Name: ルーチン組織試料中のバイオ マーカー タンパク質を定量化するため, 蛍光抗体法を検証するための標準として細胞の定量的免疫ブロット (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: 学ぶ定量的免疫ブロッティングと蛍光抗体法によるバイオマーカータンパク質の定量法。FFPE組織試料を用いた画像解析で、がん病理診断と治療予測の精度向上に貢献する客観的な手法です。

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この作品はフレドリック バンティングとチャールズ ・ ベスト カナダ大学院奨学金 (午前) 部分的に資金を供給されました。

主な人体組織サンプルを使用する健康科学関連教育病院研究倫理委員会 (HSREB) 女王の大学から承認されました。
1. 細胞ティッシュのマイクロ アレイ (TMA) の構築
<ol><li>収穫や洗浄のセルです。 注: このプロトコルは、様々 な確立の不死化細胞株 (例えばhela 細胞の Jurkat、RCH ACV) でテストされています。<ol>
<li>付着性のセルの約 80% の confluency に達すれば約 1.3 倍 107セルを収穫します。そのセルの行の適切な試薬を使用してセルをデタッチします。 注: エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)、トリプシン表面蛋白質を分解のリスクを軽減する以上一般に好ましい。トリプシンを使用している場合は、セルを収穫後すぐにウシ胎児血清 (FBS) を使用してトリプシンを中和します。</li>
		<li>浮遊細胞の場合約 8 × 107細胞成長のログ段階を収穫します。</li>
		<li>50 mL の円錐管に 225 x g で 5 分間遠心分離によって収穫戸セルを収集します。</li>
		<li>上清をデカントし、再リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) X 1 の 10 mL にペレットを中断します。225 x g で 5 分間遠心し、上清をデカントします。 注: 1x PBS、1.8 mM KH2PO4蒸留水; 10 mM Na2HPO4、2.7 mM KCl 137 mM の NaCl ので構成されます。7.4 に pH を調整します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ホルマリンのセルを修復して、それらをペレットします。<ol>
<li>10% 中性緩衝ホルマリン (NBF) の 10 mL のコニカル チューブ内細胞ペレットを中断します。 注: NBF は、9 mL の 1x PBS で 37% ホルムアルデヒド原液 1 mL を希釈して準備できます。 注意: は、ホルマリンやホルムアルデヒドを取り扱うときに注意を使用します。ホルマリンとホルムアルデヒドを含む手順のヒューム フードを使用します。</li>
		<li>(約 17 時間) 一晩室温で 24 回転でロッカーに細胞を孵化させなさい。</li>
		<li>PBS で低融点アガロースの 1% 溶液 (1 mL PBS あたり agarose の 0.01 g) を準備します。<ol>
<li>500 μ L 細胞ラインのサンプルあたりアガロース溶液のための十分を準備します。</li>
			<li>80 ° C 水お風呂や熱ブロックで、2-5 分の臨時混合アガロースを溶解します。解散後は、硬化を防ぐために 37 ° C 水バスまたは熱ブロックのソリューションを保持します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>ペレットから固定セル 1.2.2 ステップ 225 x g. で 5 分間遠心分離は、上澄みを除去し、500 μ L の 1x PBS で細胞を再懸濁します。</li>
		<li>1.5 mL 遠心チューブ、ペレットに 290 x g. 上澄みのすべてを吸引で 5 分間遠心分離によって細胞を転送します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>アガロースのセルをキャストします。<ol>
<li>セルを含む各管に (ステップ 1.2.3) から 1% アガロース溶液の 〜 500 μ L を追加します。優しく、しかし、すぐにはピペット P-1000 マイクロ ピペットを使用してミックスする上下の混合物です。 注: は、開口部を拡大し、泡の形成を避けるためにピペット チップの端を切り落とします。硬化を防ぐために 37 ° C の水浴中作業アガロース溶液を維持します。</li>
		<li>(5-10 分) を常温で硬化する agarose 携帯ソリューションを許可します。10%、NBF を各遠心チューブのサンプルを含む、(最大 24 時間) を埋め込むパラフィンまで室温で維持の 1 つの mL を追加します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>パラフィン包埋用アガロース プラグを準備します。<ol>
<li>サンプルから NBF を離れて吸い出しなさい。</li>
		<li>かみそりの刃を使用して遠心チューブを切断、プラスチック組織カセットにプラグインを配置するセルのプラグを取り外します。10% でカセットを保存常温 NBF。</li>
	</ol>
</li>
	<li>サンプルを処理手動で夜通しまたは自動ティッシュ プロセッサを使用して、標準組織学方法を使用してパラフィン ワックスで埋め込みます。 注: は、フィッシャーらを参照してください。19例プロトコル。</li>
	<li>特殊なを使用して"組織 arrayer"楽器、パラフィンから重複する 0.6 mm コア各セルラインからブロックし、TMA 培養細胞株を作成するために空の受信者パラフィン ブロックに行を挿入する、収穫。 注: 標準的な方法はヒョードルと De Marzo20に記載されているなど使用必要があります。</li>
