Name: 三次元培養、マイクロRNAの分析と推定標的遺伝子上のヒト神経幹細胞株の分化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: 学ぶ三次元培養系を用いたヒト神経幹細胞の分化とマイクロRNA発現プロファイリング、およびデュアルルシフェラーゼアッセイによる標的mRNAの検証手法。この計算的手法は神経幹細胞生物学の理解に貢献する。

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我々は、HeLa培養およびトランスフェクションと彼女の技術的なサポートのためたhNSCの準備で助けるためのジュリーHeward、およびLavaniya Thanabalasundaramを認める。

3次元（3D）文化1. HNSC分化注：以前の出版物2に記載された倫理的に承認組織から、たhNSCを分離して導き出す。この手順に従いながら、倫理的、制度的なガイドラインに従ってください。 1.1）3D培養は、12ウェルプレートを使用して、 <ol><li>作業中は無菌技術を使用してください。生物学的安全キャビネットの中で、70％エタノールを2ml /ウェルを添加することにより再水和足場は、灌漑（WFIr）のために水を用いて調製。各ウェルの壁ダウン70％エタノールを分配することによって足場に触れないようにしてください。 </li><li>慎重に70％エタノールを吸引し、すぐに2ミリリットル/ウェルのDMEMで足場を洗浄する：1分間F12。二回洗浄手順を繰り返します。最終洗浄後にF12：慎重にDMEMを吸引。 </li><li> F12：DMEM 2 mlのラミニン/ウェル（10μg/ ml）を添加することによりコート足場。 5％のCO 2ハムで37℃でプレートをインキュベート2時間の最低idifiedインキュベーター。暖かいDMEMで洗浄プレート：F12。 </li><li> RMM +のGF150μlの容積の約50万たhNSCで各足場をシード。 </li><li>細胞が足場に落ち着くことができるように、5％CO 2加湿インキュベーター中、37℃で3時間静置します。 </li><li>よく足場から細胞を取り除くしないように注意しながらそれぞれにRMMの3.5ミリリットルを追加します。 </li><li> 7日間プレートをインキュベート。 RMM培地を交換（3.5ミリリットル/ウェル）1日（最初の給餌）の後に、もう一度最初の給餌から2〜3日後。 </li><li> 7日後、培地を除去し、免疫細胞化学（ICC）のために4％パラホルムアルデヒド（PFA）で細胞を固定したり/ウェルの全RNA抽出のための溶解試薬500μlの追加（≤-80℃で保存プレートを、または全RNA抽出に進む） 。 </li></ol>軸索プロセスの伸長の1.2）測定<ol><li> 4％PFAを標準ICCプロトコル20を用いてβに応じた差別たhNSCを固定染色3チューブリン（TUBB3）蛍光色素結合二次抗体を用いて検出した一次抗体。ヘキスト（1μM）との対比染色細胞核。 </li><li>蛍光顕微鏡を用いてβ3チューブリン染色された細胞の代表的な画像をキャプチャ。 TIFFやJPEGなどの画像を保存します。ソフトウェア測定ツール（ 例えば、イメージ·プロ·プラス）を使用して軸索プロセス伸長の尺度。 </li><li> 、画像を開いて、ツールバーでの測定オプションを選択して、トレース機能を選択します。 </li><li>トレースを開始するには、マウスボタンをクリックすることにより、軸索伸長上の開始点を選択します。軸索伸長の全長に沿ってトレースする。右の各トレースをクリックして終了します。視野内のすべての軸索outgrowthswithを測定するために繰り返します。 </li><li>ピクセルまたはミクロン（保留中のキャリブレーション設定する）などの測定値を表す。サンプルの比較や統計分析のためにスプレッドシートプログラムにエクスポート長さの測定。 </li></ol> 2. miRNA発現幹細胞を用いたと発生経路集束のmiRNA PCRアレイ 2.1）のmiRNA全RNA抽出<ol><li>足場および2D成長したサンプル（分化し、未分化、hNSCコントロール）上のmiRNA抽出を行う。 </li><li>必要に応じて、12ウェルプレートに挿入融解足場。同じ1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブ中で2つのウェル、最終体積溶解試薬の1ミリリットルの溶解試薬の内容（500μl）を組み合わせる。ウェルの足場を残すように注意してください。 </li><li>以前に収集されたとして乾電池をペレット化2D成長したサンプル（差別hNSC 2D培養および未分化制御）のために溶解試薬の1ミリリットルを追加し、1.5 mlのマイクロチューブに内容を転送。 </li><li> 1mlシリンジおよび短い20〜25ゲージ針を用いて各試験サンプルをホモジナイズする。均質な溶解液が達成されるまで、1ミリリットルを5回まで注射器を用いて針を介して溶解液を渡します。 </li><li>各エッペンドルフチュー​​ブに200μlのクロロホルムを加え、しっかりとキャップ。反転とボルテックスチューブに内容物を混合。 </li><li>遠心し≥12,000X gで15分間ホモジネートを含む各1.5ミリリットルのマイクロチューブ。 </li><li> 100％エタノール750μlのを含む新しい1.5 mlのマイクロ遠心チューブに（すべての相間、ピンク色の液体を移送避ける）各サンプルの上部の水相を転送します。反転により完全に混合。 </li><li> 2 mlのコレクションチューブにミニカラム内に、沈殿物を含む各試験サンプル700μlの、最大ピペット。室温で約30秒間≥8,000×gで蓋と遠心分離機を閉じます。フロースルーを捨てます。サンプルの残りを使用して、この手順を繰り返します。 </li><li> 15分間のDNAダイジェストを実行します。 </li><li> ≥8,000×gで約30秒間のミニコラムや遠心分離機に700μlのバッファーRWTを追加します。フロースルーを捨てます。 </li><li> 500μlのバッファーRPEを追加し、≥8,000×gで約30秒間遠心分離することにより、ミニカラムを洗浄。フロースルーを捨てます。繰り返しwash.Ce1分間≥12,000×gでntrifugeはさらに、膜を乾燥させる。 </li><li>ミニカラムにRNaseフリー水を40μlを添加し、≥8,000×gで1分間遠心分離することにより、1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブに総RNAを溶出する。適切な分光光度計を用いて全RNA濃度を測定します。 </li></ol> 2.2）のmiRNA cDNAを準備<ol><li>逆転写マスターミックスを調製する。各サンプルを5倍miScript混錬バッファー4μlの、10倍nucleicsミックス2μlのを必要とし、2μlを転写酵素ミ​​ックスを逆miScript。 </li><li> PCRチューブ内のマスターミックスのアリコート8μlの総RNA（250 ng）を所要の体積を追加し、20μlの最終容量にRNaseフリー水を加える。 </li><li> miScript逆転写酵素ミ​​ックスを不活性化するために95℃で5分間、37℃C.Incubateで60分間インキュベートする。 </li><li> -20℃で、それぞれ20μlの逆転写反応に店舗を200μlのRNaseフリー水を追加、またはリアルタイムTIを進める私はすぐにPCR。 </li></ol> 2.3）幹細胞および発生経路は、miRNA PCRアレイの集束<ol><li> 2X SYBRグリーンマスターミックスの1375μL、100μLのmiRNA cDNA調製、10倍miScriptユニバーサルプライマーの275μlの、およびRNaseフリー水（総容量2,750μl）を1000μlのを追加して15ミリリットルチューブでPCR成分ミックスを調製する。 </li><li> PCR積載リザーバータンクのPCR成分ミックスを転送します。慎重に密封された袋から、96ウェルプレートのPCRアレイを削除。 </li><li> 8チャンネルピペッター、またはわずか8チップを使用して12チャネルピペッターを使用して、PCRアレイの各ウェルに25μlのPCR成分ミックスを加える。ウェル間の交差汚染を避けるために、各分注ステップ以下のピペットチップを変更します。 </li><li>気泡を除去するために室温（15~25℃）で、光学接着フィルムでプレートを密封し、1,000×gで1分間遠心する。視覚気泡ウェル中に存在しないことを確認するための下からプレートを検査。 </li><li>リアルタイムサイクラーで96ウェルプレートのPCR配列を配置します。 </li><li>プログラムは、それに応じてリアルタイムサーマルサイクラー：10分、および95℃で15秒間の45サイクル、および60℃で1分間、95℃で1サイクルは、単一の（蛍光データ収集）を設定する。 </li><li> PCRアレイデータ分析テンプレートExcelおよびWebベースのソフトウェアで使用するための空白のExcelスプレッドシートにすべてのウェルのCt値をエクスポートします。 注：ソフトウェアがで入手可能です<a href="http://www.SABiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php">www.SABiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php</a> 。 </li></ol> miRNAのターゲット予測とレポータープラスミドトランスフェクションおよびDdualルシフェラーゼアッセイによる標的mRNAの検証のための3.コンピュータ分析。 3.1）のmiRNAターゲット予測のためのコンピュータ解析<ol><li> [参照PicTar（ <a href="http://pictar.mdc-berlin.de/">http://pictar.mdc-berlin.de/</a> ）21、のmiRの識別のためのオンラインで利用可能なアルゴリズムNAは、予測のmRNAをターゲットにしています。 </li><li> 「脊椎動物でPicTar予測のためにはこちらをクリック」をクリックします。新しいページが開きます。 </li><li>新しいページ、PicTarのWebインターフェイスでは、ドロップダウンメニューで種を選択し、miRNAのID]ボックスに関心のmiRNAを挿入します。 miRNAのターゲットのための検索]をクリックします。 </li><li> aPicTarスコア順標的mRNAのリストを確認します。 注：PicTarが与えられたUTRは、選択したmiRNAの標的とし、種子の相補性、熱力学と共発現されたmiRNA 22のセットの中で共通の目標のためのコンビナトリアル予測に基づいてされる可能性を反映したスコアを計算します。 </li><li>同様にDIANA-LAB（使用して標的mRNAのリストを取得<a href="http://diana.cslab.ece.ntua.gr/microT/">http://diana.cslab.ece.ntua.gr/microT/</a> ）23、及びTargetScan（ <a href="http://www.targetscan.org/">http://www.targetscan.org/</a>利用可能な回線上）24、代替案をアルゴリズム。 </li><li> Mの比較表をコンパイルしますのiRNA異なるソフトウェアツールを使用して得られた順位に基づい。 PicTarは終わっ保全、種子の相補性に基づいて集計PCT（、結合の熱力学的自由エネルギーによって（信号対雑音比と予測された結果の重要性を評価するための精密なスコアに信号に基づく）精度によって、スコアによってDianaLabをランク付けし、TargetScan異なる種）は、 表1を参照のこと。 </li></ol>レポータープラスミドトランスフェクションおよびデュアルルシフェラーゼアッセイによる標的mRNAの3.2）の検証。 注：ターゲットmRNAの検証のための3 &#39;UTRルシフェラーゼレポーターは、以前に25を説明してきた。 <ol><li>トランスフェクション<ol><li> /ウェルで24ウェルプレート中に10 5細胞の密度でシードHeLa細胞。 </li><li>トランスフェクション試薬とNR4A3 3 &#39;UTRor SOX5 3&#39; UTRプラスミド100ngのいずれかの1.5μlのと同様に、20 nMのmiRNAを模倣（SOX5 3用HSA-のmiR-96-5pと24時間、共同トランスフェクトしたHeLa細胞の後217。ウェルあたりUTR、およびHSA-MIR-7-5p、それぞれNR4A3 3 &#39;UTRのためのHSA-MIR-17-5p）。 </li><li> NR4A3 3 &#39;UTRor SOX5 3&#39; UTRplasmidと蛍光色素ラベルネガティブコントロールsiRNAとの共トランスフェクト対照ウェル。蛍光標識されたネガティブコントロールsiRNA対照ウェルのトランスフェクションは、トランスフェクション効率の評価を可能にし、模倣のmiRNA 3&#39;UTR結合特異性を占める。 </li></ol></li><li>デュアルルシフェラーゼ活性の測定<ol><li>ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼ活性を24時間後にトランスフェクションを測定します。細胞増殖培地を除去します。 </li><li>私は、溶液Iの10ミリリットルに50μlの基質を添加することにより、作業溶液を準備。完全に混合する。私は、各ウェル24内にワーキング溶液を300μlを追加します。 </li><li> 96白いプレートの3ウェル、100μlのそれぞれに各24の内容を転送します。 10分待ってから、発光取得のためのルミノメーターセットでホタルルシフェラーゼを測定する。 </li><li>作業solutを準備イオンII溶液IIの10ミリリットルに基板IIの50μlのを追加することで、完全に混合する。私はすでに作業溶液Iの100μlのを含む各96ウェルに作業溶液100μlのを追加します。 </li><li> 10分待ってから、発光取得のためのルミノメーターセットでウミシイタケルシフェラーゼを測定する。ウミシイタケルシフェラーゼのホタルルシフェラーゼからの発光の比率を計算します。 </li></ol></li></ol>

