Name: 分離、シーケンスおよびヒト間葉系幹細胞からの細胞のマイクロ Rna を分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: 学ぶ、ヒト間葉系幹細胞から細胞外マイクロRNAを分離・シーケンスし、ライブラリ構築と品質管理を含む完全なプロトコルを習得する。低サンプル量でのNGS解析に有用である。

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その技術支援の稲野に氏クロース バスとさんリタ ローゼンダール タンペレに感謝しております。博士ダニエル Otzen 彼の超遠心機の頻繁な使用を許可するために感謝します。本研究は、技術革新基金デンマーク (召集プロジェクト) によって支えられました。

注: 間葉系幹細胞用成長培地 (メディア)材料の表に示すように事前に用意しています。
1. 細胞培養
注: ヒト間葉系幹細胞は、骨髄、脂肪組織または他のソースの11から入手できます。また、hMSCs はサプライヤーから購入できます。このプロトコルで使われる BMSCs いた患者の骨髄から派生し、会社から買った。
<ol><li>1 x 106 BMSCs MSC メディアの 20 mL を含む T175 フラスコを解凍します。5% CO2と 37 ° C で細胞をインキュベートし、80% の confluency まで 2-3 日毎メディアを交換します。</li>
	<li>5 ml の 1x PBS のセルを洗浄して、PBS を破棄します。</li>
	<li>0.05 %5 mL を追加してセルをデタッチ トリプシン-EDTA と 37 ° C で 5 分間細胞の培養剥離を容易にするために、フラスコの側面をタップします。</li>
	<li>トリプシンを不活化、表面、および単一細胞懸濁液を取得する上下ピペットから細胞をデタッチする MSC メディアの 15 mL を追加します。</li>
	<li>50 の mL の管でスピンダウン細胞ペレットに 300 x gで 5 分間細胞を収集します。</li>
	<li>メディアの 1 mL の細胞を再懸濁し、診断のセルをカウントします。 注: プライマリひと骨髄 MSCs T175 フラスコで 80% の confluency には約 2 x 10 の6セル。</li>
	<li>プレート hMSCs 2,000 セル/cm2で 5 T175 フラスコで新鮮なメディア。5% CO2と 37 ° C で細胞を成長し、メディアを 90% コンフルエント T175 フラスコ 5 フラスコが得られるまで 2-3 日毎に交換します。</li>
</ol>2. EVs と生体分子の RNA 関連コレクション
注: EV コレクション メディアが事前準備 (ダルベッコ変更イーグルの中 [DMEM] 10% 牛胎児血清 [FB] と 1% ペニシリン/ストレプトマイシン [P/S])。EV コレクション メディアは、通常の MSC メディアですが、商用 EV 枯渇 FBS (資材表) を使用しました。これは、リポタンパク質、ribonucleoproteins、EVs に関連付けられている exRNAs が含まれている通常の FBS から牛 exRNA の汚染を避けるためです。小さな RNA ライブラリの準備、MSCs の合流 5 個のフラスコから派生した exRNAs は、ライブラリーの構築を有効にする必要があります。
<ol><li>3 セルを洗浄して T175 フラスコあたり 20 mL の PBS と x。MSCs の合流 T175 フラスコあたり EV コレクション メディアの 20 の mL を追加し、, 5% CO2 48 h の 37 ° C で。</li>
	<li>メディアを収集し、遠心分離機の 300 x gで 10 分間、4 ° C のためのメディア</li>
	<li>上清を収集し、遠心分離機の 2,000 x gで 20 分、4 ° C のためのメディア</li>
	<li>上清を収集し、遠心分離機の 15,500 x gで 30 分と 4 ° C のためのメディアその後、上清を収集します。</li>
	<li>超遠心機チューブにメディアを転送し、100,000 × gと 4 ° C で 90 分の exRNAs をペレットここで使用する固定角ロータとペレットが管の側に固定されています。蓋の側面をマークし、ペレットが見込まれるチューブ側に円を描きます。</li>
	<li>上澄みを除去、吸水紙の上管を反転によるチューブの内側を乾燥、吸水紙の小片を使用して管の底に触れることがなくチューブ内の液体を削除します。30 のボルテックスで PBS の 200 μ L でペレットを再懸濁します s と 20 x 上下ピペッティングします。</li>
	<li>追跡分析 (国税庁) (図 2) ナノ粒子の EVs と生体分子を評価します。 注: EVs と生体分子ナノ粒子解析 (国税庁)、動的光散乱 (DL) または透過電子顕微鏡 (TEM)12の追跡と評価できます。</li>
	<li>さらに下流実験まで、EVs と-80 ° C で生体分子を格納します。 注: EVs 機能研究に使用する場合は、20% のグリセロールは破裂からそれらを保護するために追加する必要があります。細胞は、必要に応じて、標準の手順を使用して収集できます。</li>
</ol>3. EVs と分化細胞の生体分子の RNA 関連コレクション
注: EVs と RNA 関連する生体分子、細胞分化、細胞培養媒体から収集したにすることができます。プロトコルに示されている例では、骨芽細胞の分化と 0 と分化の 7 日で exRNA コレクションについて説明します。差別化が必要ない場合は、セクション 3 をスキップし、セクション 4 に進みます。