	<li>TMA に正または負のコントロールとして 2-3 追加の組織型 (例えば、扁桃、コロン、精巣、等) を表す主なサンプルからコアを組み込みます。興味の蛋白質の適切な組織を選択します。</li>
	<li>ミクロトームを使用して 2 標本、約 4 に 6 μ m 厚い、セルライン TMA を準備します。組織学のスライドのセクションをマウント、乾燥させ、(前述のヒョードルと De Marzo20) を deparaffinize します。</li>
</ol>2. サンプルの蛍光抗体法による染色
<ol><li>一次抗体の希釈を最適化します。 注: 標準のプロトコルは、梶村らのように FFPE 組織セクションの IHC かの最適化21. アプローチの概要を紹介します。<ol>
<li>製造元の指示に導かれる興味の蛋白質に一次抗体の希釈を 4-5 を準備します。</li>
		<li>形態学的に認識可能な細胞集団の興味の蛋白質を表現する動物や人間のソースからコントロール組織型を識別します。組織のセクションを準備し、ヒョードルと De Marzo20のように標準的な免疫組織化学の手順スライドにそれらをマウントします。 注: 必要なセクションの数は、一次抗体希釈液に加えて、1 つ余分な数です。</li>
		<li>Immunohistology の自動または手動のシステムを使用して、テスト ステップ 2.1.2 からスライドで 2.1.1 各手順の一次抗体希釈液です。余分なスライドから一次抗体のアプリケーションを省略し、ネガティブ コントロールとして使用します。</li>
		<li>染色の過程では、4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 核対比染色と蛍光タグ二次抗体を持つすべてのスライドを染色します。高い感度が必要な場合使用、HRP (西洋わさびペルオキシダーゼ)-共役二次抗体とパスチラミドシグナル ベースの信号増幅システム (スタックらを参照してください。13)。 注: 一次抗体を多重化、各蛋白質の別の蛍光ラベルが使用されます。</li>
		<li>励起と検出波長使用された蛍光物質に適切なを使用してデジタル画像ファイルを生成することができる適切な装置を使用して immunostained スライドをスキャンします。</li>
		<li>適切なソフトウェアを使用して、デジタル画像を表示および経験的背景の蛍光性の相対的な信号強度を最適化する一次抗体希釈を選択します。 注: 必要な場合は、HRP 標識二次抗体、3, 3'-ジアミノベンジジン (軽打)、明視野顕微鏡を使用してこの最適化が発生することができます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>セルライン TMA に染色する場合を実行します。<ol>
<li>Immunohistology の自動または手動システムを使用して、最適化された一次抗体希釈 (定める手順 2.1) でセル行 TMA のスライドを染色します。2 番目のスライドから一次抗体のアプリケーションを省略し、ネガティブ コントロールとして使用します。</li>
		<li>染色の過程では、すべてのスライドおよび二次抗体とステップ 2.1.4 のようにパスチラミドシグナルが 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 核の対比染色としてを染色します。</li>
		<li>励起と検出波長使用された蛍光物質に適切なを使用してデジタル画像ファイルを生成することができる適切な装置を使用して immunostained スライドをスキャンします。</li>
		<li>画像解析ソフトウェア パッケージを使用して興味 (すなわち、細胞質と核) の細胞内コンパートメントを識別し、各セルラインの平均蛍光強度 (MFI) を定量化します。 注: さまざまなソフトウェア パッケージはこの目的に使用することができます、多くはスタックらで説明されます。13。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3 細胞の定量的免疫ブロット
<ol><li>セル lysates を準備します。<ol>
<li>1.1.1 から 1.1.3 への手順の説明に従って各セルラインの 200 万セルを収穫します。</li>
		<li>50 mL コニカル チューブ 650 x g で 5 分間細胞をスピンダウンします。上清をデカントします。</li>
		<li>10 ml の氷冷 PBS のセルを洗浄します。1 mL の氷冷 PBS と 1.5 mL 遠心チューブに転送で再懸濁します。3.1.2 のステップに従って遠心分離機、デカント、氷の上のセルのまま。</li>
		<li>細胞に冷たい radioimmunoprecipitation (RIPA) 換散バッファーとプロテアーゼ阻害薬 (RIPA 溶解バッファーの mL あたり 100 X 阻害剤の 10 μ L) の約 200 μ L を追加渦と 15 分間氷の上を孵化させなさい。 注: 効果的な換散のため必要な換散バッファー量細胞によって異なりますが、経験的に決定できます。RIPA バッファーは、150 mM の NaCl、5 mM, 50 mM Tris, EDTA 1.0 の NP 40%、0.5% デオキシ コール酸ナトリウム、蒸留水で 0.1 %sds で構成されます。</li>
		<li>比較的、immunoblots に荷を積むためには、各ライセート ブラッドフォードの試金など適切な方法を使用から 20 μ L のサンプルで総蛋白を定量化します。各細胞ライセートの残りの部分 (約 180 μ L) 6 X Laemmli 換散バッファーの約 40 μ L を追加し、5 分間熱ブロックや水浴 100 ° C で沸騰します。 注: 6 X 塩化物イオン バッファーは 300 mM トリス-HCl (pH 6.8) 4% (w/v) SDS、60% のグリセロール、0.6% (w/v) プロムフェノール ブルーとから成る 50 mM ジチオトレイトール (DTT) の蒸留水。</li>