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すべての著者は、従業員、株式および/ ​​またはReNeuron株式会社またはその親会社におけるストックオプション保有者である。 本研究は、ReNeuron（RENE.L）によってサポートされていました。

幹細胞の分化を評価し、改善するためのインビトロアッセイ新しい開発は、常にそれらの機能性および治療 ​​機能の調査のための課題を提示した。長期及びin vitro分化アッセイにおける強固な3Dの開発に必要なたhNSCの安定した取り付けは、材料や構造の点で特性の異なる複数の3Dの基板をテストすることによって対処されました。アッセイ開発の一環として、我々はまた、最適な細胞播種濃度を評価し、足場がラミニンは、被覆されるための要件を特定した。私たちたhNSC自発的に4-OHT及び増殖因子を除去すると分化することができるものの、標準的な2D分化したhNSCと比較した場合、軸索伸長工程によって測定されるように、3D培養システムの実装は、それらの分化能力の有意な改善を示した。 3D誘起differeの影響を調査するために、我々は、PCR配列を使用hNSC miRNA発現にntiation。標準チップマイクロアレイPCRアレイと比較して興味のあるmiRNAの直接定量と検証の利点を提供しています。 PCRアレイは96より少なく、ここで例えばアレイ当たりのmiRNAの総数の用語に制限されるが、それは以前に幹細胞の発生に報告我々の場合、特に関心のmiRNAを含むように調整することができる。経路当てmiRNAの発現は、未分化たhNSCと比べて3Dと2D区別たhNSCで紹介した。最も有意にダウンレギュレートされたmiRNAを選択し、オンラインで利用可能なアルゴリズム（DIANAラボ、PicTar、およびTargetScans）を使用して、それらの機能および生物学的解釈を決定することを意図し、その推定標的mRNAを評価するために分析した。 シングルmiRNAは、ターゲットの数百人を認識することができ、この理由のため、我々は中の適切な候補となり得る3 &#39;UTR mRNAsthatとのmiRNAの相互作用を検証xonal規制。 NR4A3、HSA-のmiR-7の目標、及びmiR-17ファミリーは、それらの発現レベルに応じて、海馬軸索の分化、生存、アポトーシスおよび調節に関与している、NR4Aファミリー核内受容体のメンバーである指導26。同様SOX5、HSA-のmiR-96の標的は、神経前駆体27の軸索の長さ28、マイグレーション後遊走、分化、およびニューロン29の投影における細胞周期の進行を制御することが報告されている。 SOX5およびNR4A3両方は、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイにより、それぞれ直接標的HSA-は、miR-96、およびHSA-のmiR-7及び17のmRNAとして同定された。デュアルルシフェラーゼ（ホタルおよびウミシイタケ）は同じプラスミド内の2つの異なるレポーター遺伝子に依存しており、単一のルシフェラーゼプラスミド系と比較して次善のトランスフェクションおよび細胞毒性効果による影響のために正規化を可能にする改良されたシステムを提供しています。私たちのアッセイ開発の一環として、我々はまた、当社のトランスフェクションconditiを最適化順番にアドオンは、高効率を得ることができる。 protocolsdescribedはここにさらに最適化し、前臨床試験および将来の臨床応用のためのintransplantationプロトコルをbeimplementedことがin vitroで hNSC分化を特徴づけるために利用することができる。