<ol><li>骨芽細胞様分化メディアを準備 (10% DMEM FBS、1 %p/S、10 mM の β-グリセロリン酸、10 nM デキサメタゾン、50 μ M アスコルビン酸-2-リン酸、および 10 mM 1.25 ビタミン D3) 新鮮な毎回。</li>
	<li>MSCs が 80% の合流と、骨芽細胞分化メディアに MSC のメディアを変更します。</li>
	<li>2 〜 3 日後、骨芽細胞分化メディアを補充します。</li>
	<li>分化の日 5、メディアを取り出し、洗浄セル 3 T175 フラスコあたり 20 mL の PBS と x。</li>
	<li>EV コレクション メディア 10 mM の β-グリセロリン酸を含む 10 nM デキサメタゾン、50 μ M アスコルビン酸-2-リン酸および MSCs。 ように 48 時間 5% CO2と 37 ° C でセルを続けた加温の合流 T175 フラスコあたり 10 mM 1.25 ビタミン D3の 20 の mL を追加します。EVs 生体分子を収集しながら分化。</li>
	<li>7 日メディアを収集し、EVs と手順 2.2 2.6 では生体分子の分離に進みます。</li>
	<li>品質管理のため 96 ウェルやアルカリ性ホスファターゼ (ALP) 活性測定法を用いた分化を評価する 6 井戸かの量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR) をセルをそれぞれシードします。 注:図 3は、細胞の骨分化を示す例です。</li>
</ol>4. RNA の抽出および品質管理
<ol><li>氷の上の 2.8 のステップからのサンプルを解凍します。RNA 分離キット (資材表) を使用して RNA を抽出します。</li>
	<li>RNase フリー水の 100 μ L の RNA 分離キット (材料表) で提供される列からの RNA を溶出します。</li>
	<li>浄化された RNA の 100 μ L にグリコーゲン、2 M pH 5.5 ナトリウムのアセテートの 10 μ L、冷蔵前 99% エタノールの 250 μ L の 1 μ L の追加によってエタノール沈殿法による RNA を集中します。</li>
	<li>RNA の沈殿物に一晩に-20 ° C でサンプルをインキュベートします。16,000 x gと 4 ° C で 20 分間遠心分離によって RNA をペレットします。 注: ペレットはグリコーゲンとの共沈により、白です。</li>
	<li>上澄みを除去し、75% エタノール 1 mL で RNA の餌を洗います。16,000 x gと 4 ° C で 5 分間のために再度 RNA をペレットします。</li>
	<li>エタノールを取り外して RNA チューブの蓋を開いたまま空気に 5-10 分の乾燥 RNA ペレット。RNase フリー水の 7 μ L の RNA ペレットを再懸濁します。</li>
	<li>RNA の品質と図書館の建設前に、製造元のプロトコルによると RNA を検出するキャピラリー電気泳動のチップを使ったマシンを用いた濃度を確認してください。 注: RNA の代表的なサイズの分布は、図 4に示すです。</li>
	<li>必要に応じて市販の精製キット (材料表) を使用して細胞の RNA を抽出します。</li>
</ol>5. 図書館の建設と品質管理
注: 小さな RNA ライブラリは、入力低 RNA による調整で商業キット (資材表) を使用して構築されます。図書館の建設は、チルド ブロックで実行されます。
<ol><li>0.2 mL PCR チューブ氷の上の暖房のブロックを冷やすし、冷えたブロックの RNase フリー 0.2 mL PCR チューブにステップ 4.6 からの RNA の 5 μ L をピペットします。</li>
	<li>RNase フリー 0.2 mL PCR チューブに RNase 自由水の 3' アダプター (1:10) を希釈します。希釈アダプターの 0.5 μ L を追加し、RNA の 5 μ L 上下 8 x と遠心分離機管の下部にすべての液体を収集するために簡潔にピペッティングで混ぜます。</li>
	<li>予熱した熱 cycler で 2 分間 70 ° C で RNA と 3' アダプター ミックスをインキュベートし、チルドのブロックに戻ってサンプル。</li>
	<li>RNA と 3' アダプターの混合物に結紮バッファーの 1 μ L、RNase 阻害剤 0.5 μ L と T4 RNA リガーゼ (削除変異) の 0.5 μ L を追加します。8 x 上下ピペッティングで混ぜるし、簡単に遠心分離機します。</li>
	<li>予熱した熱 cycler で 1 h 28 ° C でチューブを孵化させなさい。</li>
	<li>熱 cycler でチューブのサンプル チューブに停止液を 0.5 μ L を追加し、8 x 上下ピペッティングで混ぜる 28 ° C、15 分インキュベート続けます。</li>
	<li>RNase フリー 0.2 mL PCR チューブ内の水の RNase フリーの 5' アダプター (1:10) を希釈します。独立した RNase フリー 0.2 mL PCR チューブ、熱予熱した熱 cycler で 2 分間 70 ° C で 5' アダプターにアダプター 5' の 0.5 μ L を追加し、チルド ブロックのサンプル。</li>
