Name: MeshAndCollect を使用して蛍光タンパク質セルリアンの構造解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 42 s
Description: 学ぶ MeshAndCollect プロトコルを用いた蛍光タンパク質Ceruleanの構造解析法。シリアル結晶学と回転データ収集を組み合わせ、小さな結晶から完全な回折データセットを取得し、構造決定を効率化します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ESRF 社内研究プログラムを通じてビーム時間を提供するために感謝いたします。

1 セルリアンの発現と精製
注: これは Lelimousinらによって公開されたプロトコルに基づいて、21
<ol><li>エシェリヒア属大腸菌 BL21 セル外径 φ600まで自動誘導中23の 4 L で 37 ° C で成長の彼の付けられたセルリアンの表現 = 1 とし、27 ° C で一晩インキュベート</li>
	<li>5,000 × gで細菌の細胞を収穫し、超音波で細胞を溶解 (40%、5 分、10 秒パルス、10 秒の一時停止) の 20 mM Tris pH 8.0、500 mM の NaCl と EDTA 無料プロテアーゼ阻害剤 × 1 で構成されるバッファーの 200 mL の。</li>
	<li>彼トラップ Ni NTA 列に上清を読み込み、同じバッファー条件で 100 mM のイミダゾールとセルリアンを溶出します。</li>
	<li>明るい黄色着色された分数をプールします。タンパク質は色は本質的に、それゆえセルリアン含む画分がわかりやすい。</li>
	<li>20 mM Tris pH 8.0 の S75 列に (4 mL) の蛋白質を浄化します。</li>
	<li>明るい黄色の分数をプール、15 mg/mL に蛋白質の解決を集中します。</li>
</ol>2. 結晶化
<ol><li>ハンギング ドロップ蒸気拡散法24で Linbro プレート 20 ° C。100 mM HEPES 12 %peg8000 及び 100 mM MgCl 6.75、ph から成る沈殿溶液 1 mL と井戸を埋める2.ハングの低下、蛋白変性溶液 1 μ L と 15 mg/mL に集中して 1 μ L を混在させます。結晶は、24 h で表示されます。</li>
	<li>得られた結晶と 0.1 M HEPES pH 6.75、22% から成るシード バッファーの 100 μ L には 8000 をペグ転送を収穫します。</li>
	<li>結晶を 0.1 mL 組織グラインダーで挽くし、バッファー (比率 1: 100) の播種で希釈します。</li>
	<li>1 h (1:10 (v/v)) のトリプシン (同じバッファーに 0.5 mg/mL) 蛋白質原液 (15 mg/mL) の因数を消化します。</li>
	<li>消化されたタンパク質溶液を混ぜて 10% の種を含むバッファー (v/v)。</li>
	<li>結晶を成長させる (10 * 10 * 20 μ m3) 14% 止め釘の 8000、0.1 M HEPES pH 7 で 0.1 MgCl2 1 1.5 μ ハンギング ドロップ蒸気拡散法を用いたします。</li>
</ol>3. 結晶のマウント
<ol><li>例えば、脊椎標準試料ホルダー25にマウントされている各 25 μ m のメッシュ ループ 700 角穴適切なループを使用してください。凍結溶液 (グリセロール (最終 20% (v/v)) を混ぜても沈殿溶液) の 1 μ L に結晶化ドロップ (ステップ 2.6) から結晶を転送します。</li>
	<li>結晶の下のループを移動し、ドロップダウンからそれらを持ち上げるメッシュ ループに蛋白質結晶スラリーをマウントします。理想的に結晶は 5 μ m-のループ マウント結晶も重なり最大寸法で 30 μ m の大きさの範囲にする必要があります。</li>
	<li>ろ紙をすぐにマウントを触れることにより、余分な液体を放出します。堆積物、結晶、できるだけ少しのバルク液体に囲まれたループの平面に座る。</li>
	<li>マウントを液体窒素の完全 unipuck に突入します。ビームタイムが利用可能になるまで、適切なストレージ コンテナーで 100 K でパックを格納します。</li>
</ol>4 放射光実験のオフラインの準備
注: できるだけ早く放射光ビーム時間を要求し、利用可能なアクセスの種類および特定放射光のアプリケーションを提出する方法についてオンラインのガイドラインに従ってください。ESRF ガイドラインは、http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Applying で見つけることが。ESRF ブロック アロケーション グループ (袋) のメンバー、各プロジェクト固有のアプリケーションは必要ありません。この場合は実験者ビームタイムのスケジューリングに関する彼らのバッグ担当に近づきます。
<ol><li>提案が受け入れられるし、実験のための招待状を受け取った、安全訓練を完了するすべての参加者があります。「A フォーム」(を介してESRF ユーザー ポータル, http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/new-a-form) サンプルに必要な安全情報を入力します。実験を説明するローカルの担当者にお問い合わせください。一度あなたの A フォームがサブミットされ、検証実験番号とパスワードそれ与えるでしょう。</li>
	<li>拡張 ISPyB26 (http://www.esrf.fr/) に接続し、 MXを選択します。</li>
	<li>実験番号と A フォームからパスワードでログインします。</li>
	<li>貨物を選択 |新規追加、要求された情報を入力します。</li>
	<li>追加区画を選択し、関連するデータを入力します。追加のコンテナーを選択して、unipuck をパックに試料ホルダーの位置を含む、必要な情報を入力します。</li>
</ol>5. ビームラインにサンプルの読み込み
<ol><li>実験ハッチ内検体チェンジャー (SC) にパックを読み込むデュワーとその位置に注意してください。</li>
	<li>実験のキャビンを連動して制御ハッチを入力します。</li>
	<li>ISPyB (https://esrf.fr/) にログインします。実験の準備を選択、出荷を検索、次選択およびビームラインおよび SC のパックの位置を示す</li>
	<li>ログイン ビームライン制御ソフトウェア、ここに MXCuBE227,28数値実験と A フォームで提供されるパスワードを使用します。<ol>
<li>ISPyB データベースとビームライン制御ソフトウェアを同期する同期を押してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ビームライン制御ソフトウェアを使う、ゴニオメータにサンプル ホルダーをマウントします。MXCuBE2、サンプル チェンジャー領域内の位置を右クリックし、マウントのサンプルを選択します。</li>
	<li>活用してインストール MK3 ミニ カッパ計29せいぜい ESRF MX ビームラインの MXCuBE2 の「視覚的再編」ワークフローにを使用30ゴニオメータ回転の軸と試料ホルダー面を揃えます。<ol>
<li>ループの先端のエッジの中央に、3 をクリックしてセンターのセンターボタンを選択します。中心の位置を保存を選択して保存します。</li>
