水化物であります。したがって、でんぷんの変化は彼らの開発の7、8をサポートする炭水化物を必要とする花の組織の生理活性に関連しています。生殖のプロセス中に別のキー イベントも葯減数分裂9スタイルや胚珠の受精10まで花粉管の成長など、別の花の構造の澱粉含量の変化に関連しています。組織化学的技術は、休眠中、花原基のそれぞれの特定の組織にデンプンの検出を許可します。ただし、難易度は、そのデンプン含量の組織、品種、または年間次の蓄積/減少のパターンは時間の経過や澱粉を比較するようにの定量化に残ります。これは、組織分析手法11利用の少し量のためです。代わりに、顕微鏡12にリンクされている画像解析は、植物組織の13の非常に小さいサンプルの澱粉の定量化をことができます。
カロース14、チューブ15などの植物組織内の異なったコンポーネントの含量を定量化する特定の染色領域のサイズを測定することにより澱粉の16顕微鏡と画像解析を組み合わせたアプローチは使用されました。汚れ。でんぷん用簡単に検出できるヨウ化カリウム ヨウ素を使用して (私2KI) 反応17。この方法は非常に具体的です。私2KI デンプン粒のラミナー構造内主体しの暗い青や赤茶色の色を18の澱粉のアミロース含量によってを形作る。私と染色2KI 汚れ示す澱粉と背景組織画像解析システム19による明確なデンプン検出と後続の定量化が可能との間のコントラストが適切な。この染料は化学量論が、ヨウ素の蓄積は17を変わることができる高い澱粉分子の長さに比例。したがって、ピクセルの数として表された染色領域のサイズが内容が反映されない正確に澱粉、澱粉含量の高い違いは同じようなサイズのステンド グラス エリアとフィールドの間見つけることができるので。代わりに、デンプン含量はアプリコット8,13のさまざまな組織で報告されているように、顕微鏡から得られた黒と白の画像にステンド グラスの顆粒の光学密度を測定することによって評価される場合があります。,19、アボカド10、20、およびオリーブ21。
ここで、理解と予測のための新しいツールを提供している秋から春甘果オウトウ、卵巣原基組織の澱粉含量の定量を休眠状態の測定を組み合わせた手法を説明します。生物学的メカニズムの研究に基づく休眠、休眠とリンク。

<table><tbody><tr><td>精密スケール</td><td>ザルトリウス</td><td>CP225D</td><td></td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td>MZ-16</td><td></td></tr><tr><td>乾燥ストーブ</td><td>メモリ</td><td>U15</td><td></td></tr><tr><td>パラフィン埋め込みステーション</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td>EG1140H</td><td></td></tr><tr><td>回転式ミクロトーム</td><td>ライヒェント・ユング</td><td>1130/バイオカット</td><td></td></tr><tr><td>ミクロトームブレード</td><td>フェザー</td><td>S35</td><td>ステンレス鋼</td></tr><tr><td>明視野顕微鏡</td><td>ライカ マイクロシステムズ</td><td>DM2500</td><td></td></tr><tr><td>デジタルカメラ</td><td>ライカ マイクロシステムズ</td><td>DC-300</td><td></td></tr><tr><td>画像解析システム</td><td>ライカ マイクロシステム</td><td>ズ Quantiment Q550</td><td></td></tr></tbody></table>

染色と冬の休眠中に甘いチェリーの卵巣原基における澱粉を定量化する画像解析を組み合わせた

Combining Histochemical Staining and Image Analysis to Quantify Starch in the Ovary Primordia of Sweet Cherry during Winter Dormancy

微小構造におけるでんぷんの変化は、受粉から受精・結実の発症に生殖期を含むいくつかの植物発達過程における主要なイベントに関連付けられます。しかし、花芽分化の進行中にでんぷんの変化知られていない完全に、花原基の特に小さい構造のデンプン含量を定量化の難しさのために主に。ここでは、に関するさまざまなフェーズとデンプン含量の変化を可能にする顕微鏡に接続されている画像解析システムを使用して甘いチェリー (Prunus avium l.) の卵巣原基における澱粉の定量化のため手法について述べる秋から春に休眠。この目的のため、花芽の休眠状態は冬時間の別の瞬間に、制御された条件に譲渡の芽の芽の成長を評価することによって決定されます。卵巣原基における澱粉の定量化, 花芽が順番に収集、固定、パラフィンに埋め込まれた、断面、私で染色2Kl (ヨウ素-ヨウ化カリウム)。準備は顕微鏡の下で観察を行い、背景から澱粉を明確に区別する画像解析によって分析します。デンプン コンテンツ値は検討フレームの澱粉含量の推定として各画素の光学濃度の合計を考慮したステンド グラスの澱粉に対応するイメージの光学密度を測定することによって取得されます。

休眠研究は、低温の要件を満たしているとき瞬間の定量を必要とします。フィールド条件 (図 1 a) の下で冬の間に季節の変更の欠乏にもかかわらず彼らは低温下で一定期間を経過するまで、桜の木は適切な状態で成長の容量を回復しません。冬の間の管理された条件室 (図 1 b) にシュートの正規の転移は、花芽の休眠状態の評価を許可しました。花芽の成長の評価は、芽の重量の増加を測定することによって行われていた。一方、休眠中に変更できることを確認適切な条件 (図 1) の 10 日後休眠を克服したら、芽が膨らんだし、成長室 (図 1) でのバーストします。この分析の結果は、確立する芽の休眠状態を許可されます。異なる温度が冬の間に発生して、休眠は、年によっては異なる日付で克服されました。一方、研究の最初の年の間に、1 月に発生した休眠打破の 2 年目提示...