	<li>10 nM の ATP、5' アダプター チューブに T4 RNA リガーゼの 0.5 μ L の 0.5 μ L を追加、8 x 上下ピペッティングで混ぜるし、遠心分離機の底にすべての液体を収集するために簡潔に。 注: 可能な限りチルド ブロックに 5' アダプターを保ちます。</li>
	<li>5.6 のステップからサンプルに 5' アダプター混合物の 1.5 μ L を追加し、ゆっくりとピペッティング 8 x でとてもやさしく混ぜます。予熱した熱 cycler で 1 h 28 ° C でサンプルをインキュベートします。</li>
	<li>RT プライマー 1:10 を RNase フリーの 0.2 mL PCR チューブに RNase フリーの水で希釈します。ステップ 5.9、非常に穏やかでゆっくり上下に 8 x ピペッティング ミックスからサンプルに希薄化後の RT プライマーの 0.5 μ L を追加し、遠心分離機の簡潔にします。</li>
	<li>予熱した熱 cycler で 2 分間 70 ° C でサンプルをインキュベートし、チルド ブロックのサンプル。</li>
	<li>最初の鎖バッファー、12.5 mM dNTP ミックスの 0.5 μ L、100 mM ジチオトレイトール (DTT)、RNase 阻害剤 0.5 μ L と逆転写酵素の 0.5 μ L が 0.5 μ L x 5 の 1 μ L を追加します。とてもやさしく 8 x 上下ゆっくりとピペッティングで混ぜるし、簡単に遠心分離機します。</li>
	<li>1 h cDNA を取得する予熱した熱 cycler で 50 ° C でサンプルをインキュベートします。</li>
	<li>CDNA に純水の 4.25 μ L、12.5 μ L の PCR ミックス、インデックス プライマーの 1 μ L と普遍的なプライマーの 1 μ L を追加します。8 x 上下ピペッティングで混ぜるし、簡単に遠心分離機します。</li>
	<li>サーマルサイクラーにサンプルを置き、サーマルサイクラーを次のように設定: 98 ° C、30 秒。15 サイクル 98 ° C の 10 s、60 ° C、30 s および 15 のための 72 ° C s;72 ° C で 10 分間のサイクルを終了します。 注: 準備されたライブラリは-20 ° C で 1 週間保存できます。</li>
	<li>DNA ゲルのライブラリを分離し、140 の間ゲル (ゲルの抽出) を切断 RNA ライブラリを浄化する bp と 160 bp とライブラリ構築キットで与えられるプロトコル、次ゲルからライブラリを溶出します。 注: 本研究でステップ 5.15 から準備されたライブラリが読み込まれる商業ゲル (材料表) と 140 の間図書館に bp と 160 bp 精製を自動化された DNA サイズ分留 (材料表) によると、製造元のプロトコル。</li>
	<li>集中ステップ 5.16 列ベースの PCR 精製キット (資材表) を使用してからライブラリを洗いし、最終的に 10 μ L RNase フリー水でライブラリを溶出します。</li>
	<li>1 μ l 中、次の製造元のプロトコル ライブラリのサイズをチェックする DNA チップ (材料表) に浄化されたライブラリをロードします。</li>
	<li>10 mM の pH 8.0 で精製されたライブラリ (1: 1000) の 1 μ L を希釈トリス-HCl と 0.05% ポリソルベート 20、qPCR キットによる DNA 標準ライブラリの濃度を定量化する商用ライブラリ定量キットを使用して、ライブラリを定量化します。</li>
	<li>高スループット シーケンス システムのシーケンス マシンとシーケンスの要件に従ってライブラリのプール等しい量。 注: 細胞 RNA の図書館の建設を行うことがキットの標準的なプロトコルに従うことによって同じキットを使用しています。</li>
</ol>6. バイオインフォマティクス パイプライン
注: これは社内パイプラインとここで使用されるプログラムを示す、テーブルの材料。
<ol><li>離れて低品質の読み取りをトリミングし、raw 読み取りからアダプター シーケンスを削除します。</li>
	<li>きれいな読み取りを Rna の種類にマップします。<ol>
<li>重く変更された tRNA シーケンス逆転写酵素によって頻繁に基本 misincorporation が発生するため、2 つの不一致を許可する、Trna に注釈を。</li>
		<li>ゼロの不一致を許可する miRBase v21 から人間の miRNAs へのマッピングによって miRNAs に注釈を付けます。以来、miRNAs は予告なく A と U 非テンプレート 3' 端追加、マップされていないシーケンスは、3' の人間の miRNAs とゼロの不一致を許可する miRBase v21 から他の miRNAs にマップされる読み取り後最大 3 A および/または T の国税庁のトリミングします。</li>
		<li>1 つの不一致を許可することで他の関連する小さな Rna (snRNA、snoRNA、ピルナ、Y Rna) に注釈を付けます。</li>
		<li>劣化を評価するために、残りのマップされていない読み取りを長い RNA データセット (rRNA、Rfam、および mRNA から他の RNA) にマップします。</li>
		<li>人間のゲノムをシーケンスに注釈を付けます。</li>
		<li>細菌のゲノムをシーケンスに注釈を付けます。</li>
		<li>次の数式を使用して、miRNA 式を正規化: miRNA カウント/すべてのマップされた Mirna のカウント) x 106。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