		<li>2 週間の-20 ° C でサンプルを格納します。</li>
	</ol></li>
	<li>どのセルの行に興味の最も豊富な蛋白質を確認するすべての細胞ラインのイムノブロットを実行します。 注: マフムード、t. と陽、PC で説明されている手順に従います。22, 以下の変更。<ol>
<li>因数は (興味の蛋白質の豊富) によって蛋白質のライセート (の準備ステップ 3.1) 含む 10 50 μ g をセル マイクロ遠心チューブ用にします。2.5 μ L の 6 X 塩化物イオンとバッファーと 15 μ L にボリュームを作るに十分な RIPA 溶解バッファーを追加します。</li>
		<li>スタッキング 5% と (例えば、15 100 kDa のタンパク質の 10%) を解決する適切な濃度を読み込む蛋白質の梯子とステップ 3.2.1 からサンプル SDS ページのゲル。空井戸 1 X Laemmli バッファーに読み込みます。125 V、80 分またはブロモフェノール ブルー色素プレートの底に達するまで通常の適切な設定で電源を実行します。</li>
		<li>ヴィーデマンらと半乾燥タンパク質の転送を実行します。23。 注: の代表的な結果、(これはメタノール中で浸漬する必要はありません) 硝酸セルロースの膜、冷たい Bjerrum シェーファー ニールセン (BSN) 転送バッファーが使用されました。BSN バッファーは、48 mM トリス、39 mM グリシン、蒸留水で 20% メタノールで構成されます。</li>
		<li>編入後、かみそりの刃を使って水平 GAPDH などの適切な内部統制蛋白質からの興味の蛋白質を含んでいる部分を分離する膜をカットできます。</li>
		<li>一次抗体の製造元の推奨ブロック バッファーを使用してブロックと抗体の孵化に進みます。 注: 最適な一次抗体希釈液は、蛋白質量と感性によって大きく異なってきます。以下の代表的な結果の興味の蛋白質に抗体が必要縮尺希釈 GAPDH コントロール 1:40,000 希釈が必要です。使用される二次抗体の希釈は、1:3, 000 だった。</li>
		<li>抗体の孵化と膜の洗浄の後に、サンドイッチ バッグなど透明なプラスチック鞘膜ストリップを配置します。</li>
		<li>製造元の指示に従って誘起化学発光 (ECL) の混合物を準備します。ECL 混合膜をカバーし、シースを閉じて、1-2 分間室温で暗闇の中で混合膜のストリップをインキュベート P-1000 ピペットを使用します。</li>
		<li>デジタル イメージング プラットフォームに膜鞘を配置します。膜の様々 なエクスポー ジャーをキャプチャするのに化学発光と比色マーカー検出を使用します。 注: 露光時間はロードの蛋白質の量によって異なりますが、ターゲット蛋白質の豊富な抗体親和性などを数秒ずつ自動露出 (通常いくつか秒) とテスト露光時間の上と下で開始。</li>
		<li>経験的に、どのセルの行は、最もターゲット蛋白質を表現イメージ解析ソフトウェアを使用してか。</li>
	</ol></li>
	<li>シリアル希釈を使用して各一次抗体の線形動的な範囲を見つけます。<ol>
<li>手順 3.2.1-3.2.8 を実行 (手順 3.2.9 で識別される) ターゲット蛋白質の高い濃度を表現する細胞ラインからシリアル希薄の一連を使用して。</li>
		<li>ImageJ など画像解析ソフトウェアを使用すると、露出画像の密度測定を実行できます。<ol>
<li>たとえば、ImageJ を用いた定量化するのにゲルの最初の車線を選択するのに長方形選択ツールを使用します。への分析 |ゲル |最初のレーンを選択。隣の車線に結果として得られる四角形を移動するのにマウスを使用します。への分析 |ゲル |次のレーンを選択。繰り返し四角形を隣のレーンに移動し、車線の残りの部分のための車線を選択します。</li>
			<li>への分析 |ゲル |レーンのプロット。直線ツールを使用して、バック グラウンド ノイズを削除する各ピークの拠点間で線を描きます。杖ツールを使用して、各ピークを選択し、今後に結果ウィンドウからバンド強度と呼ばれる、それぞれのピークにおける密度を収集します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>総蛋白量各一次抗体のためにロード、バンド強度対の散布図を作成する出力密度を使用します。ベスト フィットと目視検査のラインで、各抗体の線形ダイナミック レンジの場所 (強度範囲) を特定します。</li>
		<li>タンパク質濃度より高い濃度のすべての細胞で前進する線形の範囲の端の値を生成するを選択します。 注: この濃度はこのタンパク質の最大量を持つ細胞における飽和レベル以下なので必要がありますない危険の他の細胞のバンドを公開する以上。</li>
	</ol></li>
	<li>すべての細胞の 3.3.4 でタンパク質濃度を使用して、イムノブロットを実行し、手順 3.2.1-3.2.8 を繰り返します。<ol>
<li>3.3.2 のステップのようにデジタル スキャンで密度測定を実行します。3.3.3 のステップで特定した各抗体の線形の範囲内の信号をもたらす露光画像を選びます。</li>
		<li>3.4.1 から理想的な露出からバンドの強度の信号を使用して、コントロール バンド強度の各セルの行を読み込むターゲット蛋白質バンド強度の比を計算します。これらの比の値は、興味のターゲット蛋白質の相対的な豊かさを示します。</li>
		<li>ピアソン相関テストを実行 (することができる統計ソフトウェア パッケージを使用して) 免疫ブロット (ステップ 3.4.2) から結果が得られた場合染色 (ステップの 2.2) 画像解析から得られた値を関連付ける。</li>
	</ol></li>
</ol>