		<li>その 3 [センター ループの幹の開始の中センターボタンを再度クリックします。保存をクリックしても 2 番目の位置を保存します。</li>
		<li>それをクリックして保存の中心位置のいずれかを選択します。</li>
		<li>詳細設定の下には、MxCuBE2 データ コレクション キューにワークフローの視覚的方向転換を追加します。</li>
		<li>収集キューをクリックして、ワークフローを起動します。</li>
		<li>ワークフロー後、ゴニオ メーター、センター サンプル ホルダーを再び、今回はメッシュの途中でどこかの回転の軸と試料ホルダー面を揃えます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>メッシュの顔が MXCuBE2 を使用してオメガ軸を回転させることにより x 線ビーム方向に垂直なサンプル ホルダーに合わせます。</li>
	<li>MXCuBE2、(のみのサイズが可変ビーム ビームライン) サンプル ホルダーのスキャンに必要な梁サイズを選択します。<ol>
<li>絞りビームライン制御ソフトウェアのメニュー ドロップダウンをクリックし、値、例えば10 μ m を選択します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>メッシュ スキャンのメッシュを定義します。<ol>
<li>MXCuBE2 のメッシュ ツール アイコンをクリックします。メッシュ ツール ウィンドウが表示されます。</li>
		<li>MXCuBE2 のサンプル ビューで左クリックして、サンプル ホルダーに結晶を含む領域の上にマウスをドラッグしてメッシュを描画します。</li>
		<li>保存メッシュ ツール ウィンドウでプラスのボタンをクリックして、メッシュ (メッシュが緑になる)。</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 準備して MeshAndCollect ワークフローを実行
<ol><li>MXCuBE2 の [解像度] フィールドに、解像度 (d分) の回折で画像を収集する必要があります、例えば、ここの 1.8 Å を入力します。</li>
	<li>データ コレクションの詳細設定] タブでMeshAndCollect 、それをキューに追加し、収集 、 キューをクリックします。</li>
	<li>表示されるパラメーター ウィンドウでビームライン依存の既定のパラメーターを使用します。実験で説明した既定値のパラメーターは、メッシュのスキャン ポイント、100% 伝送 (この場合は 4 × 1011 ph/s につながる)、メッシュ走査線あたり 1 ° 振動 0.037 秒露光時間。</li>
	<li>Continueをクリックします。メッシュのスキャンが実行され、各グリッド ポイントで収集された回折像の分析およびソフトウェア DOZOR1回折強度に応じてランク付け。このプロセスは、バック グラウンドで実行されます。</li>
	<li>DOZOR 解析後ヒート マップが生成され、その後の部分的なデータ コレクションの注文が回折強度に基づいて自動的に割り当てられます (図 1参照)。 注: この手順の結果は、ISPyB でも検査できます。ビームライン制御ソフトウェアの設定と新しいタブがポップアップ部分のデータ セットのコレクション、回転範囲 (すなわち、 0.1 °)、イメージ (すなわち100) の数、露光時間、解像度、伝送、適切な値を選択します。逆梁など理想的に収集するウェッジは、それぞれの線量は、・ ガーマン制限 (30 MGy) 以下でなければなりません。画像あたりのおおよその露出時間は 0.037 0.1 s 説明実験条件で s。</li>
	<li>一部のデータ コレクションを開始する続行をクリックします。</li>
</ol>7 データ処理
注: 一部のデータ セットは、適切なプログラム (XDS10) と統合されます。このため、Python スクリプトはそれぞれ個々 のデータ セットを認識し、それを統合、異なる部分データのインデックスが一貫性のあることを確認する使用されます。
<ol><li>画像を含むフォルダーを開く:/data/visitor/mxXXXX/beamline_name/date/RAW_DATA/Cerulean。</li>
	<li>部分のデータ セットを収集する場所フォルダーで見つけることができますプロセス サブフォルダーの安全性のコピーを作成します。<ol>
<li>Linux ターミナル コマンドcp-r プロセス process_backupを使用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>プロセス フォルダーに移動し、処理スクリプトを起動します。<ol>
<li>Linux ターミナルのコマンドcd プロセスを入力してエンターキーを押します。</li>
		<li>型procMultiCrystalDataとヒットを入力します。 注: スクリプト、空間群を求める、セル パラメーター (この情報は省略可能)、指示に従って入力します。最後のユーザー確認後スクリプトが自動的に実行されます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. データ セットのマージ
注: すべての部分的なデータ セットを統合後、構造決定、絞り込み用の最終データ セットを生成するそれらの最適な組み合わせがマージされます。この統合プロセスの別の目的は (強く推奨) における完全性、高い多様性または最高のデータの統計を取得することができます (高 < I/σ(I) > 低 R 要因、等)。後者がある多様性および/または完全性を犠牲にして注意してこのオプションを選択する必要がありますので。
<ol><li>プログラム ccCluster14を使用して部分的なデータ セットをマージします。階層的クラスター分析 (HCA) を使用して同形の部分的なデータ セット () の可能な組み合わせを決定します。<ol>
<li>そのグラフィカル ユーザー インターフェイス (GUI) を開くには Unix のターミナルにccClusterを入力します。 注: ccCluster GUI でデンドロが描画されます。これは、それらの間の同型性に基づく部分的なデータ セットが最高マージどの提案を与えます。</li>
		<li>約 0.4 垂直軸上の値に対応するノードをクリックします。一般に、高い値のセットは、悪い部分のデータ セットが少ない同形になるよう統計情報をマージにつながる複数の部分のデータが含まれます。</li>
		<li>データを結合をクリックします。バック グラウンドで選択したクラスターが処理され、推定結合統計が GUI で新しいタブに表示されます。データ セットのさまざまな組み合わせのため、この手順を繰り返すことができます。部分データ セットの良い組み合わせの完全性に近くなるはず < I/σ(I) > 100% 高の値 (最低解像度シェル 10 以上) と R 測定31値低い (低解像度シェルで約 5%)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>選択された各組み合わせ単一 mtz ファイル (すなわち、無意味な32) に選ばれた部分のデータ セットをマージするのには生成された入力スクリプトを使用します。</li>
	<li>決定的にスケール スケーリング プログラム (すなわち、あてのない32) を使用してこのファイルの強度データをマージし、アプリケーションとして単結晶データ コレクションからファイルに出力を使用以降段階的に廃止と構造ソリューション33.</li>
</ol>

