Name: 再構成された活性微小管束内の力を直接測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: 学ぶ 微小管束の力測定法。精製タンパク質から細胞骨格モチーフを再構成し、光トラップとTIRF顕微鏡を用いて力を直接測定する。この手法により、細胞力学と病態理解への新たな知見が得られる。

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著者らは、R21 AG067436(JPおよびSFへ)、T32 AG057464(ETへ)、およびレンセラー工科大学科学学校スタートアップファンド(SFへ)からの支援に感謝したいと思います。

著者は開示するものは何もありません。

微小管ネットワークは、本質的に機械的である幅広いタスクを実行するために、無数の細胞タイプによって採用されています。細胞が健康な状態と病気の状態の両方でどのように機能するかを説明するためには、これらのミクロンスケールのネットワークが、それらを集合的に構築するナノメートルサイズのタンパク質によってどのように組織化および制御されているかを理解することが重要です。光ピンセットなどの生物物理学的ツールは、このスケールで重要なタンパク質のメカノケミストリーを調査するのに適しています。微小管ネットワーク機能の多様性を反映して、微小管先端ダイナミクスの力依存解析67,68、動原体成分による力の発生69,70,71、微小管フィラメント機構を調べるための2ビームダンベルトラップ形状など、光ピンセットを用いた複雑な実験形状が検討されています72,73<sup class="xre...

細胞は微小管ネットワークを使用して、小胞輸送1,2,3から有糸分裂中の染色体分配4,5,6に至るまで、さまざまな機械的タスクを実行します。分子モータータンパク質のキネシンやダイニンなど、微小管と相互作用するタンパク質の多くは力を発生させ、機械的負荷によって調節されます。これらの重要な分子がどのように機能するかをよりよく理解するために、研究者は光学トラップやTIRF顕微鏡などの単一分子生物物理学的方法を使用して、個々のタンパク質の無負荷ステッピング速度、処理性、力と速度の関係などの重要なパラメーターを直接監視しています。最も一般的に使用されている実験幾何学は、球状の形状とサイズがモーター駆動の輸送を受けている小胞を模倣するトラッピングビーズにモータータンパク質を直接付着させることでした。キネシン-1 7,8,9、キネシン-2 10,11,12、キネシン-313,14,15,16キネシン-517,18、キネシン-8 19,20、ならびにダイニンおよびダイニン錯体21,22を含む多数のキネシン、23、24、25は、これらの方法で検討されている。
しかし、多くの細胞プロセスでは、モータータンパク質と非モータータンパク質は、トラックとカーゴの両方として微小管を使用します26,27。さらに、微小管フィラメントが高次バンドルに架橋されているこれらのシナリオでは、これらのタンパク質は単一のユニットではなくアンサンブルとして機能します。例えば、分裂した体細胞内で、高密度フィラメントネットワークが自己組織化して有糸分裂紡錘体装置28、29、30を構築する。極間紡錘体微小管ネットワークは非常にダイナミックで、マイナス端が紡錘体極を向いており、プラス端が紡錘体赤道付近で重なり合うように大きく配置されています。紡錘体内のフィラメントは、キネシン-5 31,32,33、キネシン-12 34,35,36、およびキネシン-1437,38,39などのモータータンパク質、またはPRC1 40,41,42,43またはNuMA 44,45などの非モータータンパク質によって架橋されています。46。それらは、極方向のフラックスなどのプロセス中、または中期または後期47,48,49,50,51,52中の染色体分離中の染色体中心を調整している間に、頻繁に移動または機械的ストレスを経験します。したがって、有糸分裂によるミクロンスケールのスピンドル装置の完全性は、相互作用するフィラメントのこのネットワークによって生成および維持される押し力と引っ張り力の慎重に調整されたバランスに依存しています。しかし、この機械的制御を調査し、タンパク質アンサンブルがどのように連携して微小管の動きを調整し、紡錘体を適切に組み立てるのに必要な力を生み出すかを説明するために必要なツールは最近開発されたばかりであり、動的微小管ネットワークを定義する生物物理学的規則を理解し始めたばかりです。
この原稿の目的は、架橋微小管ペアを in vitroで再構成し、微小管と架橋タンパク質の両方の蛍光視覚化とナノスケールの力測定を同時に可能にする顕微鏡チャンバーにこれらのバンドルを固定化し、これらのデータを堅牢に処理するために必要な手順を実証することです。蛍光標識された微小管を安定して重合するために必要な手順、取り付け用の顕微鏡カバーガラスの準備、光学トラップ実験用のポリスチレンビーズの準備、および生体 内機能を維持し ながら直接生物物理学的操作を可能にする架橋フィラメントネットワークの組み立てに必要な手順を詳しく説明します。

