染色と冬の休眠中に甘いチェリーの卵巣原基における澱粉を定量化する画像解析を組み合わせた
March 20th, 2019
組織化学的手法と組み合わせる画像解析システムを使用して、冬の休眠中に甘果オウトウ (セイヨウミザクラL.) 卵巣原基のデンプン含量を定量化する手法を提案します。
この方法は、なぜ花の芽が適切に花を咲かすために冬の間に寒さを蓄積する必要があるのかなど、木質植物の休眠に関する重要な質問に答えることができます。この技術の主な利点は、花の原始の非常に小さなサンプルでデンプンの定量を可能にすることです。このアプローチは、休眠中に花の原始生の生理活性を検出するのに非常に有用であり、アプリコットや梅のような他の樹種にも適用することができる。
この方法は、休眠花芽への洞察を提供することができますが、受粉から結実の発症までの生殖段階などの他のプロセスにも適用できます。まず、フィールドから5つのシュートを収集します。その後、摂氏4度で少なくとも24時間固定溶液で10ミリリットルのガラス管に10個の花芽を計量して固定します。
この後、固定液を捨て、サンプルをカバーするのに十分な75%エタノールを加えます。長さ15~30センチ、直径5ミリメートル、それぞれ10本の花芽を持つ3つの芽を得る。その後、成長室に水浸し花屋の泡の上に芽を置きます。
成長室で10日後、芽から花芽を取り除き、それらを計量します。毎週秋の初めから春に芽が出るまで、花芽の成長を評価します。各サンプルから外的な芽のスケールを取り除き、75%エタノールを含む時計職人のガラスに各芽を置きます。
芽を解剖し、各芽から少なくとも1つの花のプリモルジウムを得るために精密鉗子と眼科メスを使用してください。サンプルをパラフィンワックスに個別に埋め込んでブロックを形成し、回転ミクロトームに切り離します。サンプルを切り離した後、新鮮なルゴルのヨウ素をセクションに塗布します。
5分後、ブロッティングペーパーで余分な汚れを取り除きます。次に、合成実装メディアの小さな滴を適用し、サンプルの上に小さなカバーガラスを置き、強く押します。取り付け培地が乾燥したら、明視野顕微鏡で染色部を観察します。
まず、テキストプロトコルに従って、絞りダイヤフラムと明るさのコントロールを調整します。フィルターホルダーにフィルターがないことを確認し、顕微鏡で明視野条件を選択します。この後、染色された準備のカメラ設定を組織なしで調整します。
50%で明るさを修正する 次は露出過多/露出過多機能を有効にし、露出超過の限界で露光時間を調整します。ホワイトバランス機能とシェーディング補正を適用します。組織を含まない染色された調製物の得られた白黒画像のグレーレベルを測定する。
次いで、4Nフィルタを適用し、準備の別の白黒画像を取得し、グレーレベルを測定する。次に、同じ調製物の画像を光なしで取得し、得られた画像のグレーレベルを測定し、較正する。その後、少なくとも 300 dpi の解像度で TIFF 形式のサンプル セクションのカラー イメージを取得します。
染色された領域に対応するバイナリイメージを作成し、その後、3つのカラー閾値を設定し、その後、その三つのカラーの画像が、染色されたデンプン顆粒を正確に反映するまで設定します。他の準備および組織とこのプロセスを繰り返して、最終的な検出レベルを微調整します。画像解析システムを用いて、マスク下の各画素の光学濃度の合計を測定し、フィールド内のデンプン含有量を定量化する。
このプロトコルでは、花芽の成長と休眠状態を、適当な条件で10日後の芽重量の増加を測定することによって評価した。休眠中、適切な条件で10日後に変化は認められない。休眠状態が克服されると、芽が膨らみ、成長室で破裂しました。
卵巣プリモジウム中のデンプン含有量を、各マイクロトム化されたセクションの画像解析を介して定量した。一貫して、初冬のデンプンの量は、40,000未満の光学密度値を提示し、最大量は、研究の両方の年の間に120、000と140,000の間の値に達しました。休眠状態を考慮すると、デンプンの最大量は、両方の年の間に冷たいフルフィルメントと一緒に発生しました。
イメージアナライザで使用される検出レベルは、システムのキャリブレーションに直接依存することを覚えておくことが重要です。これには、光の状態、染色強度、および顕微鏡の倍率が含まれます。この条件は、すべての準備のために修正する必要があります。
細胞化学技術と画像解析の組み合わせは、休眠の異なる段階で花の原始の炭水化物の予備を調べるのに非常に有用である。また、他の種や組織にも適用できます。この方法を用いて明らかにした卵巣プリモディアにおける休眠放出と澱粉蓄積との関係は、休眠および冷え込み条件の生物学的基礎を理解するための健全な基礎を提供する。
将来の努力は、簡単に木の休眠状態を示すことができる信頼性の高い生物学的指標を研究することに焦点を当てる必要があります。一方、休眠状態に沿ったデンプンのバリエーションのパターンは、さらなる生理学的および遺伝的研究を枠組みにするために使用することができる。
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概要
この研究は、冬季休眠中のスイートチェリー（Prunus avium L.）の子房原基におけるでんぷん含有量を定量化する方法論を提示します。この方法は、生理活性を評価するために画像分析と組織化学的技術を組み合わせています。
研究の主要構成要素
科学の分野
- 植物生理学
- 植物学
- 園芸学
背景
- 木本植物の休眠を理解することは園芸実践にとって重要です。
- 花芽は適切な開花を確保するために冬の間に寒さを蓄積します。
- でんぷんの定量化は花の原基における生理活性を明らかにします。
- この方法はアプリコットやプラムなどの他の樹種にも適用できます。
研究の目的
- 花の原基の小さなサンプルでのでんぷんを定量化すること。
- 休眠期間中の生理活性を調査すること。
- 受粉から結実までの生殖段階に関する洞察を提供すること。
使用した方法
- フィールドから5本の枝を採取すること。
- 10個の花芽を固定液で固定し、重量を測定すること。
- 少なくとも24時間、4度セルシウスでインキュベーションすること。
- 組織化学的技術と組み合わせた画像分析。
主要な結果
- この方法は非常に小さなサンプルでのでんぷん定量化を可能にします。
- 休眠期間中の花の原基の生理活性を検出します。
- 得られた洞察は樹種の他のプロセスにも適用できます。
- 潜在的な応用は開花植物の生殖段階にまで及びます。
結論
- この方法論はスイートチェリーの休眠理解を深めます。
- 木本植物の生理プロセスを研究するための貴重なツールを提供します。
- 将来の研究は他の種や段階への応用を拡大できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Quantifying starch in small biological structures enables mechanistic de-risking of dormancy-related pathways in plant systems. This approach supports target validation by linking physiological activity to developmental transitions. The method provides predictive confidence for seasonal growth regulation in woody perennials.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by correlating starch accumulation with dormancy release in flower primordia.