<ol><li>Zander, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MeshAndCollect%3A+an+automated+multi-crystal+data-collection+workflow+for+synchrotron+macromolecular+crystallography+beamlines%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (11), 2328-2343 (2015).</li>
<li>Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-Protection+of+Protein+Crystals+against+Radiation+Damage+in+Electron+and+X-Ray+Diffraction%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cryo-Protection of Protein Crystals against Radiation Damage in Electron and X-Ray Diffraction.</a> Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 241 (1300), 6-8 (1990).</li>
<li>Chapman, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femtosecond+X-ray+protein+nanocrystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Femtosecond X-ray protein nanocrystallography.</a> Nature. 470 (7332), 73-77 (2011).</li>
<li>Schlichting, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+femtosecond+crystallography%3A+the+first+five+years%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Serial femtosecond crystallography: the first five years.</a> IUCrJ. 2 (2), 246-255 (2015).</li>
<li>Stellato, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Room-temperature+macromolecular+serial+crystallography+using+synchrotron+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Room-temperature macromolecular serial crystallography using synchrotron radiation.</a> IUCrJ. 1 (4), 204-212 (2014).</li>
<li>Gati, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+crystallography+on+in+vivo+grown+microcrystals+using+synchrotron+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation.</a> IUCrJ. 1 (2), 87-94 (2014).</li>
<li>Coquelle, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raster-scanning+serial+protein+crystallography+using+micro-+and+nano-focused+synchrotron+beams%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Raster-scanning serial protein crystallography using micro- and nano-focused synchrotron beams.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (5), 1184-1196 (2015).</li>
<li>Diederichs, K., Wang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+Synchrotron+X-Ray+Crystallography+%28SSX%29%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Serial Synchrotron X-Ray Crystallography (SSX).</a> Protein Crystallography. 1607, 239-272 (2017).</li>
<li>Borshchevskiy, V. I., Round, E. S., Popov, A. N., Büldt, G., Gordeliy, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray-Radiation-Induced+Changes+in+Bacteriorhodopsin+Structure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">X-ray-Radiation-Induced Changes in Bacteriorhodopsin Structure.</a> Journal of Molecular Biology. 409 (5), 813-825 (2011).</li>
<li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XDS%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">XDS.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).</li>
<li>Winter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DIALS+implementation+and+evaluation+of+a+new+integration+package%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">DIALS implementation and evaluation of a new integration package.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 74 (2), 85-97 (2018).</li>
<li>Winter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((xia2%3A+an+expert+system+for+macromolecular+crystallography+data+reduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">xia2: an expert system for macromolecular crystallography data reduction.</a> Journal of Applied Crystallography. 43 (1), 186-190 (2010).</li>
<li>Monaco, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+processing+of+macromolecular+crystallography+X-ray+diffraction+data+at+the+ESRF%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Automatic processing of macromolecular crystallography X-ray diffraction data at the ESRF.</a> Journal of Applied Crystallography. 46 (3), 804-810 (2013).</li>
<li>Santoni, G., Zander, U., Mueller-Dieckmann, C., Leonard, G., Popov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+clustering+for+multiple-crystal+macromolecular+crystallography+experiments%3A+the+ccCluster+program%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Hierarchical clustering for multiple-crystal macromolecular crystallography experiments: the ccCluster program.</a> Journal of Applied Crystallography. 50 (6), 1844-1851 (2017).</li>
<li>Zander, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merging+of+synchrotron+serial+crystallographic+data+by+a+genetic+algorithm%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Merging of synchrotron serial crystallographic data by a genetic algorithm.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (9), 1026-1035 (2016).</li>
<li>Foadi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clustering+procedures+for+the+optimal+selection+of+data+sets+from+multiple+crystals+in+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Clustering procedures for the optimal selection of data sets from multiple crystals in macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69 (8), 1617-1632 (2013).</li>
<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Green+Fluorescent+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The Green Fluorescent Protein.</a> Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 509-544 (1998).</li>
<li>Heim, R., Prasher, D., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wavelength+mutations+and+posttranslational+autoxidation+of+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (26), 12501-12504 (1994).</li>
<li>Cubitt, A. B., Woollenweber, L. A., Heim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+2%3A+Understanding+Structure-Function+Relationships+in+the+Aequorea+victoria+Green+Fluorescent+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Chapter 2: Understanding Structure-Function Relationships in the Aequorea victoria Green Fluorescent Protein.</a> Methods in Cell Biology. 58, 19-30 (1998).</li>
<li>Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+cyan+fluorescent+protein+variant+useful+for+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET.</a> Nature Biotechnology. 22 (4), 445-449 (2004).</li>
<li>Lelimousin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+Dynamics+in+ECFP+and+Cerulean+Control+Fluorescence+Quantum+Yield%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Intrinsic Dynamics in ECFP and Cerulean Control Fluorescence Quantum Yield.</a> Biochemistry. 48 (42), 10038-10046 (2009).</li>
<li>Gotthard, G., von Stetten, D., Clavel, D., Noirclerc-Savoye, M., Royant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromophore+Isomer+Stabilization+Is+Critical+to+the+Efficient+Fluorescence+of+Cyan+Fluorescent+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Chromophore Isomer Stabilization Is Critical to the Efficient Fluorescence of Cyan Fluorescent Proteins.</a> Biochemistry. 56 (49), 6418-6422 (2017).</li>
<li>Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+by+auto-induction+in+high+density+shaking+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Protein production by auto-induction in high density shaking cultures.</a> Protein Expression and Purification. 41 (1), 207-234 (2005).</li>
<li>Rhodes, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRhodes%2C+G+%22Crystallography+made+crystal+clear%3A+a+guide+for+users+of+macromolecular+models%22">Crystallography made crystal clear: a guide for users of macromolecular models</a>. , Elsevier/Academic Press. Amsterdam; Boston. (2006).</li>
<li>Cipriani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automation+of+sample+mounting+for+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Automation of sample mounting for macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 62 (10), 1251-1259 (2006).</li>
<li>Delageniere, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ISPyB%3A+an+information+management+system+for+synchrotron+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography.</a> Bioinformatics. 27 (22), 3186-3192 (2011).</li>
<li>Gabadinho, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MxCuBE+a+synchrotron+beamline+control+environment+customized+for+macromolecular+crystallography+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Synchrotron+Radiation%22%5BJournal%5D)">MxCuBE a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700-707 (2010).</li>
<li>De Santis, D., Leonard, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notiziario+Neutroni+e+Luce+di+Sincrotrone%5BTitle%5D)+AND+%22Consiglio+Nazionale+delle+Ricerche%22%5BJournal%5D)">Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone.</a> Consiglio Nazionale delle Ricerche. , (2014).</li>
<li>Brockhauser, S., Ravelli, R. B. G., McCarthy, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+a+mini-%CE%BA+goniometer+head+in+macromolecular+crystallography+diffraction+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">The use of a mini-κ goniometer head in macromolecular crystallography diffraction experiments.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69 (7), 1241-1251 (2013).</li>
<li>Brockhauser, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+workflows+in+the+design+and+implementation+of+complex+experiments+in+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">The use of workflows in the design and implementation of complex experiments in macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68 (8), 975-984 (2012).</li>
<li>Diederichs, K., Karplus, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+R-factors+for+diffraction+data+analysis+in+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Improved R-factors for diffraction data analysis in macromolecular crystallography.</a> Nature Structural Biology. 4, 269(1997).</li>
<li>Evans, P. R., Murshudov, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+good+are+my+data+and+what+is+the+resolution%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">How good are my data and what is the resolution?</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 69 (7), 1204-1214 (2013).</li>
<li>Taylor, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+phasing%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Introduction to phasing.</a> Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (4), 325-338 (2010).</li>
<li>Karplus, P. A., Diederichs, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+Crystallographic+Model+and+Data+Quality%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Linking Crystallographic Model and Data Quality.</a> Science. 336 (6084), 1030-1033 (2012).</li>
<li>Dimper, R., Reichert, H., Raimondi, P., Ortiz, L. S., Sette, F., Susini, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ESRF+upgrade+programme+phase+II+%282015+-+2022%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+orange+book%22%5BJournal%5D)">ESRF upgrade programme phase II (2015 - 2022).</a> The orange book. , (2015).</li>
</ol>