<table><tbody><tr><td>10W イッテルビウム ファイバー レーザー、1064nm</td><td>IPG フォトニクス</td><td>YLR-10-1064-LP</td><td></td></tr><tr><td>405/488/561/640nm レーザー クワッドバンド TIRF アプリケーション用</td><td>Chroma</td><td>TRF89901v2</td><td></td></tr><tr><td>6x His タグ抗体、ビオチン結合体</td><td>Invitrogen</td> <td>#MA1-21315-BTIN</td><td></td></tr><tr><td>アセトン、HPLC グレード</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>18-608-395</td><td></td></tr><tr><td>牛乳由来のアルファ カゼイン</td><td>シグマ</td><td>1002484390</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP413-25</td><td></td></tr><tr><td>ベンゾナーゼ</td><td>ノバゲン</td><td>70746-3</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン-PEG-SVA-5000</td><td>レイサンバイオ株式会社</td><td></td><td></td>NC0479433</tr><tr><td>BL21 (DE3) ロゼッタ細胞</td><td>ミリポア Sigma</td><td>71-400-3</td><td></td></tr><tr><td>カタラーゼ</td><td>MP Biomedicals LLC</td><td>190311</td><td></td></tr><tr><td>CFI Apo 100X/1.49NA 油浸 TIRF 対物レンズ</td><td>ニコン</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>クロラムフェニコール</td><td>ACROS 有機 227920250</td><td></td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ ミニラック、8 カバースリップ用</td> フィ<td>ッシャー・サイエンティフィック</td><td>C14784</td><td></td></tr><tr><td>デリケート タスク ワイパー</td><td>キンバリー クラーク</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>デキストロース 無水</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>BP3501</td><td></td></tr><tr><td>D-スクロース</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>BP220-1</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>BP172-25</td><td></td></tr><tr><td>エコライン イマージョン サーモスタット E100 003 バス</td><td>LAUDA-Brinkmann</td><td>27709</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP118-500</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Millipore Corporation</td><td>32462-25GM</td><td></td></tr><tr><td>フィジー / 画像 J</td><td>https://fiji.sc/</td> <td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>つや消し顕微鏡スライド</td><td>コーニング</td><td>12-553-10</td><td>75mmx25mm、厚さ 0.9-1.1mm</td></tr><tr><td>グルコースオキシダーゼ</td><td>MP バイオメディカルス LLC</td><td>195196</td><td>タイプ VII、酸素添加なし</td></tr><tr><td>GMPCPP</td><td>Jena Biosciences</td><td>JBS-NU-405S</td><td>-20°Cで数ヶ月間保存できます。Cおよび-80°Cで最大1年。C</td></tr><tr><td>ゴールド シールカバー ガラス</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>3405</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>イミダゾール</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>03196-500</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP1755-10</td><td></td></tr><tr><td>ラボラトリーデシケーター</td><td>ベルアート</td><td>999320237</td><td>190mm プレートサイズ</td></tr><tr><td>カナマイシン硫酸塩</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>KIF5A K439(aa:1-439)-6His</td><td>Gilbert Lab、RPI</td><td>N / A</td><td>doi.org/10.1074/jbc.RA118.002182</td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Kimberley