ホルマリン固定パラフィン包埋細胞ペレット免疫組織化学制御のための標準化された処理(英語)
July 27th, 2022
ここには、免疫組織化学のためのホルマリン固定パラフィン包埋細胞ペレットコントロールを生成するためのプロトコルが示されています。
定義されたタンパク質または転写産物の発現レベルを有する十分に特徴付けられた陽性および陰性の細胞ペレットコントロールは、免疫組織化学アッセイの開発に不可欠です。このプロトコルは、固定されたパラフィン包埋細胞ペレットコントロールの処方を作成および処理するためのプロセスを記載する。このようなコントロールは、新しい免疫組織化学アッセイを開発しながら結合特異性を特徴付けるために使用できます。
IHCアッセイは、治療領域全体での発見とバイオマーカー開発の取り組みに不可欠であり、これらのアッセイの開発には検証済みのコントロールの開発が不可欠です。ヒドロキシエチルアガロースベースのゲルをセルペレットに添加する前に、少なくとも摂氏40度に加熱することが不可欠です。ゲルは固化する前に細胞とよく混合されなければならない。
30ミリリットルの10%中性緩衝ホルマリンを3ミリリットルのセルペレットに加え、10対1の固定液と細胞の比率を作成することにより、293T細胞ペレットの固定を開始します。しっかりと蓋をした50ミリリットルのチューブを繰り返し反転させて細胞を再懸濁し、室温で一晩沈降させます。固定を改善するには、翌日チューブを反転させ、細胞を再懸濁することにより、表面と体積の比率を増やします。
24時間の固定後、チューブを摂氏5度で930倍Gで10〜15分間遠心分離します。細胞ペレットが見えることを確認し、滅菌トランスファーピペットを使用してデカントまたは慎重に吸引して固定液を取り除きます。溶融ヒドロキシエチルアガロースベースのゲルを摂氏40〜60度で、ゲルとセルペレットの比率で1〜4個でペレットに加えます。
水道水ですすいだ目できれいな5インチと2ミリメートルの先端スターリングプローブを使用して、50ミリリットルのコニカルチューブの内容物を静かに攪拌し、底部の溶融ゲルに固定された細胞の均一な懸濁液を作成します。固定した細胞を溶融ゲルに均等に懸濁した後、クロニクルチューブに蓋をして湿った氷の上に5〜10分間置きます。ゲルペレットが固まったら、チューブの側面に沿ってきれいなマイクロスパチュラを慎重に置き、ペレットを突き刺さずにそっと活用します。
固化したペレットを生検紙の上に置きます。きれいなマイクロスパチュラを使用して、細胞ペレットを4〜5ミリメートルの厚さのスライスにトリミングして、26ミリメートルx 26ミリメートルx 5ミリメートルの組織カセットに収めます。個々のゲルペレットスライスを生検紙の中央に置きます。
反対側の2つの側面を折り、スライスを紙で包んでから、26 x 26 x 5ミリメートルのティッシュカセットに入れます。ふたを閉めます。トリミングした細胞ペレットカセットを、10%中性緩衝ホルマリンを充填したティッシュプロセッサーレトルトに入れ、短い処理スケジュールで実行します。
セルペレットを包埋するには、処理されたカセットを包埋センターの保持領域に配置する。ティッシュカセットの蓋を開き、生検用紙を慎重に広げます。セルペレットを切断面を下にして15×15ミリメートルの小さな使い捨て埋め込み型に入れる。
細胞ペレットを鉗子で型底にそっと保持しながら、62°Cの組織浸潤またはパラフィンを型に埋め込み、細胞ペレットを覆います。金型をコールドブロックに移動して、パラフィンを固化させます。パラフィンが固化している間にセルペレットを調整し、金型の下部の適切な位置に固定します。
カセットから蓋を取り外します。カセットの下面を下にして埋め込み型の上に置き、カセットを覆うために溶融パラフィンを追加します。ティッシュカセットの上にパラフィンが充填されたら、金型をコールドブロックに戻して固化させます。
回転式ミクロトームを使用して調製したパラフィン切片を浮遊浴から正に帯電したスライドにピックアップします。最初のセクションをカバースリップと染色境界内のスライドの上部に配置し、次のセクションを上下に連続して配置します。完了したら、最初に摂氏23度で24時間、次に摂氏60度で30分間スライドを乾燥させます。
この方法を使用して調製された包埋細胞ペレットは、ペレット内の細胞凝集および相互作用を最小限に抑えながら、切片全体に均一な細胞分布を示した。茶色のジアミノベンゼン、色原体、および3つの細胞株で免疫標識を視覚化すると、核内でTEAD転写因子発現のレベルが、なしから弱い、強い発現までさまざまに観察されました。細胞ペレットをマイクロアレイに組み込むことで、手順を変化させることなく、同じスライド内で発現レベルを変化させたコントロールの評価が可能になりました。
本実施例に示すように、PEG10欠損マウス胚性幹細胞の陰性対照及びPEG10を過剰発現する293T細胞の陽性対照が見られる。細胞が適切に固定され、ゲルペレット全体に均一に分布していることを確認することで、均一な標準化されたアッセイコントロールが作成されます。細胞ペレットは、標準的な抗原賦活化および標識法を用いた下流の免疫組織化学およびNC2ハイブリダイゼーションアッセイのコントロールとして使用できます。
細胞ペレットコントロールにより、特に新規または最小限の特性評価のタンパク質について、多くの免疫組織化学アッセイの開発が可能になりました。それらは、抗体特異性の特性評価に役立つ明確に定義されたコントロールとして機能します。
概要
この記事では、免疫組織化学アッセイ専用のホルマリン固定、パラフィン包埋セルペレットコントロールを生成するための詳細なプロトコルを提示します。この方法論は、新しいアッセイ開発時の結合特異性の正確な特性評価に不可欠です。
主要な研究要素
研究分野
- 免疫組織化学
- アッセイ開発
- バイオマーカー特性評価
背景
- アッセイ開発における明確な定義された陽性および陰性コントロールの重要性
- 抗体特異性を評価するための固定セルペレットの使用
- 治療領域研究およびバイオマーカー発見におけるコントロールの役割
使用方法
- セルペレットのホルマリン固定とパラフィン包埋
- ヒト293T細胞株
- 免疫ラベリングおよびハイブリダイゼーションアッセイ
主要な結果
- 均一な細胞分布を持つ標準化されたコントロールを成功裏に作成
- TEAD転写因子の異なる発現レベルを実証
- マイクロアレイを用いたコントロールの比較評価を容易に
結論
- 免疫組織化学におけるコントロール作成の信頼できる方法としてのプロトコルを確立
- 最小限に特性が特徴付けられたタンパク質を評価する際のアッセイの精度を向上
よくある質問
Executive Industry Relevance