著者がある何も開示するには

MX 実験の成功は、通常よく結晶を回折比較的大きいの存在に依存します。プロジェクトはより大きい水晶の小さなクリスタル シャワーから最適化が失敗した場合、MeshAndCollect は構造ソリューションを介して完全な回折データセットの収集した同形の部分的なデータ セットの組み合わせを獲得する可能性を提供します。小さな結晶のシリーズ。メソッドは、理想的に高い光フラックスと最先端の回折デバイスと高速読み出し検出器搭載小型ビーム径、MX 用放射光ビームラインと互換性が。このようなエンド ステーション、そのような実験のデータ コレクションの一部を収集する部分のデータ セットの数と分析する結晶を含む試料ホルダーの数に応じて、約 20 分かかります。
MeshAndCollect 実験の成功の最も重要な前提条件に十分な数の存在である (少なくとも 50、100 理想的に) 回折試料ホルダーの位置の。経験から分析する結晶の最小サイズは最小の寸法で約 5 μ m をする必要があります。標準的な低温冷却対応の任意の種類と互換性のあるメソッド サンプル ホルダー剛性、まっすぐでマウントをメッシュを使用して達成されている最高の結果を。
ESRF で MeshAndCollect、MXCuBE2 ビームライン制御ソフトウェアから利用できます Passerelle (http://isencia.be/passerelle-edm-en) ワークフロー30でユーザーフレンドリーな方法で実装されます。他 SX 方法と比べて MeshAndCollect の主な利点は標準的なプログラムで収集されたデータを処理できることと単結晶 MX 用パイプラインを自動化します。
私たちの例を示しています、MeshAndCollect を適用する非常に簡単です、一連の部分的な回折データ セット、通常構造ソリューションで使用する完全なデータのセットを生成する結合することができます小さな結晶から収集に 。また、MeshAndCollect は、最後の最適化ステップ、大型結晶の生産が成功した結晶化試験から使用可能なデータを収集する方法を提供するので蛋白質の結晶学のサンプリング領域を開く可能性を秘めています。
明るい x 線源 (例えば、非常に華麗なソース (EBS) プロジェクト/ESRF35) に向かって現在の開発の光の中でそれは増加の照射損傷のため多結晶データ コレクションの種類が容易に予見可能ですケース - MX の放射光のビームラインでは、現在、MeshAndCollect では-例外ではなく、データ コレクションの標準のメソッドになります。