Clark</td><td></td><td>Z188956糸くずの出ない組織</td></tr><tr><td>浸漬油、タイプB</td><td>Cargille</td><td>16484</td><td></td></tr><tr><td>レンズ組織</td><td>ThorLabs</td><td>MC-5</td><td></td></tr><tr><td>LuNAレーザー発射(4チャンネル:405、488、561、640nm)</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>MP Biomedicals LLC</td><td>100834</td><td></td></tr><tr><td>酢酸マグネシウム四水和物</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP215-500</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 18</td><td>Beckman Coulter</td><td>367160</td><td></td></tr><tr><td>MPEG-SVA MW-5000</td><td>Laysan Bio, Inc.</td><td></td><td></td>NC0107576</tr><tr><td>Neutravadin</td><td>Invitrogen</td><td>PI31000</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Ti-E 倒立顕微鏡</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td>Nikon LuN4 レーザー</td></tr><tr><td>Ni-NTA 樹脂</td><td>Thermo Scientific</td><td>88221</td><td></td></tr><tr><td>オリゴヌクレオチド - CACCTATTCTGAGTTTGCGCGA GAACTTTCAAAGGC</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>オリゴヌクレオチド - GCCTTTGAAAGTTCTCGCGCAA ACTCAGAATAGGTG</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>オープントップ厚肉ポリカーボネートチューブ、0.2 mL、7 mm x 22 mm</td><td>ベックマン・コールター</td><td>343755</td><td></td></tr><tr><td>Optima-TLX 超遠心分離機</td><td>ベックマン・コールター</td><td>361544</td><td></td></tr><tr><td>パクリタキセル(タキソール相当)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>P3456</td><td></td></tr><tr><td>パイプ</td><td>ACROS Organics</td><td>172615000</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>ミリポア</td><td>7110-5GM</td><td></td></tr><tr><td>ブタチューブリン、ビオチン標識</td><td>Cytoskeleton, Inc.</td><td>T333P</td><td></td></tr><tr><td>ブタチューブリン、HiLyte 647 Fluor</td><td>Cytoskeleton, Inc.</td><td>TL670M</td><td>遠赤色標識</td></tr><tr><td>ブタチューブリン、ローダミン</td><td>サイトスケルトン社</td><td>TL590M</td><td></td></tr><tr><td>ブタチューブリン, Tubulin Protein Cytoskeleton</td><td>, Inc.</td><td>T240</td><td></td></tr><tr><td>酢酸カリウム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP364-500</td><td></td></tr><tr><td>プライム 95B sCMOS カメラ</td><td>測光</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>象限検出器 センサーヘッド</td><td>ThorLabs</td><td>PDQ80A</td><td></td></tr><tr><td>クイックチェンジ ライトニングキット</td><td>アジレントテクノロジー</td>ズ <td>210518</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム二塩基性無水</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>スクエアカバーグラスコー</td><td>ニング</td><td>12-553-450</td><td>18 mm x 18 mm、厚さ0.13-0.17 mm</td></tr>スト<tr><td>レプトアビジンマイクロスフェアーシス</td><td>ポリサイ</td>エンシズ株式会社<td>24162-1</td><td></td></tr><tr><td>Superose-6 カラム</td><td>GE Healthcare</td><td>29-0915--96</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Thermo Scientific</td><td>77720</td><td></td></tr><tr><td>TLA-100 固定角ローター</td><td>ベックマン・コールター</td><td>343840</td><td></td></tr><tr><td>超音波洗浄機(ソニケーター)</td><td>Vevor</td><td>JPS-08A(DD)</td><td>304 ステンレス鋼、40 kHz 周波数、60 W 電力</td></tr><tr><td>Vectabond APTES ソリューション</td><td>ベクトル研究所</td><td>SP-1800-7</td><td></td></tr><tr><td>Windexは、アンモニア-D</td><td>とS.C.ジョンソン</td><td>SJN695237</td><td></td>ガラスクリーナーを動力化しました</tr></tbody></table>

