三次元培養、マイクロRNAの分析と推定標的遺伝子上のヒト神経幹細胞株の分化

次の実験の全体的な目標は、ヒト神経幹細胞株の分化マイクロRNAの評価、プロファイリング、および標的 Mr.NA の検証です。これは、まずヒト神経幹細胞を3次元培養系で培養し、細胞分化を誘導することで達成されます。2番目のステップは、軸索プロセスの成長を測定することにより、分化を定量化することです。

次に、マイクロRNA発現の変化をマイクロR-N-A-P-C-Rアレイで評価します。次に、選択した差次的に発現するmicroRNAの計算解析を行い、推定される標的mRNAのセットを同定します。最終的に、標的mRNAは、レポータープラスミド、トランスフェクション、およびデュアルルシフェラーゼアッセイによって検証されます。

したがって、ここで紹介する方法は、発現したマイクロRNAの特性評価など、神経幹細胞分野の重要な問題に答えるのに役立ち、分化中のヒト神経幹細胞のメッセンジャーRNAを標的とします。しかし、この方法は神経幹細胞生物学への洞察を提供することができます。また、間葉系幹細胞、人工多能性幹細胞、または分化誘導や分子特性評価を必要とする他のシステムなど、他の幹細胞システムにも適用できます。

この手法の視覚的なデモンストレーションは、ヒト神経幹細胞株の分化における重要なステップを分解し、マイクロRNAプロファイリングの研究と標的mRNAの検証を実証する手順の一部を示すのは、私の研究室の科学者であるLavaniaです。この手順全体は、無菌技術を使用して生物学的安全キャビネットで実行する必要があります。AL VX 12の各ウェルに追加して、足場を再水和します。

灌漑用の水を使用して調製した70%エタノールの2ミリリットルのウェルプレート。足場に触れないように、70%のエタノールをそれぞれの壁に分配します。70%エタノールを慎重に吸引し、すぐにD-M-E-MF 12のウェルあたり2ミリリットルで足場を1分間洗浄します。

洗浄手順を2回繰り返し、最終洗浄後にDMEMF12を注意深く吸引します。足場にD-M-E-M-F 12に2ミリリットルのラミニンをそれぞれに加えて、足場をコーティングします。プレートを摂氏37度で5%二酸化炭素加湿インキュベーターで最低2時間インキュベー

次に、温かいD-M-E-M-F 12シード各足場に約500,000人のヒト神経幹細胞またはH nscsを成長因子を含むRMM培地の150マイクロリットルの容量で洗浄します。プレートを3時間インキュベートして、3時間後に細胞が足場に落ち着くようにします。各ウェルに3.5ミリリットルのRMMを追加します 足場から細胞が外れないように注意してください。

プレートを7日間または21日間インキュベートします。RMM培地は1日後(最初の給餌)に交換し、最初の給餌から2〜3日後に再度培地を交換します。H nscsの3D培養から7日後と21日後。

RMM培地を取り出し、分化した細胞を4%パラフォームアルデヒドで固定します。次に、固定細胞を、蛍光色素標識で検出されたβ 3チューブリン一次抗体を使用して染色します。二次抗体細胞核はフックで対比染色されています。

β 3 チューブリン染色細胞の代表的な画像を撮影します。蛍光顕微鏡を使用して、画像をTIFFまたはJPEG形式で保存します。軸索突起の成長の測定は、image PRO plus sevenソフトウェア測定ツールを使用して行われます。

画像を開くには、ツールバーで測定オプションを選択し、トレース機能を選択します。トレースを開始するには、マウスボタンのトレースを軸索伸長の全長に沿ってクリックして軸索伸長の開始点を選択し、右クリックして各トレースを終了します。このようにして、視野内のすべての軸索伸長を測定し、測定値をピクセルまたはマイクロメートルとして表現します。

長さの測定値をスプレッドシートプログラムにエクスポートして、サンプルの比較および統計分析を行い、3次元培養されたHSCのマイクロRNA発現の変化を評価します。まず、添付のプロトコルに記載されているように、マイクロRNA抽出およびマイクロRNA CD NA調製を行います。マイクロRNA CD NAが取得された直後のテキスト。