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については、メソッドを利用する定量的免疫ブロット (IB) 蛍光抗体法 (IF) の有用性を実証する FFPE 組織サンプルのターゲット蛋白質の相対的な豊かさを判別します。現在蛋白質定量方法が発色 IHC2,3などそのカテゴリ性質またはサンプル、サンプル構造と細胞集団に調査を防止するなどを統一する必要性によって限られています。IB と質量8,9,10,11。定量の場合は、メソッドは検証され、慎重に適用される場合、これらの制限を越えることができます。不死化細胞株の定量的 iIF に場合の読み出しを比較すると、場合のアプローチの半定量的性質を検証することができました。
患者または実験動物から一次組織サンプルは、異種種...

ホルマリン固定のパラフィン埋め込まれた (FFPE) 組織生検試料中のタンパク質を定量化する必要が多くの臨床現場であります。たとえば、ルーチン生検のマーカー蛋白質の定量は予後の解明し、癌患者1の治療に知らせるためです。ただし、現在の方法は通常主観的であり、検証がないです。
免疫組織染色 (IHC) は病理学研究室で日常的に使用、通常ターゲット蛋白質の一次抗体と二次抗体酵素西洋わさびの過酸化酵素2などラベル付き共役によって異なります。従来の IHC は敏感で、作ることができる分の使用サンプルし、その関連する組織コンテキスト内でタンパク質発現の評価が行え組織サンプルの形態学的整合性を維持します。しかし、IHC によって生成された発色の信号は減算、のでそれが比較的狭いダイナミック レンジに苦しんで、2,3、4を多重化するため限られた可能性を提供しています。マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法 (MALDI MSI) をイメージングには、形態学的整合性が維持されます。しかし、発展するこの技術はささやかな形態の解像度に関連付けられて、大幅な校正と標準化、日常的に臨床使用5,6、7の可能性を損なうことが必要です。組織サンプル中のタンパク質を定量化するための代替技術は、免疫ブロット8質量9,10,11,、酵素免疫測定法 (ELISA)12、各均質化、始まるのサンプル組織ライセート。主な組織サンプルは、細胞の種類の多数を含む異種。したがって、サンプルの均質化を伴う技術が癌細胞のような興味の特定のセル人口のタンパク質の定量を許可しません。
場合、IHC の小に適用できるような FFPE サンプルし、組織学的整合性13の保持が可能します。場合、ただし、蛍光信号の添加物の性質のおかげで複数の一次抗体、蛍光ラベルの適用を受けやすいです。したがって、特定の細胞または細胞コンパートメント (たとえば、核と細胞質) 他の抗体を使用して定義内で比較的興味の蛋白質を定量化することがあります。蛍光信号も大きいダイナミック レンジ13,14の利点があります。優位性、再現性、多重性 FFPE サンプルに適用される場合は、実証された13,14,15をされています。
ここで興味の蛋白質の相対量を決定する際にコンピューター支援画像解析と組み合わされる場合の計量的性質を確認するためのゴールド スタンダードとして確立されたセルラインを使用して定量的免疫ブロットの使用について述べるFFPE 組織サンプルからの組織学的セクション。我々 は臨床の生検サンプル16,17,18バイオ マーカー蛋白質を定量化するための多重アプローチで正常にこのメソッドを適用しました。