組織化学的手法と組み合わせる画像解析システムを使用して、冬の休眠中に甘果オウトウ (セイヨウミザクラL.) 卵巣原基のデンプン含量を定量化する手法を提案します。

Changes in starch in small structures are associated with key events during several plant developmental processes, including the reproductive phase from ...

この方法は、なぜ花の芽が適切に花を咲かすために冬の間に寒さを蓄積する必要があるのかなど、木質植物の休眠に関する重要な質問に答えることができます。この技術の主な利点は、花の原始の非常に小さなサンプルでデンプンの定量を可能にすることです。このアプローチは、休眠中に花の原始生の生理活性を検出するのに非常に有用であり、アプリコットや梅のような他の樹種にも適用することができる。この方法は、休眠花芽への洞察を提供することができますが、受粉から結実の発症までの生殖段階などの他のプロセスにも適用できます。まず、フィールドから5つのシュートを収集します。その後、摂氏4度で少なくとも24時間固定溶液で10ミリリットルのガラス管に10個の花芽を計量して固定します。この後、固定液を捨て、サンプルをカバーするのに十分な75%エタノールを加えます。長さ15~30センチ、直径5ミリメートル、それぞれ10本の花芽を持つ3つの芽を得る。その後、成長室に水浸し花屋の泡の上に芽を置きます。成長室で10日後、芽から花芽を取り除き、それらを計量します。毎週秋の初めから春に芽が出るまで、花芽の成長を評価します。各サンプルから外的な芽のスケールを取り除き、75%エタノールを含む時計職人のガラスに各芽を置きます。芽を解剖し、各芽から少なくとも1つの花のプリモルジウムを得るために精密鉗子と眼科メスを使用してください。サンプルをパラフィンワックスに個別に埋め込んでブロックを形成し、回転ミクロトームに切り離します。サンプルを切り離した後、新鮮なルゴルのヨウ素をセクションに塗布します。5分後、ブロッティングペーパーで余分な汚れを取り除きます。次に、合成実装メディアの小さな滴を適用し、サンプルの上に小さなカバーガラスを置き、強く押します。取り付け培地が乾燥したら、明視野顕微鏡で染色部を観察します。まず、テキストプロトコルに従って、絞りダイヤフラムと明るさのコントロールを調整します。フィルターホルダーにフィルターがないことを確認し、顕微鏡で明視野条件を選択します。この後、染色された準備のカメラ設定を組織なしで調整します。50%で明るさを修正する 次は露出過多/露出過多機能を有効にし、露出超過の限界で露光時間を調整します。ホワイトバランス機能とシェーディング補正を適用します。組織を含まない染色された調製物の得られた白黒画像のグレーレベルを測定する。次いで、4Nフィルタを適用し、準備の別の白黒画像を取得し、グレーレベルを測定する。次に、同じ調製物の画像を光なしで取得し、得られた画像のグレーレベルを測定し、較正する。その後、少なくとも 300 dpi の解像度で TIFF 形式のサンプル セクションのカラー イメージを取得します。染色された領域に対応するバイナリイメージを作成し、その後、3つのカラー閾値を設定し、その後、その三つのカラーの画像が、染色されたデンプン顆粒を正確に反映するまで設定します。他の準備および組織とこのプロセスを繰り返して、最終的な検出レベルを微調整します。画像解析システムを用いて、マスク下の各画素の光学濃度の合計を測定し、フィールド内のデンプン含有量を定量化する。このプロトコルでは、花芽の成長と休眠状態を、適当な条件で10日後の芽重量の増加を測定することによって評価した。休眠中、適切な条件で10日後に変化は認められない。休眠状態が克服されると、芽が膨らみ、成長室で破裂しました。卵巣プリモジウム中のデンプン含有量を、各マイクロトム化されたセクションの画像解析を介して定量した。一貫して、初冬のデンプンの量は、40,000未満の光学密度値を提示し、最大量は、研究の両方の年の間に120、000と140,000の間の値に達しました。休眠状態を考慮すると、デンプンの最大量は、両方の年の間に冷たいフルフィルメントと一緒に発生しました。イメージアナライザで使用される検出レベルは、システムのキャリブレーションに直接依存することを覚えておくことが重要です。これには、光の状態、染色強度、および顕微鏡の倍率が含まれます。この条件は、すべての準備のために修正する必要があります。細胞化学技術と画像解析の組み合わせは、休眠の異なる段階で花の原始の炭水化物の予備を調べるのに非常に有用である。また、他の種や組織にも適用できます。この方法を用いて明らかにした卵巣プリモディアにおける休眠放出と澱粉蓄積との関係は、休眠および冷え込み条件の生物学的基礎を理解するための健全な基礎を提供する。将来の努力は、簡単に木の休眠状態を示すことができる信頼性の高い生物学的指標を研究することに焦点を当てる必要があります。一方、休眠状態に沿ったデンプンのバリエーションのパターンは、さらなる生理学的および遺伝的研究を枠組みにするために使用することができる。