リアルタイムPCR用のPCR成分混合物を15ミリリットルのチューブで調製します。2つのX-S-Y-B-Rグリーンマスターミックスの1375マイクロリットルを追加します。100マイクロリットルのマイクロRNA CD NA 275マイクロリットルのユニバーサルプライマーと1000マイクロリットルのRNAフリーウォータートランスファー。

PCR成分は、PCRローディングリザーバーに混合されます。96ウェルプレートPCRアレイを密封された袋から慎重に取り出します。マルチチャンネルピペッターを使用して、25マイクロリットルのPCR成分を添加します。

PCRアレイの各ウェルに混合します。各ピペッティングステップの後にピペットチップを交換して、ウェルシール間の相互汚染を回避します。光学接着フィルムと室温で1000GSで1分間遠心分離機を備えた96ウェルプレートは、気泡を除去し、プレートを目視検査してウェル位置に気泡が存在しないことを確認します。

リアルタイムサイクラープログラムにおける96ウェルプレートPCRアレイ。それに応じて、リアルタイムのサイクラー。その後、すべてのウェルのCT値を空白のExcelスプレッドシートにエクスポートしてPCRアレイデータ解析を行い、予測されたマイクロRNAターゲットの同定にオンラインで利用可能なアルゴリズムPIC ktarが使用されます。

脊椎動物のPIC ktar予測については、ここをクリックして、PIC KTARウェブインターフェースで新しいページを開きます。ドロップダウンメニューで種を選択し、目的のマイクロRNAをマイクロRNA IDボックスに挿入します。「Search for targets of a micro RNA」をクリックします。

PIC KTARスコアによってランク付けされたターゲットmRNAのリストが表示されます。得られたランキングは、マイクロRNAの比較表を作成するために使用されます。デュアルルシフェラーゼレポータープラスミドは、標的mRNAを検証するためのツールとして使用されます。ホタルおよび腎臓のルシフェラーゼ活性は、hela細胞のトランスフェクションの24時間後に測定されます。

50マイクロリットルの基質を10ミリリットルの溶液1に1つ加え、24ウェルプレートの各ウェルから細胞増殖培地を完全に取り除いて混合し、それぞれに300マイクロリットルの作業溶液を1つずつ加えることにより、作業溶液を1つ調製します。各ウェルの内容物100マイクロリットルをよく移します。24ウェルプレートのうち、96ウェルプレートの3ウェルまで10分間待機した後、発光取得用に設定されたルミノメーターでホタルルシフェラーゼ活性を測定する。

50マイクロリットルの基質、2〜10ミリリットルの溶液2を加えて十分に混合することにより、作業溶液2を準備します。すでに100マイクロリットルの作業溶液が入っている96ウェルプレートの各ウェルに、100マイクロリットルの作業溶液を2つずつ加えます。10分間待ってから、腎臓のエルルシフェラーゼ活性を測定します。

続いて、ホタルルシフェラーゼからの発光と腎臓ルシフェラーゼのルミネセンスの比率が計算されます。β 3 チューブリンを緑色で示し、フック付き核対比染色を青色で示した免疫化学染色を行った後、画像解析ソフトウェアを使用して軸索突起の測定を行い、3D スキャフォールド上の H NSCS の代表的なマイクロ写真を取得しました。3D足場で成長させたH非細胞と、従来の平坦な表面または2D培養で成長させたH非細胞との間の軸索突起伸長の比較は、1週間または3週間で3D分化したHSCがより大きな軸索突起伸長を示したことを示しています。

標的予測のための計算解析の結果、ここに示した情報、すなわち、microRNA、予測された標的遺伝子、精度、スコア、および集計値のリストが得られました。SOX 5およびNR 4 A 3が推定標的遺伝子として同定された。ここに示すように、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイを使用して、マイクロRNAのターゲットを検証しました。

SOX 5およびNR four A 3遺伝子のヒト3つの主要なUTRレポーターからの相対的なルシフェラーゼ活性は、示されたマイクロRNAの存在下で有意にノックダウンされました。このビデオを見れば、神経幹細胞での彼を分化する方法、マイクロRNAの発現を調査する方法、および標的Messenger.RNAの検証方法についてよく理解できるはずです。