Name: ホルマリン固定パラフィン包埋細胞ペレット免疫組織化学制御のための標準化された処理(英語) (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-27T14:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: 学ぶホルマリン固定パラフィン包埋細胞ペレットの標準化処理法。免疫組織化学アッセイ開発における結合特異性の評価とバイオマーカー発見に有用な陽性・陰性コントロール作成プロトコルを解説します。

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ジェネンテックの研究組織の同僚、特に長年にわたってこれらの方法の開発に貢献した病理学コア(Pコア)研究所の協力に感謝したいと思います。

1.セルペレットの準備
<ol><li>4〜8個の150mm2または8個のxT175フラスコ中で、細胞株に推奨される培地および条件下で細胞を80%〜90%コンフルエントまで増殖させる。例えば、10%ウシ胎児血清と2 mM L-グルタミン15を含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)で293T細胞を増殖させます。 注:細胞は、目的の細胞株に必要な条件と培地を使用して増殖させる必要があります16。これらの条件は細胞株によって異なる場合がありますが、下流のペレット化方法は、培養条件に関係なく細胞株に適応できる必要があります。</li>
	<li>細胞がコンフルエント(80%〜90%)に近づいたら、増殖培地を真空ピペットで吸引し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を洗い流します。</li>
	<li>5 mLの5-10 mM EDTAを各フラスコに加え、フラスコを37°Cで5〜10分間インキュベートします。フラスコの側面を軽くたたいて細胞を取り除きます。 注:トリプシンは、一部の抗原に悪影響を与える表面エピトープを切断する可能性があるため、使用しないでください。<ol><li>細胞が除去されたら、細胞株に使用される5 mLの増殖培地(293T細胞の場合はDMEMなど)を各フラスコに追加し、細胞を50 mLのコニカルチューブに移します。</li>
	</ol></li>
	<li>コニカルチューブを930 x g で室温で5分間遠心分離します。遠心分離後、真空ピペット吸引により培地およびEDTAを除去する。</li>
	<li>細胞ペレットを10〜20 mLの1x PBSで洗浄し、複数のプレートまたはフラスコを使用する場合は、プレートまたはフラスコ( 図1に示されている実験では約6つのT175フラスコ)から細胞を単一の50 mLコニカルチューブにプールします。</li>
	<li>チューブを930 x g で5分間遠心分離します。遠心分離後のPBSを真空ピペットで吸引します。</li>
	<li>固定するまでセルペレットチューブを湿った氷の上に置いてください。 注:細胞は、分解酵素活性を制限し、細胞の自己消化およびタンパク質局在の変化を含む関連するタンパク質の変化を最小限に抑えるために冷却された状態に保たれます。</li>
</ol>2. 細胞ペレットの固定
<ol><li>30 mLの10%中性緩衝ホルマリンを3 mL細胞ペレットに添加して固定を行い、細胞比10:1(vol:vol)の固定液を作成しました。</li>
	<li>しっかりと蓋をした50 mLチューブを、細胞が完全に懸濁するまで繰り返し反転させます。 注:完全な固定の前に凝縮細胞ペレットを形成すると、不均一な固定を引き起こし、後の染色および免疫標識手順中にアーティファクトが発生する可能性があります。</li>
	<li>細胞懸濁液を室温で一晩沈降させます。</li>
	<li>翌日チューブを反転させて細胞を再懸濁し、表面と体積の比率を上げて固定を改善します。 注意: セルペレットをボルテックスは、セルの損傷を引き起こす可能性があるため、必須または推奨されていません。</li>
</ol>3.セルペレットのトリミングと加工
<ol><li>24時間固定後、50 mLコニカルチューブを930 x g で5°Cで10〜15分間遠心分離します。チューブがしっかりとキャップされ、均等に分散され、遠心分離機内でバランスが取れていることを確認してください。 注:固定時間は、実験室で使用される組織固定時間または特定の実験条件の要件を反映するように変更できます。</li>
	<li>遠心分離後、細胞が目に見えるペレットを形成することを確認します。デカントまたは滅菌トランスファーピペットで慎重に吸引することにより、固定液を除去します。</li>
	<li>溶融(40〜60°C)ヒドロキシエチルアガロースベースのゲル( 材料の表を参照)を、ゲルとセルペレットの比率が1:4(vol:vol)でセルペレットに加えます。</li>