<table><tbody><tr><td>697</td><td>DSMZ</td><td>ACC 42</td><td>細胞株</td></tr><tr><td>JeKo-1</td><td>ATCC</td><td>CRL-3006</td><td>細胞株</td></tr><tr><td>Jurkat</td><td>ATCC</td><td>TIB-152</td><td>細胞株</td></tr><tr><td>RCH-ACV</td><td>DSMZ</td><td>ACC 548</td><td>細胞株</td></tr><tr><td>Granta-519</td><td>DSMZ</td><td>ACC 342</td><td>細胞株</td></tr><tr><td>REH</td><td>DSMZ</td><td>ACC 22</td><td>細胞株</td></tr><tr><td>Raji</td><td>ATCC</td><td>CCL-86</td><td>HeLa</td></tr><tr><td></td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td>細胞株</td></tr><tr><td>トリプシン/EDTA溶液</td><td>Invitrogen</td><td>R001100</td><td>癒着細胞の剥離用</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清(FBS)</td><td>Wisent Inc.</td><td>81150</td><td>トリプシン</td></tr>中<tr><td>和ホルマリン</td><td>プロトコル</td><td>245-684</td><td>細胞ペレット</td></tr><tr><td>UltraPure 低融点アガロース</td><td>Invitrogen</td><td>15517-022</td><td>細胞ペレットを鋳造するため</td></tr><tr><td>マウスモノクローナル抗ヒト Bcl-2 抗体、クローン 124</td><td>Dako (Agilent)</td><td>cat#: M088729-2, RRID: 2064429</td><td>免疫活性および免疫ブロットにより Bcl-2 を検出するには (lot#:&nbsp;00095786</td></tr><tr><td>Ventana Discovery XT</td><td>Roche</td><td>-</td><td>免疫蛍光染色の自動化用</td></tr><tr><td>EnVision+ System- HRP 標識ポリマー (抗マウス)</td><td>Dako (Agilent)</td><td>K4000</td><td>免疫蛍光シグナル増幅用</td></tr><tr><td>EnVision+ System- HRP 標識ポリマー (抗ウサギ)</td><td>Dako (Agilent)</td><td>K4002</td><td>免疫蛍光シグナル増幅用</td></tr><tr><td>Cyanine 5チラミド試薬</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEL745001KT</td><td>免疫蛍光シグナル増幅用</td></tr><tr><td>Aperio ImageScope</td><td>Leica Biosystems</td><td>-</td><td>スキャンしたスライドを表示するには</td></tr><tr><td>HALO 画像解析ソフトウェア</td><td>Indica Labs</td><td>-</td><td>免疫蛍光</td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤の定量化 (Halt protease inhibitor cocktail, 100X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>1862209</td><td>に追加するRIPA緩衝液</td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸(EDTA)</td><td>BioShop</td><td>EDT001</td><td>RIPA緩衝液</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>BDH限定</td><td>56009</td><td>RIPA緩衝液</td></tr>用<tr>デ<td>オキシ塩化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td>RIPA緩衝液用</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>FisherBiotech</td><td>BP229</td><td>Laemlli緩衝液</td></tr><tr><td>ブロモフェノール</td><td>ブルーBioShop</td><td>BRO777</td><td>用Laemlli バッファー</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td> <td>Bio-Rad</td><td>161-0611</td><td>Laemlli バッファー</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td> <td>BioShop</td><td>ALB001</td><td>イムノブロット洗浄用</td></tr><tr><td>Protein ladder (Precision Plus Protein Dual Color Standards)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0374</td><td>ランニングプロテインゲル</td></tr><tr><td>用 フィルターペーパー (極厚ブロットペーパー)</td><td>Bio-Rad</td><td>1703969</td><td>ブロッティング用転写</td></tr><tr><td>ニトロセルロースメンブレン</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0115</td><td>ブロッティング転写用</td></tr><tr><td>トランスブロット SD セミドライ転写細胞</td><td>Bio-Rad</td><td>1703940</td><td>セミドライ転写用</td></tr><tr><td>脱脂粉乳 (脱脂粉乳)</td> <td>細胞シグナル伝達技術</td><td>9999S</td><td>ブロッキングバッファー用</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>BioShop</td><td>TWN510</td><td>洗浄バッファー</td></tr><tr><td>用 GAPDH ウサギモノクローナル抗体</td><td>Epitomics</td><td>2251-1</td><td>対照タンパク質の一次抗体 (lot#: YE101901C)</td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスIgG (HRP conjugated) 抗体</td><td>abcam</td><td>cat#: ab6789, RRID: AB_955439</td><td>イムノブロット用二次抗体</td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギIgG(HRP標識)抗体</td><td>abcam</td><td>cat#: ab6721, RRID: AB_955447</td><td>イムノブロット用二次抗体 (lot#: GR3192725-5)</td></tr><tr><td>Clarity WesternECL 基質</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1705060</td><td>イムノブロットシグナル検出用</td></tr><tr><td>Amersham Imager 600</td><td>GE ヘルスケア ライフサイエンス</td><td>29083461</td><td>イムノブロットシグナル検出用</td></tr><tr><td>ImageJ ソフトウェア</td><td>フリーウェア、NIH</td><td>-</td><td>デンシトメトリー分析用</td></tr></tbody></table>