幹細胞研究はまた、組織工学、発達、細胞生物学、細胞治療、遺伝子治療の分野にまたがる再生医療において中心的な役割を果たしており、生体材料（足場と行列）。幹細胞は、両方の臓器developmentand組織修復において重要である。幹細胞がどのように機能するかを理解することは、新しい幹細胞ベースの治療法1を開発するための極めて重要である。 CTX0E03は妊娠初期ヒト胎児皮質から分離されたクローン、条件付きで不死化したヒト神経幹細胞（hNSC）ライン2である。 CTX0E03は適正製造基準（GMP）3の下で臨床細胞バンクに不可欠な品質特性を定義している。たhNSCは自然発生的に、ニューロン、グリア、およびオリゴデンドロサイトに分化することができると焦点虚血2,4,5のげっ歯類モデルに移植すると神経障害を改善することが証明されている。 CTX0E03たhNSCはストロークdisabilのための臨床試験に現在あるITY（NCT01151124 6とNCT02117635、Clinicaltrials.gov）。 miRNAは、長さが平均22個のヌクレオチドを有し、調節分子7であることが証明され、それらはタンパク質をコードしないが、むしろタンパク質へのそれらの安定性および翻訳を調節、mRNAの3プライム非翻訳領域（3&#39;UTR）に結合する。 miRNAは、開発、増殖、および分化8を含む多くの細胞プロセスの調節に関与することが報告されている。いくつかのmiRNAは、神経幹細胞9の運命および仕様の調節に関与している。 標準的な培養環境の二次元（2D）でのin vivo環境の複雑さが一致しない、ひいてはhNSC分化の誘導および調節は、最適ではない。 インビボで 、細胞が他の作曲3次元（3D）の微小環境に囲まれている多く含む細胞と細胞外のリガンド、コラーゲン、ラミニン、およびその他のマトリックスタンパク質（細胞外マトリックス、ECM）の種類。これまでの研究では、材料の建築の地形はECMを、それらの幾何学影響細胞の表現型と運命10-15を模倣することを報告した。市販の3D足場の数が利用可能です。我々は、細胞が侵入し、16〜18を区別することができますその中に3D空間を提供して厚さ200μmの膜の中に明確に定義された均一なアーキテクチャで設計され、高度に多孔質ポリスチレン足場を使用していました。 本明細書中に2Dおよび3D分化アッセイaxonprocess伸長を評価するために使用される。さらに、我々はさらに、その分化のmiRNAの効果を調べるために臨床グレードhNSCラインのmiRNA発現をプロファイリングするための方法を記載する。示され、ここでの方法は、もともと19に記載されているものに基づいています。

<table><tbody><tr><td>DMEM:F12</td><td>Invitrogen</td><td>21331-020</td><td>RMM培地</td></tr>調製<tr><td>用ヒトアルブミン溶液&nbsp;</td><td>バクスター・ヘルスケア・リミテッド&nbsp;</td><td>1501052</td><td>最終濃度 0.03%</td></tr> <tr><td>トランスフェリン、ヒト組換え</td><td>シグマ</td><td>T8158</td><td>最終濃度 &nbsp; 5 & マイクロで使用される RMM 培地の場合。g/ml</td></tr><tr><td>プトレシン DiHCl&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>P5780</td>最終<td>濃度&nbsp; 16.2 & microで使用されるRMM培地用;g/ml</td></tr><tr><td>インスリン、ヒト組換え体&nbsp;&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>I9278</td>最終<td>濃度&nbsp; 5&マイクロで使用されるRMM媒体用。g/ml</td></tr><tr><td>プロゲステロン&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P6149</td><td>最終濃度 60 ng/ml</td></tr><tr><td>L-グルタミン&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25030-24</td><td>最終濃度&nbsp; 2 mM</td></tr><tr><td>亜セレン酸ナトリウム&nbsp;&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9133</td><td>最終濃度40 ng/ml bFGFで使用したRMM培地</td></tr><tr><td>用&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>RMM培地に添加し、最終濃度10 ng/ml EGFで使用</td></tr>&<tr><td>nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-188</td><td>RMM培地に添加し、最終濃度20 ng/mLで使用</td></tr><tr><td>4-OHT</td><td>Sigma</td><td>H7904</td><td>RMM培地に添加し、最終濃度100 nMで使用</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>AMS Biotech</td><td>3400-010-10</td><td></td></tr><tr><td>TrypZean/EDTA</td><td>Lonza&nbsp;</td><td>BE02-034E</td><td></td></tr><tr><td>灌漑用水</td><td>Baxter Healthcare</td><td>UKF7114</td><td></td></tr><tr><td>Defined Trypsin Inhibitor (DTI) (store -20&deg;C)</td><td>Invitrogen</td><td>R007-100</td><td></td></tr><tr><td>Alvetex 12ウェルプレート&nbsp;</td><td>Reinnervate Ltd</td><td>AVP002</td><td></td></tr><tr><td>エタノール&nbsp;</td><td>メルク&nbsp;</td><td>1.00986.1000</td><td></td></tr><tr><td>&ベータ;IIIチューブリン抗体</td><td>Σ</td><td>T8660</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst Σ</td><td></td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy mini kit</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td></td><td></td>217004</tr><tr><td>RNaseフリーDNase&nbsp;</td><td>キアゲン&nbsp;</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>シグマ</td><td>C7559-5VL</td><td></td></tr><tr><td>miScript II RT キット&nbsp;</td><td>キアゲン&nbsp;</td><td>218160</td><td></td></tr><tr><td>SYBRグリーンPCRキット</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td></td><td></td>218073</tr><tr><td>細胞開発&Differentiation miScript miRNA PCR Array</td><td>Qiagen/ SABiosciences</td><td>MIHS-103Z</td><td></td></tr><tr><td>Lightcycler 480 white 96 plate</td><td>Roche</td><td>&nbsp;</td><td></td>4729692001</tr><tr><td>Lightcycler 480&nbsp; シーリングホイル</td><td>ロシュ</td><td>&nbsp;</td><td></td>4729757001</tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>ベクター NR4A3 miRNA 3' UTR ターゲットクローン&nbsp;</td><td>GeneCopeia</td><td>HmiT019538-MT0</td><td></td></tr><tr><td>ベクター SOX5 miRNA 3' UTR ターゲットクローン&nbsp;</td><td>GeneCopeia</td><td>HmiT017632-MT01</td><td></td></tr><tr><td>Allstars ネガティブ コントロール siRNA AF 488 (Qiagen)。</td><td>キアゲン&nbsp;</td><td>1027284</td><td>MiRNAトランスフェクションコントロール</td></tr><tr><td>Luc-Pair miR ルシフェラーゼアッセイ</td><td>GeneCopeia</td><td>LPFR-M010</td><td></td></tr><tr><td>Lightcycler 480&nbsp;</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GloMax 96 マイクロプレートルミノメーター&nbsp;</td><td>プロメガ</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