生体高分子 x 線結晶構造解析 (MX) は、はるかに、生体高分子の立体構造を原子分解能レベルの洞察力を得るための最もよく使われる方法です。ただし、主要なびんの首は比較的大きい、よく回折結晶の要件です。
多くの場合と特にとき膜蛋白質の結晶化、最大寸法は数ミクロンの非常に小さな結晶を得ることができます。マイクロ結晶2, と非常に頻繁に効果制限完全な回折データの解像度を設定するを収集できる照射損傷、信号対雑音比を改善する必要があるし、データがいくつかをマージすることによって、解像度を設定するため異なるが、同型の結晶から部分的な回折データを設定します。非常に小さい結晶生物から有用な部分回折データ セットを集めることができる x 線ビーム放射光と他の場所 (例えばx 線自由電子レーザー (X FELs)) の磁束密度の増加を意味しています。高分子。これは順番に、コレクションの新しい技術の開発につながっているし、構造解析のための完全なデータのセットを生成するために多くの異なる結晶から収集部分回折データ セットのマージします。このようなテクニックは、シリアルの結晶構造解析 (SX)3,4,5,6,7,8と呼ばれます。SX の典型的な例は、x 線ビーム3,4,5に結晶スラリーの狭いストリームを導入するインジェクター デバイスの使用です。回折パターンは、結晶は 'まだ' 回折像の完全なデータのセットを生成する、マージは情報の個々 の結晶の数千から、コレクションに至る x 線にさらされるたびに記録されます。ただし、このタイプのシリアル ・ データ コレクションのかなりの不利はまだ画像の処理が問題となります。結晶を回転することができますおよび/またはいくつかの回折像はシリアル結晶学実験6中に同じ結晶から収集される場合、データの品質がかなり向上しました。
MeshAndCollect1 '標準' MX 回転データ コレクションと SX を組み合わせることを目的に開発されたことができ、自動の方法で同じ高分子ターゲットの多数の結晶から部分的な回折データ セットを収集するために実験者同じまたは異なるサンプル ホルダーにマウントされています。完全な回折データ セットを収集部分のデータ セットの中で最も同形を結合して計算します。MeshAndCollect MX のすべての最新の放射光 x 線ビームラインと互換性のある (理想的には比較的小さいとの挿入デバイス施設 (20 μ m 以下) サイズ サンプル位置をビーム)。小さい、よく回折結晶のシリーズから完全なデータ セットのコンパイルに加えメソッドは微結晶の回折品質の初期の実験的評価と不透明なサンプルの処理に非常に適しているもメソで例えば、膜蛋白質9の微結晶を成長しました。
MeshAndCollect 実験の先頭位置を 2 つの次元、単一試料ホルダーに含まれる多くの結晶の各は、低線量 x 線スキャンを使用して決定されます。このスキャン中に収集された回折像は、彼らのそれぞれの回折強度によると試料ホルダーに結晶の位置を並べ替えます DOZOR1、プログラムによって自動的に分析されます。部分的なデータ セットのコレクションの位置、回折強度カットオフに基づいて自動的に割り当てられます、最後のステップで、回転、通常 ± 5 ° の回折データの小さなくさびは、各選択した位置から収集されます。この回転域が可能な水晶センタリング問題とで複数の結晶を公開する機会を減らすこと、同時に一方の目的をスケーリング データ セットの一部を結晶あたり反射の十分な量を提供することがわかっています、特に混雑しているサポート1。個々 の回折データ ウェッジ (部分的なデータ セット) は、その後いずれかを手動で処理または自動データ処理を用いたパイプライン10、11,12,13。下流の構造を決定するため後結果の完全なデータ セットを同じ方法で扱うことができる結合された14,15,16部分のデータ セットの最適な組み合わせを見つける必要があるし単結晶由来の 1 つとして試してみてください。
実際に MeshAndCollect の例としてご紹介してシアン蛍光蛋白質 (CFP) セルリアンの結晶構造のソリューションのシリーズから収集した部分のデータ セットの組み合わせから構築された回折データ セットを使用して微結晶は、同じサンプルのサポートにマウントされています。セルリアンはクラゲオワンクラゲ17、その蛍光発色団は 3 つの連続したアミノ酸残基の閉環反応から形成される autocatalytically から緑色蛍光タンパク質 (GFP) から設計されています。セルリアンはそれぞれ発色団、セリン、チロシン、トレオニン (S65T)、トリプトファン (Y66W) の最初と 2 番目の残基を変更し (Y145A、N146I、H148D、M153T さらに変異を持つ発色団環境を適応して GFP から取得します。V163A) QY の重要なまだ最適な蛍光レベルを生成する = 0.4918,19,20。タンパク質21 11 β 繊維の 1 つの不完全な安定化を含む複雑なタンパク質ダイナミクスと 2 つの異なる発色団の宿泊施設にリンクするセルリアンの最適な蛍光特性が提案されています。pH と照射条件22によって異性体。セルリアンに MeshAndCollect プロトコルの使用を示すモデル タンパク質として働くことを選んだ私たち、比較的結晶化によって結晶サイズのチューニングのしやすさ。セルリアンの構造は、その親蛋白質 GFP の構成として β バレル型形成周囲の α ヘリックス、発色団を担う 11 の β ストランドに非常に似ています。