	<li>水道水ですすいだ目付きのきれいな5インチ、2 mmチップのスターリングプローブを使用して、溶融ゲルを固定セルペレットに静かに攪拌し、50 mLコニカルチューブの底に溶融ゲル中の固定細胞の均一な懸濁液を作成します(図1A)。</li>
	<li>固定されたセルペレットと混合した溶融ゲルを入れたキャップ付きの50 mLコニカルチューブを湿った氷の上に5〜10分間置き、ゲル化したセルペレットを固化させます。</li>
	<li>きれいなマイクロスパチュラを使用して、チューブの側面に沿ってヘラを置き、ペレットを突き刺さずにそっと活用することにより、円錐形のチューブからペレットを慎重に取り除きます。ペレットを生検紙の上に置きます。</li>
	<li>きれいなマイクロスパチュラを使用して、細胞ペレットを4〜5 mmの厚さのスライスにトリミングし、各スライスが26 mm x 26 mm x 5 mmの組織カセットに収まるようにします(図1B)。</li>
	<li>個々のゲルペレットスライスを生検紙の中央に置きます。生検紙の反対側の2つの端をペレットの上に折り、包みます。包んだペレットを26 mm x 26 mm x 5 mmのティッシュカセットに入れます。蓋を閉め、生検ラップの広げた側面をティッシュカセットの蓋で圧着します(図1C)。</li>
	<li>トリミングしたセルペレットカセットを、10%中性緩衝ホルマリンを充填したティッシュプロセッサーレトルトに入れ、短い処理スケジュールで実行します。 注:短い処理スケジュールは、各レトルトで30分間、10%中性緩衝ホルマリンで始まり、一連のますますグレードの高いアルコールで脱水され、キシレンの3つの交換でクリアされ、60°Cの溶融浸透/包埋パラフィン(融点56°C)の2つの変更でパラフィンが浸透するまでで構成されます。</li>
</ol>4. 細胞ペレットの埋め込み
<ol><li>処理されたカセットを埋め込みセンターの保持領域に置きます。</li>
	<li>ティッシュカセットの蓋を開き、生検紙を慎重に広げます。</li>
	<li>セルペレットを、カット面を下にして、15 mm x 15 mmの小さな使い捨て埋め込み型に入れます。 注:小さな埋め込み型により、IHCアッセイ用の1つの染色されていない組織スライドに最大3つの細胞ペレットセクションを収めることができます。</li>
	<li>細胞ペレットを鉗子で金型の底にそっと保持しながら、62°Cの組織浸潤/包埋パラフィンを型に追加し、細胞ペレットを覆います。</li>
	<li>金型をコールドブロックに移動して、パラフィンの固化を開始します。パラフィンが固化している間にセルペレットを調整して、金型の底部の適切な位置に固定します。</li>
	<li>カセットから蓋を取り外します。カセットを下にして埋め込み型の上に置き、カセットを覆うように溶融パラフィンを追加します。</li>
	<li>ティッシュカセットの上にパラフィンが充填されたら、型をコールドブロックに戻し、固化させます17,18。</li>
</ol>5. 細胞ペレットの切片作製
<ol><li>切片の厚さを20μmに設定した回転ミクロトームを使用して、パラフィンブロックの全面と細胞ペレットがパラフィンセクションリボンに捕捉されるまで細胞ペレットブロックをトリミングします。これは、ブロックの「向き」と呼ばれます。</li>
	<li>表面ペレットブロックを氷浴トレイに5〜15分間冷やして浸し、切片化する前にブロックを冷やして水和させます。 注:ブロックが水和されると、セルペレットはパラフィンリボンで半透明になります。不透明な場合は、さらに浸漬する必要があり、アーティファクトが存在する可能性があります。</li>
	<li>セルペレットブロックのパラフィンリボンを、回転式ミクロトームを用いた連続切断モードで4μmまたは他の所望の厚さで切片化する。</li>
	<li>パラフィンリボンを42°Cに設定した水浮浴浴に置きます。</li>
	<li>回転式ミクロトームを使用して調製したパラフィン切片をフローテーションバスから正に帯電したスライドにピックアップします。<ol><li>カバーガラスと染色境界内のスライドの上部に最初のセクションを配置し、その下に2番目のセクションを配置し、その下に3番目の細胞ペレットセクションを配置します(図1D)。</li>
		<li>切片化後、スライドを室温(約23°C)で24時間乾燥させ、続いて60°Cで30分間乾燥させます。 注:スライドを60°Cで焼成した後、細胞ペレット切片は、熱誘導および酵素ベースの抗原賦活化を使用するプロトコルを含む、任意の標準IHCプロトコルで使用できます9。</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

すべての著者はジェネンテック/ロシュの従業員であり、そのため、ロシュの株主です。