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ここでは、低入力サンプルから発現解析を可能にする exRNAs の次世代シーケンシングのためのプロトコルについて述べる。でも小さな変化 (すなわち、遠心ステップまたはローターの種類の変更) はトランスクリプトームに影響を与えるために miRNA レベル13,14EV と exRNA の分離のための特定のプロトコルに従うことが重要です。したがって、どのように、exRNA が分離されているに関係なく同じ実験、バイオ情報の手順の結果を比較することができる実験のすべてのサンプルに適用することが重要です。
RNA の整合性は通常バイオアナライザーに評価されます。ExRNAs を欠いているので全長 rRNA のリン値は非常に低く、しかし、これは必ずしも低質 RNA サンプルを反映しません。さらに、exRNAs の RNA 濃度はさまざまし、はしばしば不正確。したがって、RNA の品質を評価する、バイオアナライザーに RNA を定量化するのではなくボリュームを使用同じメディアのた...

細胞外と Rna (exRNAs) を循環、様々 な体液に存在 RNases1,2の方が抵抗力があります。その高い豊富、安定性とアクセシビリティのやすさ3診断と予後マーカーとしての臨床的評価のために魅力的です。ExRNAs のための輸送のモードには細胞小胞 (Ev)、リポタンパク質 (高密度リポタンパク質; などとの関連付けが含まれますHDL) とリボ核蛋白質複合体 (よう Argonaute2 錯体を)4。
ExRNAs のサブセットが小さい非コーディングの Rna 約 22 であるマイクロ Rna (Mirna)、転写後の遺伝子発現を調節する nt。Ex miRNAs は、細胞間コミュニケーションと5セルの恒常性の調節に関与しています。たとえば、HDL は内皮細胞接着分子 1 (ICAM-1) を抑制するために ex ミール 223 を提供および炎症6。興味深いことに、ミール 223 も肺癌細胞より侵襲性の表現型7を取ることをプログラミングする白血球細胞小胞で運ば見られています。したがって、様々 な体液や細胞培養液から ex miRNAs のトランスクリプトーム、ex miRNA がシグナル伝達の私達の理解が向上します。
小さな RNA シーケンス (小さな RNA seq) は、小さな rna トランスクリプトームを理解するための強力なツールです。発現の知られている Rna の中の異なるサンプルを比較できるだけでなく新規低分子 Rna はまた検出し特徴付けられます。その結果、それはまた異なる条件下での発現の Mirna を識別するために堅牢な方法です。しかし、小さな RNA seq のハードルの一つは髄液、唾液、尿、牛乳の血清、培地のような低 exRNA 入力流体から小さな RNA seq ライブラリを生成するの困難です。イルミナから TruSeq 小さな RNA 図書館準備プロトコルは、高品質の総 RNA の約 1 μ g を必要と、ニュー イングランド biolabs 社から NEBNext 小型 RNA ライブラリの準備のセットのプロトコルが RNA8,9の 100 ng 1 μ g を必要とします。多くの場合、これらのサンプルからの総 RNA は従来の紫外可視分光光度計の検出限界以下です。
Ex miRNAs 由来の体液は、潜在的によい予後および診断マーカーです。ただし、機能への影響を研究するためにまたは特定の ex miRNAs の起源を決定するため、細胞培養システムが代わりに使用よくされます。EVs は、心筋梗塞、アルツハイマー病、移植片対宿主病の10を含む多くの疾患を軽減することに関与しているために、間葉系幹細胞 (MSCs) を盛んに研究されています。ここでは、骨髄由来 Msc (BMSCs) と小さな RNA 図書館の建設、シーケンスとデータ解析 (図 1) を最適化するために使用する特定の手順から ex miRNAs の浄化を示します。