再構成された活性微小管束内の力を直接測定

Directly Measuring Forces Within Reconstituted Active Microtubule Bundles

微小管ネットワークは、小胞輸送のトラックとして機能することから、染色体分配を調節するための有糸分裂中の特殊なアレイとして機能することまで、幅広いタスクを実行するために細胞で使用されます。微小管と相互作用するタンパク質には、キネシンやダイニンなどの能動や方向性運動を発生させるモーターや、フィラメントを高次ネットワークに架橋したり、フィラメントのダイナミクスを調節したりする非モータータンパク質などがあります。これまで、微小管関連タンパク質の生物物理学的研究は、小胞輸送に必要な単一モータータンパク質の役割に圧倒的に焦点を当てており、キネシンやダイニンの力発生特性やメカノケミカル制御の解明は大きく進歩してきました。しかしながら、微小管が有糸分裂紡錘体内でのフィラメントスライド中など、貨物およびトラックの両方として作用するプロセスについては、関与する架橋タンパク質のアンサンブルの生物物理学的調節についてはほとんど理解されていない。ここでは、精製された微小管と有糸分裂タンパク質から再構成された架橋微小管最小ネットワーク内の力の生成と応答を直接調査するための方法論について詳しく説明します。微小管対は目的のタンパク質によって架橋され、1つの微小管は顕微鏡カバーガラスに固定化され、2番目の微小管は光トラップによって操作されます。同時全反射蛍光顕微鏡法により、フィラメントがスライドして力を発生させるときに、この微小管ネットワークのすべてのコンポーネントのマルチチャンネル視覚化が可能になります。また、これらの技術を使用して、キネシン-5アンサンブルによって加えられる押し力と、有糸分裂MAP PRC1によって架橋された滑り微小管ペア間で粘性のあるブレーキ力がどのように発生するかを示します。これらのアッセイは、紡錘体の組み立てと機能のメカニズムに関する洞察を提供し、ニューロンや極性上皮細胞の軸索や樹状突起など、さまざまな状況で高密度の微小管ネットワーク力学を研究するために、より広く適応させることができます。

生物物理学的分析に適した微小管束の調製は、いくつかの重要な基準が満たされれば成功したと見なされます。まず、3色でイメージングすると、オーバーラップ領域を優先的に装飾する架橋タンパク質の濃度を持つ2つの整列した微小管が明らかになります(図5B、C、および図6B)。理想的には、ローダミン微小管のオーバーラップエッジと自由末端の間の距離は、トラッピングビームと蛍光標識タンパク質の間に十分な物理的スペースを提供するために少なくとも5μmである必要があります。第二に、ビオチン化遠赤色微小管がない領域、特に架橋タンパク質が標識されているのと同じチャネルからのバックグラウンド蛍光シグナルが最小限である必要があります。高いバックグラウンド蛍光は、カバーガラスのパッシベーションが不十分で、ガラス結合タンパク質の濃度が高いことを示しており、微小管またはトラッピングビーズと非特異的に相互作用する可能性があります。さらに、微小管イメージングチャネルのいずれかに見られる小さな丸...

ここでは、微小管束を in vitroで 再構成し、光学トラップと全反射蛍光顕微鏡を同時に使用して、微小管束に及ぼされる力を直接定量化するためのプロトコルを紹介します。このアッセイは、活性微小管ネットワーク内のタンパク質アンサンブルによって生成される力と変位のナノスケールレベルの測定を可能にします。

Microtubule networks are employed in cells to accomplish a wide range of tasks, ranging from acting as tracks for vesicle transport to working as ...