Standardized formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) cell pellet controls address a critical gap in immunohistochemistry (IHC) assay development, especially for novel or poorly characterized protein targets. These controls enable robust antibody specificity assessment and quantitative benchmarking, supporting predictive confidence at the earliest stages of biomarker and therapeutic discovery. Their reproducibility and defined expression levels facilitate portfolio-wide assay standardization and cross-program comparability.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rigorous interrogation of antibody binding specificity for new targets.
- Supports biological de-risking by providing well-characterized positive and negative controls.
- Facilitates predictive confidence in target validation and early triage decisions.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, reproducible controls for IHC assay optimization and validation.
- Ensures quantitative assessment of protein expression across defined cell lines.
- Enables scalable preparation of controls for high-throughput screening and platform reuse.
Translational & Preclinical Research
- Aligns assay controls with disease-relevant protein expression profiles when tissue controls are unavailable.
- Supports continuity from discovery through preclinical biomarker validation.
- Reduces risk of false positives/negatives in translational biomarker studies.
Pipeline & Workflow Integration
FFPE cell pellet controls integrate seamlessly from early discovery through assay development and preclinical validation, providing a reusable standard for antibody and biomarker evaluation.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing and mechanistic de-risking by enabling controlled comparison of protein expression.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for assay readiness and compound evaluation.
- Analytics: Facilitates statistical comparison of expression levels and assay performance across conditions.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical workflows by providing consistent controls for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized control resource applicable across multiple programs and platforms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in antibody and assay validation.
- Operational Value: Enhances reproducibility, scalability, and standardization of IHC assay controls.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by minimizing assay development risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of biomarker and therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, fixation, and embedding techniques.
- Needs access to tissue processors, embedding centers, and microtomes for sectioning.
- Demands cross-team standardization of control preparation and documentation.
- Adaptable to various cell lines and engineered models for different targets.
- Dependent on rigorous fixation and embedding to ensure homogeneous cell distribution and assay reliability.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:57
Fixation of Cell Pellet
1:31
Trimming and Processing of the Cell Pellet
3:23
Embedding of Cell Pellet
4:27
Sectioning of the Cell Pellet
5:01
Results: Generating Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Cell Pellet Controls for Immunohistochemistry
5:53
Conclusion