三次元培養、マイクロrnaの分析と推定標的遺伝子上のヒト神経幹細胞株の分化

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

神経幹細胞（NSCは）特定の局所微小環境下で、ニューロン、アストロサイトおよびオリゴデンドロサイトへの自己再生および分化が可能である。ここでは、現在のストローク障害（NCT01151124とNCT02117635、Clinicaltrials.gov）の臨床試験において、3次元（3D）の分化およびクローンヒト神経幹細胞（hNSC）ラインのmiRNA解析に用いられる方法のセットを提示する。たhNSCは倫理的に承認妊娠初期のヒト胎児皮質から誘導され、条件付きで構築するC-mycER TAMの単一コピーのレトロウイルスの統合を用いて不死化された。私たちは、3D足場および方法PCRアレイを用いたmiRNA発現の関連する変化を定量化するために区別たhNSCの軸索プロセス伸長を測定する方法について説明します。さらに我々は、miRNAの推定標的を選択することを目的とコンピュータ解析を例示する。 SOX5とNR4A3が大幅に選ばのに適したmiRNA推定標的として同定された下方制御する差別hNSCでDのmiRNA。のmiRNA標的の検証は、デュアルレポータープラスミドのトランスフェクションおよびデュアルルシフェラーゼアッセイによってSOX5およびNR4A3の3&#39;UTRで行った。