<table><tbody><tr>このプロトコルで使用される<td>骨髄由来間葉系幹細胞</td><td>ATCC</td><td>PCS-500-012</td><td>細胞は、</td></tr><tr><td>間葉系幹細胞増殖培地(MSC培地)と呼ばれる</td>ATCC<td>MSCGM BulletKit</td><td>ロンザ</td><td>PT-3001</td></tr>から購入されました。<tr><td>エキソソーム枯渇FBS</td><td>Gibco</td><td>A2720801</td><td></td></tr><tr><td>ExRNA収集培地:MSCGMですが、FBSはエキソソーム枯渇FBS</td><td></td><td></td>に置き換えられています<td></td></tr><tr><td>トリプシン - EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>T175 フラスコ</td><td>Sarstedt</td><td>833,912</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン - ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>Sigma</td><td>806552</td><td></td></tr><tr><td>超遠心分離機</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ポリカーボネートボトル キャップアセンブリ</td><td>付き Beckmanコールター</td><td>355618</td><td></td></tr><tr><td>ベックマン コールター タイプ 60 チタン</td><td></td><td></td><td>ローター</td></tr><tr><td>ここで使用 NucleoCounter</td><td>Chemometec</td><td>NC-3000</td><td>セルカウンター</td></tr> &<tr><td>β;-グリセロリン酸</td><td>Calbiochem</td><td>35675</td><td>骨分化培地の成分</td></tr><tr><td>デキサメタゾン</td><td>Sigma</td><td>D4902-25MG</td><td>骨分化培地の成分</td></tr><tr><td>2-リン酸化-L-アスコルビン酸&nbsp;酸性三ナトリウム塩</td><td>シグマ</td><td>49752-10G</td><td>骨分化培地</td></tr><tr><td>の成分1&α;、25-ジヒドロキシビタミン&nbsp;D3</td><td>シグマ</td><td>D1530-1MG</td><td>骨分化培地</td></tr><tr><td>miRNeasyミニキット</td>のコンポーネント <td>Qiagen</td><td>217004</td><td>miRNAおよび全RNA精製キット ステップ4.8</td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Pico Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1514</td><td>チップベースのキャピラリー電気泳動装置とRNAおよびDNA分析用</td></tr>チップ <tr><td>Agilent 2100 バイオアナライザー</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939BA</td><td>RNAおよびDNA分析用のチップベースのキャピラリー電気泳動装置とチップ</td></tr><tr><td>Agilent High Sensitivity DNAキット</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td>RNAおよびDNA分析用のチップベースのキャピラリー電気泳動装置とチップ</td></tr><tr><td>KAPAライブラリ定量キット</td><td>ロシュ</td><td>KK4824</td><td>ここで使用するライブラリ定量キット</td></tr><tr><td>TruSeq Small RNAライブラリ調製キット-セットA(24 rxns)(セットA:インデックス1-12)</td><td>このプロトコルで使用されるIllumina</td><td>RS-200-0012</td><td>Small RNAライブラリ調製キット - ステップ5で使用</td></tr><tr><td>Pippin Prep</td><td>Sage Science</td><td></td><td>このプロトコルで使用される自動DNAゲル抽出器;手動抽出も行うことができます</td></tr><tr><td>MinElute PCR精製キット</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>ステップ5.17でのPCR精製</td></tr><tr><td>FASTX_Toolkit</td><td>Cold Spring Harbor Lab</td><td></td><td>ステップ6で低品質の読み取りをトリミング</td></tr><tr><td>cutadapt</td><td></td><td></td><td>ステップ6でのアダプターの取り外し</td></tr><tr>ステップ<td>6でのクリーンリードのボ</td><td>ウタイ</td><td></td><td></td>マッピング</tr><tr><td>Samtools</td><td></td><td></td>ステップ<td>6で発現プロファイルを作成するには</td></tr><tr><td>Bedtools</td><td></td><td></td>ステップ<td>6で発現プロファイルを作成するには</td></tr></tbody></table>

分離、シーケンスおよびヒト間葉系幹細胞からの細胞のマイクロ rna を分析

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

細胞外と循環の Rna (exRNA) と体の多くの細胞タイプによって生産されて唾、血漿、血清、牛乳、尿など多数の体液に存在します。これらの Rna の 1 つのサブセットは、転写レギュレータ-マイクロ Rna (Mirna) です。特定の細胞のタイプによって生成される miRNAs の線引き、体外培養システムを収穫する使用ことができます、プロファイル exRNAs が 1 つのセルのサブセットから派生しました。間葉系幹細胞の分泌因子は数多くの疾患を軽減することに関与している、ここでの in vitro モデル システムとして使用されます。本稿では、コレクションのプロセスは、小さな RNA の精製とシーケンス細胞外 miRNAs にライブラリを生成をについて説明します。文化メディアから ExRNAs は細胞 RNA から最適化されたプロシージャの呼び出し、RNA の低入力サンプルをされているによって異なります。このプロトコルは、exRNA の精製とシーケンス中に各段階で品質管理のチェックポイントを示す文化メディアから小さな exRNA シーケンスに包括的なガイドを提供します。