<table><tbody><tr><td>ビームライン</td><td>ESRF ID 23-1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>濃縮装置: Amicon Ultra-4 Ultracel -30K</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC803024</td><td></td></tr><tr><td>Crystallization plates XDXm with sealant</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-306</td><td></td></tr><tr><td>EDTA- free protease inhibitors</td><td>Roche</td><td>4,693,159,001</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli BL21 (DE3)</td><td>Life Technologies Thermo Fisher科学</td><td>C600003</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>VWR 化学薬品 Prolabo</td><td>14388.29T</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Euromedex</td><td>10-110-C</td><td></td></tr><tr><td>ヒストラップ HP</td><td>GE ヘルスケア</td><td>17-5247-01</td><td></td></tr><tr><td>イミダゾール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56750-500G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>13452-1KG</td><td></td></tr><tr><td>MicroMeshes 700/25</td><td>MiTeGen</td><td>SKU:&nbsp;M3-L18SP-25L</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td>フィ<td>ッシャーケミカル</td><td>S / 3160/60</td><td></td></tr><tr><td>PEG8000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5413-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sonicatorビブラセル75/15</td><td>SONICS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superdex 75 10/300 -GL</td><td>GEヘルスケア</td><td>17-5174-01</td><td></td></tr><tr><td>Trisベース</td><td>Euromedex</td><td>26-128-3094-B</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9201-1G</td><td></td></tr><tr><td>ユニパック</td><td>分子寸法</td><td>MD7-601</td><td></td></tr><tr><td>名</td><td>会社名</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Programs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ISPyB</td><td>ESRF</td><td>ソランジュ・デラゲニ&エグレイブ;re、パトリス・ブランシュロー、ルドヴィック・ラウナー、アルン・W・アシュトン、リカルド・レアル、セント・イークチュート;phanie Veyrier、Jos&eacute;ガバジーニョ、エルズペス・J・ゴードン、サミュエル・D・ジョーンズ、カール・エリック・レヴィック、Se&aacute;n M. McSweeney, St&eacute;ファニー・モナコ、マックス・ナナオ、ダレン・スプルース、オロフ・スヴェンソン、マーティン・A・ウォルシュ、ゴードン・A・レナード;ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography, バイオインフォマティクス, Volume 27, Issue 22, 15 November 2011, Pages 3186&ndash;3192、https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btr535</td><td>地域開発</td></tr><tr><td>目的のない</td><td>MRC分子生物学研究所</td><td>エバンス、PR、Murshudov、GN私のデータはどれくらい良く、解像度はどれくらいですか?Acta Crystallographica セクション D 生物学的結晶学.<強い>69</強い>(7)、1204&ndash;1214、土井:10.1107 / S0907444913000061(2013)。</td><td></td></tr><tr><td>ccCluster</td><td>ESRF</td><td>Santoni, G., Zander, U., Mueller-Dieckmann, C., Leonard, G., Popov, A. Hierarchical clustering for multiple-crystal macromolecular crystallography experiments: the ccCluster program. Journal of Applied Crystallography. 50 (6), 1844&ndash;1851年、DOI:10.1107 / S1600576717015229(2017)。</td><td>ローカル開発</td></tr><tr><td>DOZOR</td><td>ESRF</td><td>Bourenkov and Popov, 未発表</td><td>のローカル開発</td></tr><tr><td>MeshAndCollect ワークフロー</td><td>ESRF</td><td>Zander, U. et al. MeshAndCollect: シンクロトロン高分子結晶学ビームラインのための自動化された多結晶データ収集ワークフロー. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (11), 2328&ndash;2343、土井:10.1107 / S1399004715017927(2015)。</td><td>ローカル開発</td></tr><tr><td>MXCuBE2</td><td>ESRF</td><td>Gabadinho, J. et al. MxCuBE: 高分子結晶学実験用にカスタマイズされたシンクロトロンビームライン制御環境 Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700&ndash;707、土井:10.1107 / S0909049510020005(2010)。デサンティス、D.、レナード、G. Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone、Consiglio Nazionale delle Ricerche。(19)、24&ndash;226(2014年)。</td><td>ローカル開発</td></tr><tr><td>XDS</td><td>Max-Planck-Institut f&uuml;r Medizinische Forschung</td><td>Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125&ndash;132, doi: 10.1107/S0907444909047337 (2010年)</td><td></td></tr></tbody></table>

meshandcollect を使用して蛍光タンパク質セルリアンの構造解析

Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect

X 線結晶構造解析は、生体高分子の立体構造に関する高解像度情報を取得するために使用する主要な手法です。最近まで、主要な要件は比較的大きいのも入手するは困難が多い結晶を回折可用性をされています。ただし、シリアル結晶の出現、多結晶データ収集方法のルネッサンスを意味している大きな結晶の可用性は制限要因をできなく必要があります。ここでは、まず同じサンプル ホルダーにマウントされている多くの小さい水晶の位置を識別し、一連の部分的な回折データ セットの結晶からコレクションを指揮して自動の MeshAndCollect プロトコルの使用を示す後で統合、構造の決定で使用。MeshAndCollect は、たとえ弱い回折微結晶の任意の型に適用できます。例として、我々 現在ここのシアン蛍光蛋白質 (CFP) セルリアンの結晶構造を解明する技術の使用。