図1では、伝統的な平面培養（2D）と比較し、軸索プロセス伸長測定をexpressedas 3D足場にhNSC分化の調査と定量化を可視化される。 図2にrepresentedtheワークフローであり、幹細胞および発生経路を使用して、miRNAの定量の結果は、未分化の対照と比較して、2Dおよび3D分化したhNSCにおけるmiRNAの差次的発現を調べるためのmiRNA PCRアレイを当てた。 miRNAは、分化および未分化たhNSCの間の比較分析、およびターゲットの予測のための計算分析後、SOX5およびNR4A3（NOR1）は、推定上の標的mRNAとして同定された。 3&#39;UTR mRNA上のmiRNAおよびそれらの推定上の部位との間の直接の相互作用を研究するために、我々は、A、ホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子の下流に挿入SOX5またはNR4A3 3&#39;UTR配列のいずれかを含む2市販のプラスミドを使用<html> ND正規化のための同じプラスミドウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子に含む。 3 &#39;UTRルシフェラーゼ活性のダウンレギュレーションの代表的な結果を図3に示されている。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52410/52410fig1.jpg" /> 図1：3D足場上たhNSCの分化、および軸索プロセスES伸長の測定（A）β3チューブリン（緑）、ヘキスト（青）代表顕微鏡写真で対比原子核のための標準的なICC染色後は、取得したと軸索プロセスの測定であった画像解析ソフトウェアを用いて行った。 （B）1（1W）または3週間（3W）のための2Dおよび3D区別たhNSCで行われる軸索のプロセス伸長の測定を報告するダイアグラム。COM /ファイル/ ftp_upload / 52410 / 52410fig1highres.jpg「ターゲット= &quot;_空白&quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52410/52410fig2.jpg" /> 図2：差別たhNSCにおけるmiRNAプロファイリングの概略ワークフローの全RNA、miRNAを含むが、3D足場および標準2D文化、または未分化制御上の差別たhNSCのいずれかから抽出した。総RNA 250ngのは、ヒト細胞の分化および発達miScriptのmiRNA PCRアレイを有するmiRNAの定量に適したcDNAに成熟miRNAの選択的変換を容易にする方法でレトロ転写した。 SNORD61、SNORD68、SNORD72、SNORD95、SNORD96A、およびRNU6-2の地理平均2-ΔΔCT法に基づくデータ解析に使用した。有意な変化はSTAに畳む+/- 1.5およびダウンレギュレーションのように定義されたtisticallyかなりの程度。データはclustergramとして表される結果で利用可能なウェブベースのソフトウェアを用いて分析した。 図3 19から変更。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52410/52410fig2highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52410/52410fig3.jpg" /> 図3：miRNA標的の検証は、デュアルルシフェラーゼレポーター試験を用いてmRNAを予測した。 （A）miRNAの直接の標的として3&#39;UTR配列を検証するためのツールとして使用するデュアルルシフェラーゼレポータープラスミドの代表的な図。 （B）トランスフェクション効率を示す代表的な顕微鏡写真。 （C） &#160;の信号は、人間の3＆＃から、相対ルシフェラーゼ活性として表現39; UTR記者ofSOX5とNR4A3遺伝子が大幅にそれぞれHSA-のmiR-96の存在下でのノックダウン、およびHSA-MIR-7と17のmiRNA模倣された。 図5 19から変更。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52410/52410fig3highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td></td><td colspan="2"> DIANALAB </td><td> PicTar </td><td> TargetScan </td></tr><tr><td> miRNAの </td><td> 標的遺伝子 </td><td> 標的部位は/遺伝子が見つかりました。 </td><td> 精度 </td><td> スコア </td><td> 集計P CT </td></tr><tr><td> HSA-のmiR-96 </td><td> SOX5 </td><td> 1214/763 </td><td> 1 </td><td> 6.74 </td> &lt;TD&gt; 0.94 </td></tr><tr><td> HSA-MIR-183 </td><td> DUSP10 </td><td> 190分の302 </td><td> 0.72 </td><td> 4.75 </td><td> 0.85 </td></tr><tr><td> HSA-のmiR-302A </td><td> NR4A3 </td><td> 473分の863 </td><td> 0.84 </td><td> 3.05 </td><td> NF </td></tr><tr><td> HSA-MIR-182 </td><td> FOXN3 </td><td> 1358/794 </td><td> 0.94 </td><td> NF </td><td> 0.96 </td></tr><tr><td> HSA-のmiR-7 </td><td> NR4A3 </td><td> NF </td><td> NF </td><td> 1.61 </td><td> 0.17 </td></tr><tr><td> HSA-のmiR-7 </td><td> FOXN3 </td><td> 136分の399 </td><td> 0.17 </td><td> NF </td><td> 0.88 </td></tr><tr><td> HSA-MIR-20A </td><td> NR4A3 </td><td> 1650/841 </td><td> 0.85 </td><td> 5.87 </td><td> 0.63 </td></tr><tr><td><stronG&gt; HSA-MIR-20B </td><td> NR4A3 </td><td> 1955/973 </td><td> 0.9 </td><td> 5.87 </td><td> 0.63 </td></tr><tr><td> HSA-のmiR-17 </td><td> NR4A3 </td><td> 1928/961 </td><td> 0.9 </td><td> 5.38 </td><td> 0.63 + 0.37 </td></tr><tr><td> HSA-MIR-20A </td><td> EIF4G3 </td><td> 1650/841 </td><td> 0.97 </td><td> NF </td><td> NF </td></tr><tr><td> HSA-MIR-20B </td><td> EIF4G3 </td><td> 1955/973 </td><td> 0.94 </td><td> NF </td><td> NF </td></tr><tr><td> HSA-のmiR-17 </td><td> EIF4G3 </td><td> 1928/961 </td><td> 0.94 </td><td> NF </td><td> NF </td></tr></tbody></table> 表1：miRNAのターゲット予測mRNAのリスト 。 miRNAの代表表は、予測的遺伝子を標的、およびアルゴリズム分析（予測イオン/スコア/集計それぞれダイアナ·ラボ、PicTar、およびTargetScanを使用して提供される）。 表3 19から変更された。

分化したヒト神経幹細胞(hNSC)上のmiRNAの変化を特徴づける目的で、3次元システム上でのhNSC分化、miRNA PCRアレイによるマイクロRNA発現の変化の評価、およびmiRNAターゲット予測のための計算解析とデュアルルシフェラーゼアッセイによるその検証について説明します。