このプロトコルで説明する方法は、次世代シーケンシングの MSC 文化から exRNA を収集するために最適です。左の図 1は、ワークフローの全体的なスキームとそれぞれ品質管理チェックポイントには右側に。
コレクションの日に細胞の形態 (図 3 a) 未分化し、区別される (図 3 b) セルが表示されます。さらに、7 日間の細胞の ALP 活性の代表的な正規化されたレベルは、(図 3) をも示しています。ここでは、alp は、約 2.5 倍未誘導細胞の。
合流の MSCs の 3 T175 フラス...

このプロトコルは、小さな RNA ライブラリーの構築と次世代シーケンシングのための細胞培養媒体からマイクロ Rna は細胞を浄化する方法を示します。さまざまな品質管理のチェックポイントは、exRNAs のような低入力サンプルを操作するときに期待するものを理解する読者を許可するように記述されています。

分離、シーケンスおよびヒト間葉系幹細胞からの細胞のマイクロ Rna を分析

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

これは、細胞から細胞外小胞に由来する小さなRNAの配列決定における技術的な問題に対処する最初の論文です。NGS サンプルには、厳格な準備と品質管理が必要です。EVの性質上、EVサンプルのQCプロセスは標準から逸脱しています。このプロトコルの利点は、初めてのユーザのためのQCステップです。この手順のデモンストレーションは、私の研究室の研究助手であるJunyi Suです。まず、5つのT175フラスコに新鮮なMSC培地で2,000細胞/平方センチメートルのヒト間葉系幹細胞をプレートします。その後、5%の二酸化炭素環境で摂氏37度で細胞を増殖させ、90%コンフルエント細胞の5フラスコが得られるまで、2〜3日ごとに培地を交換する。次に、フラスコあたり20ミリリットルのPBSで細胞を3回洗浄する。各フラスコに20ミリリットルのEV回収培地を加えます。そして、5%の二酸化炭素環境で摂氏37度で48時間インキュベートします。メディアを収集し、300グラムと摂氏4度で10分間遠心分離機。その後、上清を収集し、2,000グラムと摂氏4度で20分間遠心分離機。再び上澄み物を収集し、15、500グラムと摂氏4度で30分間メディアを遠心分離します。最後の時間の上清を収集します。次に、超遠心チューブにメディアを移します。ここでは60Ti固定角度ローターを使用し、ペレットはチューブの側面に固定されます。ペレットが予想される蓋の側面をマークし、ペレットが予想されるチューブの側面に円を描きます。そして、100、000グラムおよび摂氏4度で90分間exRNAをペレットする。最終的な遠心分離の後、上清を取り除く。チューブの底部に触れることなくチューブの内側を乾燥させるために吸収性の紙の小片を使用してください。そして、吸収性紙の上にチューブを反転します。ペレットを再懸濁するには、各チューブに200マイクロリットルのPBSを加え、チューブを30秒間渦出させます。ピペットは20回上下します。次に、ナノ粒子追跡解析で細胞外小胞やその他の生体分子を評価します。そして、さらなる実験までマイナス80度でペレットを保管してください。サンプルを解凍した後、RNA分離キットを使用して、メーカーのプロトコルに従ってRNAを抽出します。RNA分離キットに用意されているカラムからRNAを100マイクロリットルのRNAAseフリー水で溶出させます。エタノール沈殿を通してRNAを濃縮するには、グリコーゲン1マイクロリットル、2モルpH-5.5酢酸ナトリウム10マイクロリットル、および250マイクロリットルの予冷99%エタノールを精製RNAの100マイクロリットルに加えます。その後、RNAを沈殿させるために一晩マイナス20度でサンプルをインキュベートします。RNAをペレット化するには、16,000gおよび摂氏4度で20分間遠心分離機を用いた。次に上清を取り除き、75%エタノールの1ミリリットルでRNAペレットを洗浄する。再び16,000gと4°Cで5分間遠心分離機を使用してRNAをペレット化する。エタノールを取り出し、RNAチューブの蓋を5~10分間開いたままにして、RNAペレットを空気乾燥させます。RNAペレットを7マイクロリットルのRNAAseフリー水で再懸濁し、チップベースのキャピラリー電気泳動機を使用してRNAの品質と濃度を検出します。ライブラリーの構築を開始するために、5マイクロリットルのRNAを、あらかじめ冷蔵した0.2ミリリットルのPCRチューブに入れます。次に、RNAseフリー水の3'アダプターを1対10の体積比で希釈します。希釈したアダプターの0.5マイクロリットルをRNAチューブに加え、混合物を上下に8回ピペットします。チューブの底にあるすべての液体を収集するために簡単に遠心分離機。RNAアダプター混合物を摂氏70度で2分間、予熱熱サイクラーでインキュベートします。