MeshAndCollect、MXCuBE2 に実装されている (図 1A参照)、結晶の視覚的な識別が困難であった同じサンプル ホルダーに位置するセルリアンの小さな結晶から部分的な回折データ セットのコレクションのため使用されました。試料ホルダーを画面に、meshloop の中心にグリッドを描いた (図 1B参照) し、DOZOR に基づいてスコア熱マップ (参照図 1、1 D) 85 部分回折データ セットを自動的に採取します。これらは個別に統合されたし、d分で 99.8% の完全性とデータのセットを生成する (上記参照) をマージ = 1.7Å (表 1参照)。最高解像度シェルの半分セット相関 (CC1/2)34 (= 4.7) 60% であった。予想通り、生成されたデータ セットを使用して分子置換33セルリアンの結晶構造を素直解決します。洗練された後、R動作の 22.8% と、R無料25.4% を得た.以前に決定された構造 (PDB エントリー 2WSO21) では、0.1 Cα位置グローバル rmsd Å 。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>マージされたデータ セットの統計情報</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>クラスタ リング閾値</td>
			<td>0.35</td>
		</tr>
<tr>
<td>一部のデータセットの数</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>スペース グループ</td>
			<td>P212121</td>
		</tr>
<tr>
<td>単位セル (a、b、c)</td>
			<td>50.98, 62.76, 69.50</td>
		</tr>
<tr>
<td>解像度の範囲</td>
			<td>46.58 1.70 (1.73 1.70)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rmerge (すべて私 + と -)</td>
			<td>したがって 0.133 (0.743)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rmeas (すべて私 + &amp; 私-)</td>
			<td>0.142 (0.813 であった)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rpim (すべて私 + &amp; 私-)</td>
			<td>約 0.047 (0.318)</td>
		</tr>
<tr>
<td>観測合計/ユニーク</td>
			<td>220693/25129</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mean((I)/sd(I))</td>
			<td>13.8 (4.7)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mn(I) 半セット相関 CC(1/2)</td>
			<td>0.994 (0.602)</td>
		</tr>
<tr>
<td>完全性</td>
			<td>99.8 (99.5)</td>
		</tr>
<tr>
<td>多様性</td>
			<td>8.8 (6.5)</td>
		</tr>
<tr>
<td>最終 Rの水晶
</td>
			<td>22.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>最終 R の無料
</td>
			<td>25.4</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: データの高品質を示すマージされたデータ セットの統計情報を収集しました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58594/58594fig1.jpg"> 図 1: MeshAndCollect を使用した同じ試料ホルダーに含まれる微小結晶のシリーズから一連の部分的なデータ セットを収集します。A) MXCuBE2 のユーザー インターフェイス。軸上ビューアー フィールド上緑楕円形グリッド ツールを示します。B) それを生命イメージ フィールドにサンプル ホルダーの画像の上にグリッドが描画されます。C) DOZOR スコアのヒートマップD) 回折像の例。E) 階層的クラスター分析後デンドロ グラム。赤のデータ セットは、マージに使用されました。セルリアンの F) 全体的な構造。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58594/58594fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

以降構造決定、蛍光タンパク質セルリアンの多くの小さい水晶採集部分回折データ セットの構成で使用するための完全な回折データ セットを取得する MeshAndCollect プロトコルの使用を提案します。

MeshAndCollect を使用して蛍光タンパク質セルリアンの構造解析

X-ray crystallography is the major technique used to obtain high resolution information concerning the 3-dimensional structures of biological ...

自動化されたMeshAndCollectプロトコルは、シリアル結晶学と標準的な回転データ収集を組み合わせて、パックサンプルから小さな結晶を測定するために開発されました。このメソッドは、まず同じサンプルホルダに取り付けられた結晶の位置を特定し、その後マージされ、構造の解に使用される部分データセットの収集を指示します。MeshAndCollectは、あなたが迅速かつ同じセットアップ、構造溶液、配位子スクリーニング、および小さな結晶でそれらのすべてで実験を行うことができますので、説得力があります。この方法は、高い光子フレックス、小さなビーム直径、高速リロード検出器を備えたシンクロトロンビームラインのVMXと互換性があります。まず、タンパク質結晶学ビームラインのデータベースの拡張情報システムに接続し、実験番号とパスワードを使用してAフォームからMX.Logを選択します。次に、[出荷追加新規] を選択し、要求された情報を入力します。[部分を追加]を選択し、関連するデータを入力します。[コンテナーの追加] を選択し、SC3 パックを選択し、パック内のサンプル ホルダの位置を含む必要な情報を入力します。実験小屋で、パックをサンプルチェンジャードーアにロードし、その位置をメモします。次に、タンパク質結晶性ビームラインのデータベースの情報システムにログインします。[実験の準備]を選択し、[出荷]を見つけて[次へ]を選択し、サンプルチェンジャのビームラインとパック位置を指定します。Aフォームに記載されている実験番号とパスワードを使用して、ビームライン制御ソフトウェアにログインします。Sync を押して、ビームライン制御ソフトウェアをタンパク質結晶化ビームラインのデータベースの情報システムと同期させます。ビームライン制御ソフトウェアを使用して、サンプルホルダーをゴニオメータに取り付けます。次に、サンプルチェンジャ領域の位置を右クリックし、[サンプルのマウント]を選択します。中央ボタンを選択し、3 回クリックすると、ループの先端の端の中央に中央に移動します。[保存]を選択して、中央の位置を保存します。[詳細設定] で、ワークフロー [ビジュアルの方向変更] をデータ コレクション キューに追加します。次に、[キューの収集] をクリックしてワークフローを起動します。次に、保存した中心位置の 1 つをクリックして選択します。中央ボタンをもう一度クリックし、ループのステムの始点の中央に3クリックの中心をクリックします。[保存] をクリックして、2 番目の位置を保存します。次に、[続行] をクリックします。ワークフローがサンプルホルダの平面をゴニオメータの回転軸に合わせ、メッシュの中央のどこかにサンプルホルダを再び中央に配置します。ビームライン制御ソフトウェアを使用してオメガ軸を回転させることにより、メッシュの面がX線ビーム方向に垂直になるようにサンプルホルダーの方向を設定します。ビームラインコントロールソフトウェアで、Aperture ドロップダウンメニューをクリックし、値を選択します。メッシュ ツール アイコンをクリックして、メッシュ ツール ウィンドウを表示します。ビームライン制御ソフトウェアのサンプルビューで、左クリックしてマウスをサンプルホルダーの結晶を含む領域の上にドラッグしてメッシュを描画します。メッシュを保存するには、メッシュ ツール ウィンドウのプラス ボタンをクリックします。ビームライン制御ソフトウェアの解像度フィールドに、回折画像を収集する解像度を入力します。結晶の回折品質に関する事前の情報が不明な場合は、2 と 2.5 の間の値をお勧めします。[高度なデータ収集]タブで[メッシュアンドコレクト]を選択します。キューに追加し、[キューの収集] をクリックします。パラメータ ウィンドウで、梁線依存の既定パラメータを使用します。ここで説明する実験では、既定のパラメータは、メッシュ スキャン ポイントあたり 0.037 秒の露出時間、100%伝送、およびメッシュ スキャン ラインあたり 1 度の振動です。[続行] をクリックします。メッシュスキャンが実行され、各グリッドポイントで収集された回折画像が解析され、ソフトウェアDozerで回折強度に従ってランク付けされます。Dozer 解析の後、ヒート マップが生成され、その後の部分データ収集の順序が回折強度に基づいて自動的に割り当てられます。最後に、[続行] をクリックして、部分的なデータ コレクションを起動します。MXCuBEに実装されたMeshAndCollectは、結晶の視覚的同定が困難であった同じサンプルホルダー上にあるセルリアンの小さな結晶からの部分的な回折データセットの収集に使用されました。サンプルホルダをスクリーニングするために、グリッドをメッシュループの中心に描き、Dozerスコアヒートマップに基づいて、85個の部分回折データセットを自動的に収集しました。これらは個別に統合され、1.7オングストロームの解像度で99.8%の完全性を持つデータセットを生成するために統合されました。予想通り、セルリアンの結晶構造は、生成されたデータセットを用いた分子置換によって解明できた。改良後、R作品22.8%、Rフリー25.4%を得た。以前に決定された構造のスーパーポジションは、0.1オングストロームのc-α位置にグローバルRMSDを示す。結晶成長段階の最適化を行うプロジェクトでは、MeshAndCollectは、より小さい結晶から得られたこれらのアモルファス部分データセットの組み合わせに基づいて完全なデータセットを取得する可能性を提供します。この技術は、構造生物学者が、わずか数十分のマイクロ結晶しか生成できない部品サンプルから構造を解く道を開いた。