combining-histochemical-staining-image-analysis-to-quantify-starch

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

植物細胞壁の組成は組織タイプによって異なり、リグニン、セルロース、ヘミセルロース、ペクチンを含むことができます。細胞種レベルでの違いを可視化するために、さまざまな染色技術が開発されてきました。この論文は、一般的に使用される細胞壁染色技術をまとめたものです。...

の組織化学的染色<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;二次細胞壁の要素

私たちは、免疫染色、蛍光in situハイブリダイゼーション 、ホールマウントシロイヌナズナ胚珠の量的、高分解能イメージングに続いてDNA染色のためにここに効率的で信頼性の高いプロトコルを提供する。この方法は、正常なクロマチン修飾および核構造を分析するために使用した。...

ホールマウント胚珠内でのクロマチン修飾や核構造の定量的、単一細胞分析のための効率的な方法<em&gt;シロイヌナズナ</em

アブラムシの胚に対する全量免疫染色のプロトコルが提示され、バックグラウンド染色の減少と組織透過性の増加のための重要な条件が対処されます。これらの条件は、アブラムシの胚組織におけるタンパク質発現を効果的に検出するために特別に開発されました。...

エンドウアブラムシ胚における免疫染色のための重要な条件の同定：組織透過性を増大し、バックグラウンド染色を減少

ライブショウジョウバエ卵巣組織の上皮幹細胞系列の細胞内 pH のイメージングのためのプロトコルを提供します。定量的蛍光イメージングを用いたバイオ センサー pH センサー、mCherry::pHluorin、イメージを表現する遺伝子組換えハエを生成し、標準曲線を生成 pH...

ライブショウジョウバエ卵巣組織の卵胞幹細胞系列のイメージング細胞内 pH の方法

このプロトコルでは、シロイヌナズナの花と...

全体マウント クリアとシロイヌナズナの花器官および Siliques の染色

シリアルセクショニングせず若いマウスの培養の卵巣内の卵胞を定量化するためのプロトコルを紹介します。全臓器の蛍光抗体法と組織をクリア使用して、、光学セクショニングに置き換えられます物理的な区分します。試料調製及び可視化のこのメソッドでは、オルガンの整合性を維持し、特定のセルの自動定量評価を容易に。...

全体のマウントの蛍光抗体法と培養マウス卵巣の卵胞の定量化

この技術は、種子の異なる領域における細胞、デンプン顆粒およびタンパク質体の観察と分析のための全種サイズの樹脂セクションの迅速かつ簡単な調製を可能にする。...

全種サイズ樹脂断面の簡易ドライ断面化方法とその応用

リンゴパルプ細胞の単離プロトプラストは、細胞質Ca2+...

リンゴパルプでFluo-4/AMで細胞質Ca2+ を染色する

ここでは、ホールマウント免疫染色、多光子顕微鏡、および3D可視化および分析を使用した定量的および定性的な分析のために、卵巣全体をイメージングするための最適化されたプロトコルを紹介します。このプロトコルは、毒物学、臨床診断、および卵巣機能のゲノムアッセイに適用可能な、高スループットで信頼性が高く、再現性のある処理に対応します。...

マウスの発達中の卵巣保護区の定量的3D分析のための全卵巣免疫蛍光、クリアリング、および多光子顕微鏡

このプロトコルは、菌根菌で発芽した植物組織および種子における真菌コロニー形成を研究するために、走査型および透過型電子顕微鏡、光学顕微鏡、共焦点顕微鏡、蛍光顕微鏡などのさまざまな顕微鏡技術を適用して、マイコ従属栄養植物サンプルを収集、固定、および維持するための詳細な手順を提供することを目的としています。...

菌従属栄養植物組織における真菌のコロニー形成と種子の共生発芽を解釈するための顕微鏡技術

この論文では、気孔の発達を制御する遺伝子を特徴付けるために、表皮剥離を使用しない2つの表現型法について説明します。最初の方法は、トルイジンブルーO染色植物表皮を使用して気孔表現型を分析する方法を示しています。2番目の方法は、気孔リガンドを同定し、それらの生物学的活性を監視する方法を説明する。...

表皮表現型スコアリング による 気孔発生に関与する遺伝子の同定

学ぶ 甘いチェリーの卵巣原基における澱粉定量法。画像解析と組織化学的手法を組み合わせ、冬の休眠期の生理活性を評価します。Prunus aviumを用いたこの手法は、他の果樹種への応用も可能です。

染色と冬の休眠中に甘いチェリーの卵巣原基における澱粉を定量化する画像解析を組み合わせた

さらに動画を探す