ルーチン組織試料中のバイオ マーカー タンパク質を定量化するため, 蛍光抗体法を検証するための標準として細胞の定量的免疫ブロット

Quantitative Immunoblotting of Cell Lines as a Standard to Validate Immunofluorescence for Quantifying Biomarker Proteins in Routine Tissue Samples

ホルマリン固定のパラフィン埋め込まれた (FFPE) 組織サンプルの興味の蛋白質の定量化は臨床的に重要なアプリケーションを研究。定量化の最適なメソッドが正確で、線形ダイナミック レンジが広い、個々 のセルの種類を識別するためにできるようにするサンプルの構造の整合性を維持します。免疫組織染色 (IHC)、質量分析法、免疫ブロットなど現在メソッドが各はそのカテゴリの性質のためこれらの規定を満たすために失敗したりサンプルを均質化する必要があります。別の方法として蛍光抗体法 (IF) と画像解析 FFPE 組織の興味の蛋白質の量を決定するための使用を提案します。ここは、このメソッドは簡単に最適化し、広いダイナミック レンジが得られますは定量的免疫ブロットのゴールド スタンダードと比較して直線的に定量化を示します。さらに、このメソッドは、サンプルの構造の整合性の維持が可能、診断アプリケーションで重要となる可能性がありますさまざまなセルタイプの区別のためことができます。全体的にみて、これは FFPE サンプルの蛋白質の相対的な定量化のための堅牢な方法で、簡単に合わせて臨床や研究のニーズに適応することができます。

このプロトコルは FFPE 組織ブロック化細胞において抗アポトーシス蛋白 Bcl 2 の相対的な量を決定する場合の機能を確認するために使用されました。がん細胞に選択的に定量化 Bcl 2 発癌機構を解明することができますおよび病理組織学的診断と臨床管理決定24を通知に便利することができます。具体的には、Bcl 2 適切な b リンパ球の開発の役割を果たしているし、その表現はよくリンパ腫25,26,27のコンテキストで調査。図 1は、プロトコルに関連する手順をについて説明します。初期の場合の最適化手順で一次反 Bcl 2 抗体の様々 な希釈は手順 2.1 自動 immunohistology テナーを用いたヒト扁桃組織でテストされました。図 ...