structure-solution-fluorescent-protein-cerulean-using

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

ここでは、機能性分子複合体を追跡し、定量、検出できるようにするために細菌細胞を生きて単一分子蛍光顕微鏡を実行するためのプロトコルを示す。...

単一分子複合体の可視化インビボでの高度な蛍光顕微鏡を用いて

我々は単一細胞の蛍光を用いて立体構造変化の部位特異的解析と並んで膜タンパク質のイオン輸送の動態を測定する方法を説明します。この手法は、イオンチャネル、トランスポーター、イオンポンプに適応可能であり、タンパク質サブユニット間の距離の制約を決定するために利用することができます。...

膜タンパク質の構造動力学を調べるその場で部位特異的蛍光標識を持つ

Ti:Sapphireフェムト秒レーザー発振器による2光子吸収を用い、ケージド蛍光タンパク質を含む単一細胞を光活性化させる方法について記述します。光活性化された細胞の運命地図（フェイトマッピング）を作成するために、免疫組織化学法を用います。この手法は、あらゆる細胞型に適用可能です。...

ゼブラフィッシュにおける単一の細胞運命のマッピング

緑色蛍光タンパク質の融合に基づく大腸菌における組換え膜タンパク質の発現についてスクリーニングする効率的なアプローチが提示される。...

膜タンパク質の緑色蛍光タンパク質ベースの発現スクリーニングで<em&gt;エシェリヒア·コリ</em

ポリエチレングリコール(PEG)とアビジンコーティングされたガラス表面につながれ、マイクロ流体のせん断流で引き伸ばされた蛍光タンパク質DNA結合ペプチド(FP-DBP)で染色された大きなDNA分子を視覚化するアプローチを提示します。...

ペプチドを結合蛍光タンパク質のDNAを用いた表面係留大型DNA分子の可視化

シンプルで効果的な管理と腎臓の注入を使用する小型魚の循環システムの微粒子の可視化

蛋白質蛋白質の相互作用、生物学的システムにとって重要と拘束運動の研究は、ダイナミクスとタンパク質複合体の機能に対する洞察を提供します。蛋白質の蛍光共鳴エネルギー移動ストップト...

ミリ秒時間スケールでのタンパク質複合体のダイナミクスを調べるため体外蛍光共鳴エネルギー移動の使用

有機溶媒および水性溶媒の界面では、カスタマイズされた両親媒性エラスチン様タンパク質は、環境パラメータによって引き起こされる小胞、繊維、コアセルベートなどの複雑な上分子構造に組み立てられます。記載された組立プロトコルは、調整可能な特性を有するタンパク質膜ベースのコンパートメント(PMBC)を生成し、様々な貨物のカプセル化を可能にする。...

エブラスチン様タンパク質の定義された上膜構造とカーゴカプセル化への組み立て

古典的な部位特異的突然変異誘発の限界を克服するために、特定の修飾を有するプロリン類似体をいくつかの蛍光タンパク質に組み込んだ。我々は、水素をフッ素で置換するか、またはプロリン残基中の二重結合による単置換(「分子手術」)が、その折り畳みおよび光との相互作用を含む基本的なタンパク質特性にどのように影響するかを示す。...

蛍光タンパク質中のプロリン類似体によるプロリンの残基特異的交換:骨格の「分子手術」が折り畳みと安定性にどのように影響するか

この記事では、遺伝暗号拡大(GCE)部位特異的にサル モネラ 菌分泌エフェクターを標識し、直接確率的光学再構成顕微鏡(dSTORM)を使用してHeLa細胞内の分泌タンパク質の細胞内局在を画像化するための簡単で明確なプロトコルを提供します。...

遺伝暗号拡張を用いた細菌分泌タンパク質の超解像イメージング

mScarletと呼ばれる蛍光タンパク質を使用したEponの埋め込み後相関光および電子顕微鏡の詳細なプロトコルを紹介します。この方法では、蛍光と超微細構造を同時に維持できます。この技術は、さまざまな生物学的用途に適しています。...

Epon Post Embedding 相関光電子顕微鏡

学ぶ MeshAndCollect プロトコルを用いた蛍光タンパク質Ceruleanの構造解析法。シリアル結晶学と回転データ収集を組み合わせ、小さな結晶から完全な回折データセットを取得し、構造決定を効率化します。

MeshAndCollect を使用して蛍光タンパク質セルリアンの構造解析

さらに動画を探す