このプロトコルは、下流の免疫組織化学および in situ ハイブリダイゼーション研究のコントロールとして使用できるホルマリン固定パラフィン包埋細胞ペレットを生成する方法論を説明しています。このプロトコルに記載されている組織学方法論は、多様な範囲の癌および初代細胞株に適用可能であり、主にこれらのペレットを製造するために日常的な組織学技術を適応させる17、18。処理および埋め込まれる場合、ペレットは組織と同様の方法で使用できます。これには、免疫組織化学実験のための熱誘導および酵素抗原賦活化プロトコルでの使用が含まれます。このプロトコルで使用される方法論の1つの目的は、プロセス全体を通して細胞の形態と抗原性を維持することです。そのため、形態や抗原性の両方の変化が比較的緩やかなEDTAが細胞の剥離に使用されます。これは、物理的な混乱などの他のアプローチが実行可能ではないということではありません。ただし、細胞を剥離するためのアプローチでは、その過程で細胞が損傷しないようにする必要があります。このプロトコルの2番目の目的は、同じ固定液、固定比、処理スケジュール(固定、脱水、透明化、およびパラフィン浸潤)、および埋め込み技術を使用して、組織と同様の方法で細胞を固定および処理し、ダウンストリームアッセイの同等のコントロールとして機能できるようにすることです。したがって、細胞ペレットを生成するために使用される固定および処理アプローチは、組織に使用されるアプローチを模倣する必要があります。
このレポートに記載されているプロトコルは、細胞が固定前に剥離、収集、遠心分離されるため、病原性細菌やウイルスに感染した細胞などの感染因子を含む細胞を処理するようには適合されていません。研究者は、剥離前に細胞を固定するためのプロトコルを検討するかもしれませんが、これには、細胞の形態を乱すことなく細胞を収集するためのさらなる最適化が必要になります。さらに、感染性病原体を有する細胞の固定時間および取り扱い条件は、感染因子および関連する施設のバイオセーフティプロトコルに基づいて追加の考慮事項を必要とする。
ホルマリン固定パラフィン包埋細胞ペレットは、明確に定義されたタンパク質発現レベル10を有するという点で他に類を見ない利点がある。がんおよび内因性細胞株は、さまざまなレベルのタンパク質発現を持つ細胞の選択を提供しますが、遺伝子工学技術により、科学者は目的のタンパク質を過剰発現し、CRISPR技術を使用して目的のコード遺伝子を切除または挿入することにより、タンパク質発現をモデル化できます20,21。.細胞株で過剰発現したタンパク質の欠点は、内因性タンパク質レベル22を表していない可能性があるため、アッセイの感度の尺度として不十分であることです。対照的に、内因性細胞株および癌細胞株の両方が内因性発現レベルをよりよく表すことができ、同族株におけるコード遺伝子のCRISPR媒介欠失は、対応するネガティブコントロールとして役立ち得る。さらに、さまざまなレベルのタンパク質発現を持つ内因性細胞株またはがん細胞株は、最終的な抗体希釈液を選択し、アッセイの感度を最もよく理解するための滴定実験に最適です(図2)。どの細胞株を使用するかの決定は、個々の実験ニーズに基づいて行われるべきであり、多くの場合、アプローチの組み合わせを利用します。
抗体が目的のタンパク質を検出できるかどうかを評価することに加えて、細胞株のパネルを使用して抗体の特異性を定義できます。例えば、密接に関連するタンパク質のファミリーを個別に発現する細胞株のパネルを使用して、抗体が個々のタンパク質に特異的であるかどうか、または他の密接に関連するタンパク質も検出するかどうかをテストできます。より精巧なコントロールには、CRISPRノックインまたは過剰発現のいずれかを介して、検出されている特定のシグナル伝達イベントを受けることができない点突然変異(例えば、リン酸化特異的抗体を評価する際の特定のリン酸化部位の突然変異)を有するタンパク質を発現する細胞株を使用することが含まれる場合があります。これらはより複雑なアプローチですが、抗体が特定の状況下で標識のみを使用したことを確認するために必要になる場合があります10。
細胞株の遺伝子操作は均質な細胞集団を生成しない可能性があることに注意することが重要です。例えば、過剰発現細胞株におけるトランスフェクション効率は通常100%ではなく、一部の細胞は目的のタンパク質を過剰発現させない場合があります。標準的な方法で検出できるトランスフェクションにFLAGまたは関連タグを含めることは、細胞株23のトランスフェクション効率を評価するのに役立ちます。これは、トランスフェクションが成功したかどうかを判断し、タンパク質発現による検出の欠如を除外し、目的のタンパク質を発現する細胞の予想される割合の参照として役立ちます。
In situ ハイブリダイゼーション(ISH)は、細胞ペレット中の標的遺伝子発現を特徴付け、IHCメソッド開発に情報を提供するための有益なツールにもなり得る10。抗体をスクリーニングする場合、転写産物、ひいては潜在的なタンパク質がいつ検出されるかを知ることは有益です。さらに、細胞ペレットISHスクリーニングは、ISHメソッド開発に有益です。特異性はISHアッセイではそれほど頻繁には問題になりませんが、ISH研究に適用できるコントロールの開発と利用については、適切なコントロールと同様の考慮事項を持つことが依然として重要です。