私たちのプロトコルにより、研究者は精製された成分から細胞骨格モチーフを構築し、これらのネットワークが生成する力を直接測定して、細胞のこれらの機械的構成要素が健康な状態と病状の両方でどのように機能するかを理解することができます。この方法により、力を定量化し、これらの数値を直接相関させて、タンパク質の濃度や密度など、関与するタンパク質のパラメータを維持することができます。セル内では一般的に取得できないパラメータ。この方法は、有糸分裂や神経発達に関与するものなど、あらゆるタイプの細胞骨格ネットワークへの洞察を提供することができます。使用されているこの特定のタンパク質を交換するだけで、筋肉の収縮や細胞の移動に関与するネットワークの研究に容易に適合させることができます。この方法の最も難しい側面は、シングルビーム光学トラップとTIRF顕微鏡を含むさまざまなテクノロジーの調整です。また、1分子実験ではカバースリップなどの表面を慎重に準備する必要があるため、高品質のサンプルを準備することが最も重要です。まず、空のピペットチップボックスの底に超純水で湿らせた折りたたまれた糸くずの出ないティッシュを置き、湿度チャンバーを構築します。チャネルの一方の端で液体をピペッティングし、もう一方の端で液体を吸い上げることにより、すべての試薬を導入します。20マイクロリットルの角度のピペットチップを使用して、1ミリリットルあたり0.5ミリグラムのストレプトアビジンまたはニュートラアビジンを10マイクロリットルゆっくりと流します。カバースリップを下に向けて、湿度チャンバー内でスライドを4分間インキュベートします。糸くずの出ないティッシュを使用して20マイクロリットルの1x BRB80を使用してチャンバーを洗い流し、液体を引き出します。試薬の流入とインキュベーションをもう一度繰り返した後、1ミリリットルあたり0.5ミリグラムのカゼインブロッキング溶液で10マイクロリットルをフラッシュします。10マイクロリットルの希釈ビオチン化遠赤色微小管をチャンバーに流し込み、20マイクロリットルの1x BRB80でチャンバーを洗い流します。前に示したように試薬を流してインキュベートした後、研究する10マイクロリットルの適切な濃度の非モータータンパク質でステップを洗い流し、次に10マイクロリットルのローダミン微小管を流し、インキュベーションとフラッシングを繰り返します。次に、1マイクロリットルのリゴールキネシンコーティングビーズと19マイクロリットルの反応バッファーを混ぜ合わせます。チャンバーの両端を透明なマニキュアで密封し、ポリッシュが乾くまで待ちます。全反射蛍光イメージング機能を有し、シングルビーム光トラップを構築した倒立顕微鏡装置を使用する。サンプルチャンバーのカバースリップに1滴の浸漬油を追加します。サンプルチャンバーのカバースリップ側を下に向けて、イメージングするサンプルを顕微鏡プラットフォームに置きます。カバースリップと対物レンズの両方がオイルを介して接触するように、対物レンズをゆっくりと持ち上げます。サンプルチャンバーのカバースリップ面に焦点が合うように対物レンズの高さを調整します。3つのチャンネルすべてでサンプルの単一フレーム画像を記録します。ここでの実験では、100〜200ミリ秒の曝露を使用します。レーザー出力を調整して、サンプルからの良好な信号対雑音比を達成しながら、個々のバンドルをアッセイするときに2〜5分にわたって光の退色を最小限に抑えます。視野当たりの微小管束の頻度は、100マイクロリットル当たり約3〜4個の微小管束×チャンバー当たり100マイクロリットルの視野であるべきである。明視野と顕微鏡上の100倍の対物レンズを使用して、サンプル中のビーズの密度を観察します。ビーズが互いに平均10マイクロメートル以上離れるようにビーズの濃度を採用し、表面閉じ込めやクラスタリングがないことを確認してください。ビオチン化遠赤色微小管がカバースリップの表面にしっかりと付着していること、および目に見えるブラウン運動のないローダミンがあることを確認してください。ローダミン微小管が架橋マップを介してビオチン化微小管に付着しており、自由末端で目に見えて変動していることを確認します。2つの微小管のみを含む適切な微小管束を特定します.1つは全面付着でビオチン化され、もう1つは溶液中に部分的に遊離し、x軸またはy軸のいずれかに整列しているビオチン化されていない微小管です。光学トラップを使用して、ブラウン運動を示すフリービーズをキャプチャします。ビーズがトラップされたら、ビーズを選択した微小管束に慎重に移動し、プロセス中に他のビーズがトラップに引き込まれないようにします。ビーズが架橋タンパク質を含むオーバーラップ領域から数ミクロン離れていることを確認してください。ローダミン微小管の自由セグメントの端に接触するまで、z軸のビーズを慎重に下げます。ゆっくりと引き上げ、微小管軸に対して垂直に動かし、ローダミン微小管の曲がりを観察し、ビードの位置を追跡して、付着を確認します。ナノポジショニングステージを動かして、表面付着微小管の微小管軸に沿ってローダミン微小管を慎重に再調整し、微小管束の自動引っ張りのパラメータを設定します。微小管の平行軸に沿った方向を設定します。オーバーラップの長さに応じて、希望のプル速度と希望のプル時間を設定します。3つのチャンネルで1〜2フレーム/秒の速度で蛍光データの記録を開始します。最適化されたレーザー出力と露光時間を使用します。自動ステージモーションを開始し、位置感応検出器ステージと全反射蛍光カメラステージからのトラップデータを記録します。トラップを無効にしてビーズを解放し、必要に応じて実験を繰り返します。必須の有糸分裂モータータンパク質kinesin-5のアンサンブルは、オーバーラップ長に比例してスケーリングする押し力とブレーキ力の両方を生成することにより、微小管の滑りを調節できます。C末端テールドメインは、効率的な架橋と力の発生に必要であることがわかりました。全長タンパク質は、すべてのモータータンパク質が個々の失速力に達すると、停滞する持続的な力を生成することができます。しかし、C末端テールを持たないキネシン5モーターは、大きさがほぼ5倍小さい最大力を生成します。非運動性有糸分裂タンパク質PRC1のアンサンブルは、後期紡錘体中央ゾーンでの微小管の滑りに抵抗する機械的なダッシュポッドとして機能します。抵抗力は、微小管対間のオーバーラップ領域の長さや局所的な架橋剤密度には依存しませんが、関与したPRC1分子の総濃度に強く依存します。この方法は、代替タンパク質を使用することにより、微生物組織やニューロンなどの多様な生物学的システムの研究に適応できます。また、アクチンベースのネットワーク形状を分析して、筋肉の収縮や細胞の運動性を研究するために容易に拡張することもできます。この技術により、フィラメントがトラックとカーゴの両方であり、タンパク質の小さなアンサンブルによって編成されているユニークな細胞総形状を研究することができます。これらの形状は、多数の生物学的プロセス中に細胞内で起こっていることをよりよく模倣します。