ホルマリン固定のパラフィン埋め込まれた (FFPE) 組織サンプルに興味の蛋白質を定量化するための手段として画像解析と相まって蛍光組織学を検証する定量的免疫ブロットの使用について述べる。ルーチン生検試料中のバイオ マーカー タンパク質の相対的な量を判別する蛍光組織学の有用性を示した。

Quantification of proteins of interest in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples is important in clinical and research applications. An ...

この方法は、日常的に処理される生検材料からバイオマーカータンパク質を定量化することによって、癌病理の分野における重要な質問に答えることができます。従来の免疫検査に関連してこの技術の主な利点は、それが客観的であり、広いダイナミックレンジを有し、そして特定の細胞タイプにおけるタンパク質の定量化を可能にする。特定のいわゆるバイオマーカータンパク質の有無、またはより詳細には、癌生検標本におけるそれらのタンパク質の相対的な存在量は、特定の種類の癌の特定の病理学的診断を行う上で非常に有用であり得る。しかし、がん治療に対する反応を予測するのにも役立つため、この技術はがん患者の診断と治療の両方に関連しています。このプロトコルは、免疫蛍光ベースアッセイの定量性を検証するために、不死化細胞株におけるタンパク質定量法の使用法を主に説明します。しかし、免疫蛍光は多重化されたアプローチに容易に組み込まれ、一次生検サンプルに適用できることに注意することが重要です。この手順を支援し、デモンストレーションを行うのは、技術者のリー・ブードローとオペレーションディレクターのシェイケル・ヴァークです。両方とも女王の分子病理学研究所から。まず、前に収穫した細胞を225 Gsの50ミリリットル円錐管で5分間遠心分離する。上清をデカントし、細胞ペレットを10ミリリットルのPBSで再懸濁させた。次いで、再懸濁した細胞を225Gsで5分間遠心分離する。10%NBFの10ミリリットルで細胞ペレットを懸濁します。その後、一晩24 RPMでロッカーの室温で細胞をインキュベートします。細胞を固定した後、225 Gsで細胞を5分間遠心分離する。その後、上清を取り除き、PBSの500マイクロリットルで細胞を再懸濁します。細胞を1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに移し、遠心分離を介して細胞をペレット化する。その後、上清を吸引する。細胞を含む各チューブに約500マイクロリットルの1%アガロース溶液を加えます。その後、混合物を上下にピペットして混合する。アガロース細胞溶液が固まった後、チューブに10%NBFの1ミリリットルを加えます。後で、サンプルから NBF を削除します。カミソリの刃を使用してセルプラグを取り外し、プラグをプラスチック製のティッシュカセットに入れる。自動組織プロセッサでサンプルを一晩処理します。次に、サンプルをパラフィンワックスに埋め込み、標準的な占体法を用いる。組織アレイ装置を使用して、パラフィンブロックから6ミリメートルのコアを収穫し、空のパラフィンブロックに挿入します。この後、ミクロトームを使用して、新しく作成された細胞株TMAの2つの組織学的セクションを準備する。その後、占いのスライドにセクションをマウントし、それらを脱パラフィン化します。まず、細胞株TMAの2枚のスライドを自動染色システムにロードします。一方の側を最適な一次抗体希釈で染色し、他方を陰性対照スライドとして残します。両スライドに、核反汚れ、および二次抗体を適用する。染色プロセスの後、チラミドシグナル増幅試薬を加える。この後、使用された蛍光色素の適切な励起および検出波長を使用して、免疫染色されたスライドをスキャンします。画像解析ソフトウェアを使用して、対象となる細胞区画(核または細胞質のどちらを含むか)を特定し、各ラインの平均蛍光強度(MFI)を定量化します。どの細胞株が標的タンパク質の最大の存在量を有するかを決定するために、アリコートは、マイクロ遠心分離管に細胞リセートを貴重に調製した。その後、6xラエムリーバッファーの2.5マイクロリットル、および15マイクロリットルに総体積を持って来るために十分なRIPAのリシスバッファーを加えます。次に、SDSページゲルをタンパク質ラダーと、以前に調製したサンプルでロードします。