三次元培養、マイクロRNAの分析と推定標的遺伝子上のヒト神経幹細胞株の分化

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

本実験の全体的な目的は、ヒト神経幹細胞株における分化マイクロRNAのプロファイリングおよび標的mRNAの検証を行うことです。まず、3次元培養システムでヒト神経幹細胞を培養して細胞分化を誘導し、次に、軸索突起の伸長を測定することで分化量を定量化します。次に、microRNA発現の変化をmicroRNA PCRアレイで評価します。続いて、選択した発現変動microRNAの計算解析を行い、推定ターゲットmRNAのセットを特定します。最終的に、レポータープラスミド、トランスフェクション、およびデュアルルシフェラーゼアッセイを用いて、ターゲットmRNAを検証します。本手法を用いることで、分化過程にあるヒト神経幹細胞において発現するmicroRNAの特性解析や、その標的となるメッセンジャーRNAの同定など、神経幹細胞分野における重要な課題の解決に寄与できます。また、本手法は神経幹細胞の生物学的知見を得るだけでなく、間葉系幹細胞や人工多能性幹細胞、あるいは分化誘導と分子特性解析を必要とするその他の幹細胞システムにも適用可能です。この手法の視覚的な実演では、ヒト神経幹細胞株の分化、microRNAプロファイリングの解析、および標的mRNAの検証における重要なステップを詳しく解説します。手順の一部は、私の研究室の科学者であるlavaniaが実演します。全工程は、無菌操作を用いて生物学的安全キャビネット内で行ってください。AL VX 12の各ウェルに添加し、スキャフォールドを再水和させます。灌水用を用いて調製した70% ethanolを、ウェルプレートの各ウェルに2 mLずつ分注します。70% ethanolをウェルの壁面に沿って滴下し、スキャフォールドに触れないようにしてください。70% ethanolを慎重に吸引し、直ちに各ウェルに2 mLのD-M-E-M-F 12を加えて1分間、スキャフォールドを洗浄します。洗浄手順を2回繰り返し、最後の洗浄後、D-M-E-M-F 12を慎重に吸引します。各ウェルにD-M-E-M-F 12で調製したラミニンを2 mLずつ加え、スキャフォールドをコーティングします。プレートを37 °C、5% CO2の加湿インキュベーター内で、最低2時間インキュベートします。次に、プレートを温めたD-M-E-M-F 12で洗浄し、各スキャフォールドに成長因子を含むRMM培地150 µLの容量で、約500,000個のヒト神経幹細胞（H nscs）を播種します。細胞がスキャフォールドに定着するまで、プレートを3時間インキュベートします。3時間後、細胞がスキャフォールドから脱落しないように注意しながら、各ウェルに3.5 mLのRMMを添加します。プレートを7日間または21日間インキュベートします。1日後にRMM培地を交換します（これが1回目の給餌となります）。その後、1回目の給餌から2〜3日後に再度培地を交換します。これがH nscsの3D培養における7日目および21日目の工程です。RMM培地を除去し、分化した細胞を4%パラホルムアルデヒドで固定します。次いで、蛍光色素標識された二次抗体を用いて検出されるbeta three tubulin一次抗体で固定細胞を染色します。細胞核はHoechstで対比染色します。β3-tubulin染色した細胞の代表的な画像を撮影します。蛍光顕微鏡を用い、画像をTIFFまたはJPEG形式で保存します。軸索突起の伸長測定には、Image Pro Plus 7ソフトウェアの測定ツールを使用します。まず画像を開き、ツールバーの測定オプションからトレース機能を選択します。トレースを開始するには、軸索伸長の始点をマウスボタンでクリックし、軸索伸長の全長に沿ってトレースします。右クリックすると、個々のトレースが終了します。このようにして、視野内にあるすべての軸索伸長を測定し、測定値をピクセルまたはマイクロメートルで表示します。3次元培養したHSCのmicroRNA発現の変化を評価するため、サンプルの比較および統計解析を行う目的で、長さの測定値をスプレッドシートプログラムにエクスポートします。まず、付随するプロトコルに従い、microRNAの抽出およびmicroRNA cDNAの調製を行います。microRNA cDNAの取得後、直ちに以下の手順に進んでください。15 mLチューブ内で、リアルタイムPCR用のPCRコンポーネント混合液を調製します。2X SYBR Greenマスターミックス 1375 µL、microRNA cDNA 100 µL、ユニバーサルプライマー 275 µL、およびRNaseフリー水 1000 µLを加えます。PCRコンポーネントをPCRローディングリザーバーに混合します。密封袋から96ウェルプレートPCRアレイを慎重に取り出します。マルチチャンネルピペットを使用して、PCRコンポーネントを25 µLずつ加えます。PCRアレイの各ウェルに混合します。ウェル間の相互汚染を防ぐため、ピペッティングのステップごとにチップを交換してください。96ウェルプレートを光学用粘着フィルムで密封し、室温で1000 GSにて1分間遠心分離して気泡を除去します。プレートを目視で確認し、ウェル内に気泡がないことを確かめて配置してください。リアルタイムPCRサイクラーのプログラムにおける96ウェルプレートPCRアレイ。リアルタイムサイクラーを適切に設定します。続いて、すべてのウェルのCT値を空白のExcelスプレッドシートにエクスポートしてPCRアレイのデータ解析を行います。予測されるmicroRNA標的の同定には、オンラインで利用可能なアルゴリズムであるPIC ktarが使用されます。脊椎動物のpic ktar予測については、「click here」をクリックしてPIC KTARウェブインターフェースの新しいページを開いてください。ドロップダウンメニューから種を選択し、micro RNA IDボックスに目的のmicro RNAを入力します。その後、micro RNAのターゲットを検索するためにsearchをクリックしてください。PIC KTARスコアによってランク付けされた標的mRNAのリストが提示されます。得られたランキングを用いて、microRNAの比較表を作成します。標的mRNAを検証するためのツールとしてデュアルルシフェラーゼレポータープラスミドを使用し、HeLa細胞にトランスフェクションして24時間後にホタルルシフェラーゼおよびレナルルシフェラーゼ活性を測定します。基質50 µLを溶液1の10 mLに加え、十分に混合してワーキングソリューション1を調製します。24ウェルプレートの各ウェルから細胞増殖培地を除去し、各ウェルにワーキングソリューション1を300 µLずつ加えます。24ウェルプレートの各ウェルの内容物100 µLを、96ウェルプレートの3つのウェルに分注します。10分間静置した後、ルミネッセンス測定に設定したルミノメーターでホタルルシフェラーゼ活性を測定します。基質を50 µL、溶液2を10 mL加え、十分に混合して作業溶液2を調製します。作業溶液1を100 µLずつ加えた96ウェルプレートの各ウェルに、作業溶液2を100 µLずつ加えます。10分間静置した後、Renillaルシフェラーゼ活性を測定します。続いて、ホタルルシフェラーゼと腎ルシフェラーゼの発光比を算出します。3Dスキャフォールド上のH NSCSの代表的な顕微鏡写真を取得しました。ここでは、β3-tubulinを緑色で示す免疫化学染色と、Hoechstによる核のカウンター染色を青色で示しています。軸索突起の測定は、画像解析ソフトを用いて行いました。3Dスキャフォールドで育成したH nscsと、従来の平面表面または2D培養での軸索突起の伸長を比較したところ、1週間後および3週間後において、3D分化HSCsの方がより優れた軸索突起の伸長を示しました。標的予測の計算解析の結果、ここに提示するmicroRNAの予測標的遺伝子リスト、精度スコア、および集計値が得られました。SOX5およびNR4A3が推定標的遺伝子として同定されました。ここに示すように、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイを用いてmicroRNAの標的を検証しました。SOX5およびNR4A3遺伝子のヒト3' UTRレポーターを用いた相対的ルシフェラーゼ活性は、指定のmicroRNAの存在下で有意に抑制されました。このビデオを視聴することで、神経幹細胞における分化方法、およびmicroRNAの発現調査と標的mRNAの検証方法について十分に理解できるはずです。