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Biology

生物学

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光ピンセットを用いた閉じ込めにおける細胞下力学の直接力測定

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TIRF顕微鏡による インビトロでの 架橋小管と単一微小管のダイナミクスの同時可視化

光ピンセットを用いたアクチンフィラメント束中のミオシンアンサンブル機構の探索

我々は、蛍光顕微鏡法と組み合わせて、個々のアクチンフィラメントをリアルタイムで正確に監視しながら、異なるタンパク質溶液に順次曝露することを可能にする、単純なアクチンフィラメントマイクロ流体アッセイのプロトコルを提示する。...

マイクロフルイディクスと蛍光顕微鏡を使用して、単一アクチンフィラメントおよびバンドルのアセンブリダイナミクスを研究する

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全内部反射蛍光(TIRF)顕微鏡によるアクチンと微小管結合ダイナミクスのイン ビトロでの 可視化

この論文では、共絡アクチンフィラメントと微小管の調整可能な3次元複合ネットワークをエンジニアリングおよび特性評価するためのプロトコルを紹介します。複合材料は、ミオシンIIおよびキネシンモーターによって駆動される能動的再構成および弾道運動を受け、アクチン、微小管、モータータンパク質、および受動架橋剤の相対濃度によって調整される。...

調整可能なモーター駆動ダイナミクスとメカニクスによるアクチン-微小管複合材料の再構成と特性評価

学ぶ 微小管束の力測定法。精製タンパク質から細胞骨格モチーフを再構成し、光トラップとTIRF顕微鏡を用いて力を直接測定する。この手法により、細胞力学と病態理解への新たな知見が得られる。

再構成された活性微小管束内の力を直接測定

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