この後、空の井戸にlaemlyバッファをロードします。青い染料がプレートの底に達するまでゲルを実行します。半乾燥タンパク質の転写を行った後、カミソリの刃を使用して膜を水平に切断し、目的のタンパク質を対照タンパク質から分離する。メーカーの指示に従ってブロッキングおよび抗体インキュベーションを行います。その後、透明なビニール袋に膜ストリップを入れます。P1000ピペットを使用して、膜をECL混合物で覆います。次に袋を密封し、暗闇の中で室温で膜を1〜2分間インキュベートします。次に、膜を含むビニール袋をデジタルイメージングプラットフォームに入れます。化学発光と色分けマーカー検出を使用して、膜のさまざまな露出をキャプチャします。画像解析ソフトウェア、または視覚観察を用いて、どの細胞株が最も標的タンパク質を発現しているかを決定する。この細胞株の連続希釈を免疫化した後、画像解析ソフトウェアを用いて露光画像を開きます。長方形選択ツールを使用して、ゲルの最初のレーンを選択します。その後、分析に行き、ゲル化し、最初のレーンを選択します。矩形選択ツールを次のレーンに移動してこのプロセスを繰り返し、解析、ゲル化、次のレーンの選択に進みます。次に、分析、ゲル、プロットレーンに移動します。各ピークのベースを横切って線を引く場合は、直線ツールを使用してバックグラウンドノイズを除去します。次に、杖ツールを使用して各ピークを選択し、結果ウィンドウから各ピークのバンド強度を取得します。密度測定出力を使用して、各一次抗体にロードされた総タンパク質の量に対してバンド強度の散布図を作成します。次に、最適な適合と視覚観察のラインを使用して、各抗体の線形ダイナミックレンジの位置を決定します。前に示したように、線状範囲内のバンド強度を生じるタンパク質濃度を選択し、そのタンパク質濃度を用いて全ての細胞系ライセートのイムノブロットを実行します。次に、デジタルスキャンで密度測定を行い、抗体ごとに以前に同定された線形範囲内のシグナルを生み出す露出を選択します。この後、各細胞株の負荷制御バンド強度に対する標的タンパク質バンド強度の比を計算する。最後に、統計ソフトウェアを使用して、IF染色の画像分析から得られた値と、免疫ブロット法から得られた値との間でピアソン相関検定を行う。このプロトコルは、抗アポトーシスタンパク質Bcl-2の相対量を決定するIFの能力を確認するために使用された。一次抗体の様々な希釈を免疫組織染色剤を用いてヒト扁桃組織で試験した。この実験では、1~50希釈が、バックグラウンドノイズの少ない強い信号を生み出す最適な希釈であると判断されました。この希釈は、免疫蛍光によって細胞株TMAを染色するために使用され、画像解析を用いてBcl-2に起因する細胞質Cy5シグナルを定量化した。試験細胞株のイムノブロットに基づいて、グランタ-519はBcl-2の最大の豊富さを有していた。次に、グランタ-519溶解物の連続希釈のイムノブロットを使用して、Bcl-2の線形ダイナミックレンジを見つけ、タンパク質GAPDHを制御した。このアッセイにおけるBcl-2のダイナミックレンジは、バンド強度が0近く、7500単位に及んだ。GAPDH のダイナミック レンジは 3000 ~ 6500 単位です。イムノブロットを、その線形範囲内の曝露で繰り返した。また、GAPDHに対するBcl-2の比率を各細胞株について計算した。ピアソン相関試験では、免疫ブロッティングからの強度比が、定量IFの強度測定値と強く、肯定的に相関していることを実証した。この手順を試みる間、すべてのバンドがそれぞれの線形範囲内にある最適な露出を見つけるためには、複数の時間ポイントの最終膜を露出することを覚えておくことが重要です。IFプロトコルの定量的性質を検証した後、標的タンパク質が発現する場所などの臨床問題に答えるために日常的に処理された組織サンプルにおいて、多重化IFについて改変することができる。

quantitative-immunoblotting-cell-lines-as-standard-to-validate

Research

JoVE Journal

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ルーチン組織試料中のバイオマーカータンパク質を定量化するため, 蛍光抗体法を検証するための標準として細胞の定量的免疫ブロット

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