そして、冷やしたブロックにサンプルを戻します。次に、ライゲーションバッファーの 1 マイクロリットル、RNAse 阻害剤の 0.5 マイクロリットル、および 0.5 マイクロリットルの T4 RNA リガーゼを RNA アダプター混合物に加えます。ピペットは8回上下し、遠心分離機は短時間。その後、予熱サーマルサイクラーで1時間摂氏28度でチューブをインキュベートします。次に、0.5マイクロリットルのストップ溶液をサンプルチューブに加え、チューブをサーマルサイクラーに留めます。ピペットは8回上下し、摂氏28度で15分間インキュベートを続けます。RNAseフリーウォーターに5'アダプターを1対10の体積比で希釈します。希釈したアダプターの 0.5 マイクロリットルを別の 0.2 ミリリットル PCR チューブに加えます。5'アダプターを摂氏70度で2分間加熱します。そして、冷やしたブロックの上にサンプルを置きます。10ナノモルATPの0.5マイクロリットルとT4 RNAリガーゼの0.5マイクロリットルを5'アダプターチューブに加えます。ピペットは8回上下します。そして、遠心分離機は底にすべての液体を収集するために簡単に。次に、5'アダプター混合物の1.5マイクロリットルをRNAサンプルに加えます。ピペットは非常に穏やかに8回、そして1時間摂氏28度でサンプルをインキュベートします。cDNAを得るために、RNAAseフリー水中の逆転写酵素プライマーを1対10の体積比で希釈します。希釈したプライマーを0.5マイクロリットルをRNAサンプルに加え、ピペットを8回非常に穏やかに加え、遠心分離機を短時間加えます。その後、RNAとプライマー混合物を摂氏70度で2分間煮込んだ。そして、冷やしたブロックの上にサンプルを置きます。次に、5Xファーストストランドバッファーの1マイクロリットル、0.5マイクロリットルの12.5ミリモルDNTP混合物、0.5マイクロリットルの100ミリモルDTT、0.5マイクロリットルのRNAAse阻害剤、および0.5マイクロリットルの逆転写酵素をサンプルチューブに加えます。ピペット8回非常に穏やか。そして、遠心分離機は簡単に。予熱サーマルサイクラーで1時間、摂氏50度でサンプルをインキュベートします。次に、4.25マイクロリットルの超純水、12.5マイクロリットルのPCRミックス、インデックスプライマーの1マイクロリットル、ユニバーサルプライマーの1マイクロリットルをcDNAサンプルに加えます。ピペットは8回上下し、遠心分離機は短時間。最後に、サンプルをサーマルサイクラーに入れ、原稿に従ってサイクラーをセットアップします。RNAライブラリを精製するには、自動DNAサイズの分量化器を使用して、140から160の塩基対の間のバンドを溶出させます。抽出したライブラリーをカラムベースのPCR精製キットで実行し、10マイクロリットルのRNAAseフリー水でライブラリを溶出します。ライブラリのサイズを確認するには、精製されたライブラリの1マイクロリットルをDNAチップにロードし、メーカーのプロトコルに従ってください。ライブラリ濃度を定量化するには、まず1対1、000体積比で0.05%ポリソルベート20で10ミリモルpH-8.0 Tris-Hclで精製されたライブラリの1マイクロリットルを希釈します。次に、市販ライブラリ定量キットのDNA規格を使用してQPCRを実行します。最後に、シーケンスマシンの要件に応じてライブラリの量を均等にプールし、ハイスループットシーケンシングシステムでシーケンスを行います。細胞外RNAの電解液は広範囲のRNAを含んでいた。対照的に、細胞RNAは、5StRNA、5.8SrRNA、18SrRNA、および28SrRNAに対応する非常に明確なピークを示した。両方のライブラリの結果の品質は高く、同等でした。両方のライブラリーの長さの分布は、マイクロRNAと相関する22ヌクレオチドで単一のピークを示した。対照的に、細胞外RNAのライブラリーはより異種であり、tRNA、半分および断片、またはpiRNAと相関する2つのピークを含んでいた。細胞RNAからの読み取りの65%はヒトマイクロRNAにマッピングされ、他の小さなRNAのそれぞれがマッピングされた読み取りのごく一部を占めた。対照的に、細胞外RNAのわずか8%がヒトマイクロRNAと一致した。読み取りがマッピングされた最も豊富な小さなRNAはtRNAであり、比類のない読み取りは後に細菌配列に一致した。ウシのゲノムとの比較は、FBSが汚染源ではないことを示唆した。したがって、細胞外RNAは、通常の細胞RNAと比較して非定型プロファイルを示す。ライブラリの準備は、このプロトコルの重要な部分です。混合は、泡が形成されるのを避けるために非常に穏やかに行われなければなりません。この方法は、他の種類の細胞からのexRNAのプロファイルを調べるのにも使用でき、exRNAの機能を研究するのに役立ちます。