- Operational Value: Enables biological de-risking through quantitative assessment of carbohydrate reserves in small tissue samples.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying chilling fulfillment as a key trigger for budburst.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by standardizing starch detection via image analysis.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility through fixed calibration of light conditions, stain intensity, and magnification.
- Scalability: Facilitates platform reuse across tree species such as apricot and plum for comparative dormancy studies.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase starch quantification to reproductive phases from pollination to fruiting.
- Mechanistic De-risking: Links starch dynamics to dormancy status, enabling risk-adjusted advancement decisions in physiological studies.
- Biomarker Alignment: Uses starch content as a translatable indicator of bud dormancy and chilling requirement fulfillment.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology by enabling hypothesis testing on dormancy mechanisms through quantitative starch measurement in ovary primordia.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by measuring starch as a readout of physiological activity during dormancy.
- Screening: Delivers assay readiness via standardized image analysis that distinguishes starch from background in microtomed sections.
- Analytics: Provides quantitative optical density outputs that allow comparison of starch content across dormancy phases.
- Translational Research: Connects dormancy release to fruiting onset through starch variation patterns applicable to genetic and physiological studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for starch quantification in small floral structures across perennial species.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in dormancy mechanisms, reduction of mechanistic ambiguity in bud development.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of starch quantification across species and seasons.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions in physiological studies, capital efficiency in dormancy research, reduced late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of chilling requirement studies based on starch accumulation thresholds.
Implementation Considerations
- Requires expertise in histochemical staining, microtomy, and image analysis systems.
- Dependent on brightfield microscopy with calibrated camera settings and fixed illumination conditions.
- Necessitates cross-team standardization of staining protocols and binary image thresholds for starch detection.
- Adaptation considerations include tissue fixation, embedding, and sectioning consistency across plant species.
- Practical limitation: Detection levels are dependent on system calibration and must be fixed for all preparations to ensure comparability.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:46
Dormancy Determination and Plant Material Collection
1:49
Plant Material Preparation for Starch Quantification
3:07
Quantification of the Starch Content
5:10
Results: Flower Bud Growth and Dormancy Evaluated after 10 Days in Suitable Conditions
6:10
Conclusion