differentiation-human-neural-stem-cell-line-on-three-dimensional

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

このビデオは、3次元の足場内でのヒト神経幹細胞の発生と分化を示しています。足場上のラミニンコーティングは細胞の接着を促進し、成長因子を含まない神経培地は細胞分化を誘導し、神経前駆細胞は多孔質構造内でプロセスを多方向に拡張して三次元培養を形成します...

多孔質足場を用いたヒト神経幹細胞の3D培養への分化

このビデオは、フィーダー細胞や中間ステップを使用せずに、ヒト胚性幹細胞(hESC)が直接神経前駆細胞に分化することを示しています。骨形成タンパク質またはBMPの選択的阻害およびトランスフォーミング成長因子-ベータ(TGF-β)シグナル伝達経路は、hESCの神経前駆細胞またはNPCへの分化につながります。...

ヒト胚性幹細胞の神経前駆細胞への分化

このビデオは、非トランスジェニックおよびトランスジェニックヒト多能性幹細胞(hPSC)から神経前駆細胞を生成する方法を示しています。hPSCは、ニューロン分化培地を使用して神経前駆細胞に分化されます。非トランスジェニック細胞では低分子を用いて分化が誘導されますが、トランスジェニックhPSCは、ニューロン分化特異的な転写因子のプロモーターを誘導する抗生物質を添加することで分化します。...

非トランスジェニックおよびトランスジェニックヒト多能性幹細胞の神経前駆細胞への分化

このビデオでは、ヒト胚性幹細胞を神経オルガノイドにするための段階的なプロトコールが示されています。この方法では、ニューロンのロゼット形成を誘導し、その後、疎水性膜上で制御された成熟と最終培養を行い、完全に発達した神経オルガノイドを達成します。...

ヒト胚性幹細胞の神経オルガノイドへの分化と成熟

この方法は、直接末梢血細胞から濃縮造血前駆細胞からのヒト神経幹細胞を誘導するために開発された。...

末梢血造血前駆細胞からヒト神経幹細胞の直接誘導

我々は2人のまたは3次元の胚様体を生成するために、マウスの胚性幹細胞を使用するためのテクニックを説明します。私たちは、その後、レチノイン酸によって胚様体細胞の神経分化を誘導する方法を説明し、どのように前駆細胞マーカーの免疫蛍光およびイムノブロッティングによりそれらの分化の状態を分析します。...

2および3次元の胚様体中のマウス胚性幹細胞のレチノイン酸誘発神経分化の分析

ヒトが誘導する多能性幹細胞（hiPSC）は、薬物および化学物質のスクリーニングならびに神経毒性を含む毒性試験のための新しいインビトロモデルの開発のための強力なツールと考えられている。ここでは、hiPSCをニューロンおよびグリアに分化させるための詳細なプロトコールが記載されている。...

神経毒性試験のための、ヒト誘導多能性幹細胞のニューロンとグリアの混合培養物への分化のためのプロトコール

ここで提示するプロトコルは、ヒト胚性幹細胞の単細胞培養の生成とその後の神経前駆細胞への分化のためのプロトコルである。プロトコルは、シンプルで堅牢でスケーラブルで、薬物スクリーニングや再生医療用途に適しています。...

ヒト胚性幹細胞の単細胞培養を用いた効率的な神経分化

吊り下げドロップ法を用いて、マウス胚性幹細胞を神経細胞に分化する手順について説明する。また、RT-qPCR、免疫蛍光、RNA-seq、フローサイトメトリーを通して包括的なフェノミック解析を行っています。...

マウス胚性幹細胞からの神経前駆細胞とニューロンの分化と特徴付け

この研究では、フローサイトメトリーと2つの蛍光レポーターまたは抗体による二重染色に基づいて複数のミトコンドリア機能パラメーターを測定し、ミトコンドリア体積、ミトコンドリア膜電位、活性酸素種レベル、ミトコンドリア呼吸鎖組成、およびミトコンドリアDNAの変化を検出する新しいアプローチを報告しています。...

ヒト人工多能性幹細胞における複数のミトコンドリアパラメータとその神経およびグリア誘導体のフローサイトメトリー解析

学ぶ三次元培養系を用いたヒト神経幹細胞の分化とマイクロRNA発現プロファイリング、およびデュアルルシフェラーゼアッセイによる標的mRNAの検証手法。この計算的手法は神経幹細胞生物学の理解に貢献する。

三次元培養、マイクロRNAの分析と推定標的遺伝子上のヒト神経幹細胞株の分化

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