isolating-sequencing-analyzing-extracellular-micrornas-from-human

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

エキソソーム中の安定したマイクロRNA（miRNA）はの存在は、バイオマーカーとして、また治療的介入のためのルートとしての潜在的有用性のために、細胞間コミュニケーションの新たなモードとして莫大な利益を生成しました。ここでは、搬送中のmiRNAを識別するために、定量PCRに続いて、血液や文化メディアからエキソソーム浄化を示しています。...

血と文化メディア由来エキソソームの精製およびマイクロRNAプロファイリング

間葉系幹細胞(MSC)は、可溶性因子や特定の生体材料で刺激されると、骨芽細胞系譜への分化の可能性を持っています。この研究は、ウシ骨基質ヌクボン(NKB)を足場として採用したヒト羊膜(AM-hMSC)からのMSC送達のための新しいオプションを提示します。...

ヒト間葉系幹細胞の単離および多孔質骨基質上での栽培

分化したヒト神経幹細胞(hNSC)上のmiRNAの変化を特徴づける目的で、3次元システム上でのhNSC分化、miRNA...

三次元培養、マイクロRNAの分析と推定標的遺伝子上のヒト神経幹細胞株の分化

胆汁液は、潜在的に重要なバイオマーカーを含む細胞外小胞/エクソソームの貴重な供給源です。このプロトコルは、miRNAプロファイリングを含むさらなる分析のために、ヒトの胆汁からエキソソームを単離するための堅牢な方法を表しています。...

ヒト胆汁からマイクロRNA含有エキソソームの単離とプロファイリング

ここで、我々は、ヒト臍帯（UC）および臍帯に胎児胎盤サンプル単離のための（CL）、ウォートンゼリー（WJ）、臍帯胎盤接合（CPJ）、および胎児胎盤（FP）裏地の解剖のためのプロトコルを提示しますそして外植片培養技術を用いて、間葉系間質細胞（MSC）の特徴付け。...

ヒト臍帯及び胎児胎盤由来間葉系間質細胞の単離および特徴付け

ここでは、小型RNAを分離し、マイクロRNAを強化し、ハイスループットシーケンス用のサンプルを準備するためのステップバイステップの戦略について説明します。次に、オープン ソース ツールを使用して、シーケンスの読み取りを処理し、マイクロRNA...

MicroRNAを分離およびシーケンシングし、オープンソースツールを使用してそれらを分析するための完全なパイプライン

成体マウス脳半球の異なる解剖領域からミクログリアを分離するためのプロトコルを提供し、続いて全長転写物の深い単一細胞RNAシーケンシングのための半自動化ライブラリ製剤を提供する。この方法は、健康と疾患におけるミクログリアの機能的不均一性を解明するのに役立ちます。...

ディープシングルセルRNAシーケンシングのための1つの成人マウス脳半球からの領域特異的ミクログリアの分離

ここでは、骨肉腫由来細胞外小胞で治療した間葉系幹細胞における間葉系幹細胞における、メチル化特異的プローブ増幅法を用いて、LINE-1要素のメチル化レベルを解析する。ウシ胎児血清から細胞外小胞を分離するための一般的な手順である超遠心分離も実証されている。...

骨肉腫由来細胞外小胞で治療した間葉系幹細胞のメチル化解析

このプロトコルは、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞の小さな細胞外小胞(hUC-MSC-sEV)を、シンプルなラボスケールのベンチトップ設定で分離する方法を示しています。単離されたhUC-MSC-sEVのサイズ分布、タンパク質濃度、sEVマーカー、および形態は、それぞれナノ粒子追跡分析、BCAタンパク質アッセイ、ウェスタンブロット、および透過型電子顕微鏡によって特徴付けられます。...

ヒト間葉系幹細胞から小さな細胞外小胞を単離するための簡単なベンチトップろ過法

本プロトコルは、培養ヒト間葉系幹細胞から代表的なEV(エキソソームおよびマイクロベシクル)を単離および特性評価するための差動遠心分離について説明しています。これらのEVのさらなる用途についても、本稿で解説しています。...

培養ヒト間葉系幹細胞からの細胞外小胞の単離、特性評価、および治療応用

学ぶ、ヒト間葉系幹細胞から細胞外マイクロRNAを分離・シーケンスし、ライブラリ構築と品質管理を含む完全なプロトコルを習得する。低サンプル量でのNGS解析に有用である。

分離、シーケンスおよびヒト間葉系幹細胞からの細胞のマイクロ Rna を分析

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