組織マイクロアレイは、ドナーブロックからコアを除去し、これらのコアを、多くの場合グリッドパターンでレシピエントパラフィンブロックに移すことによって作成されます。最終的に、受信者ブロックは、単一のブロック内にサンプルのスペクトルを含み、ブロック内のすべてのサンプルが同一のIHC手順を経ることを可能にし、同じスライド上の複数のサンプルを直接比較することを可能にする24,25。セルペレットは比較的均一な集団であるため、1 mmコアで正確に表すことができ、同様のアレイに含めるのに理想的な候補になります。細胞ペレットアレイを使用すると、さまざまな発現レベルの細胞ペレット、関連タンパク質を一意に発現する細胞ペレット、および異なる種由来の目的のタンパク質のオルソログを発現する細胞ペレットを1枚のスライドに含めることができます(図3)。これにより、試薬25の使用を最小限に抑えながら、全ての細胞ペレットを均一な条件下で迅速に同時に評価することができる。
このプロトコルでは、8つのT175フラスコから収集された2mLの最小開始細胞ペレット容量が推奨されます。このボリュームにより、複数の細胞ペレットブロックの製造とアーカイブが可能になり、細胞ペレット制御を長期間にわたって標準化し、特定のペレットから複数の細胞ペレットアレイを作成できます。より低い細胞ペレット容量は、初代患者由来の細胞株、成長の遅い細胞株を扱う場合、または条件によってサンプルの量が制限される場合に使用できます。もちろん、開始量が少ないと、ペレットの固定および調製中の細胞損失による悪影響が強まり、下流プロセスに利用できる材料が制限されます。遠心分離後に固定液を除去する際には、関連する損失を最小限に抑えるために注意することが特に重要です。サンプル量が少ない場合は、1.5 mLのキャップ付き遠沈管を使用して細胞をペレット化できます。これらのチューブは、処理のためにブレードで縦方向に二等分することができます。
組織固定と同様に、このペレット内の細胞固定は、下流のIHC評価にとって重要です。完全な固定を達成するために、ホルマリンと細胞ペレットの比率を少なくとも10:1で使用し、円錐管を反転させて細胞を懸濁状態に維持します。固定時に細胞が懸濁状態でない場合、不完全または不十分な固定のリスクがあり、下流の免疫標識に影響を与えます。多くの場合、これは周辺での強い標識およびペレットの中心における標識の喪失またはペレット全体にわたる可変強度の標識として現れる。
このプロトコルは、主にヒドロキシエチルアガロースで構成されるヒストゲルを使用して、細胞ペレットに結合し、細胞を細胞ペレット全体に均一に分布させます。それがなければ、細胞は圧縮され、細胞形態学的詳細を失います。これらの細胞形態学的詳細は、抗体が適切な細胞内コンパートメント(核、細胞質、原形質膜など)で標識されているかどうかに関する追加情報を提供するため、抗体スクリーニング中に重要になることがよくあります。対照的に、ゲルが多すぎると、ペレット内の細胞密度が低くなり、細胞が広く分布し、セクションあたりの細胞数が減少します。
このプロトコルは、IHCコントロールの開発に日常的に使用できます。これらのペレットを作成するために必要な材料は、調査生物学および組織学の研究室では一般的であり、方法は簡単で適応が容易です。細胞ペレットはIHCコントロールとしての制限がありますが、初期抗体スクリーニングのための優れたツールとして機能し、他の組織コントロールを補完します。

免疫組織化学(IHC)は、病理学の調査および診断において最も一般的に使用されるアッセイの1つです。状況とアッセイに応じて、IHCは、がんの診断1,2、治療反応の予測3,4、病原体の特定5、病変組織の細胞タイプの特性評価6、および生物学的経路と組織応答の研究7,8に使用されます。すべての状況において、IHCアッセイの基本原理は、抗体が目的の標的、最も一般的にはタンパク質に特異的に結合することであり、この結合事象はその後、組織切片9で視覚化される。しかしながら、IHCアッセイの最大の課題の1つは、抗体が目的の標的を特異的に検出していることを保証することである10。抗体の特異性はほとんどのイムノアッセイで課題ですが、免疫組織化学には、特異的標識と非特異的標識を区別するための分子量などの二次的な尺度がないという点で独自の課題があります。これは、明確に定義された細胞局在パターンを欠く、特性が不十分な、または遍在的に発現された標的を評価する場合に特に厄介です。したがって、結合特異性の特性評価に役立つ堅牢なコントロールは、新しいIHCアッセイ10を開発する際に重要です。
特徴的な細胞発現パターンで明確に定義されたターゲットの場合、組織コントロールはIHCメソッド開発で頻繁に利用されます。豊富な事前データに基づいて、抗体が発現することが知られている組織、細胞、および細胞内コンパートメントを標識しているかどうか、および抗体が存在してはならない組織成分を標識していないかどうかを判断できます11。しかし、組織コントロールは、既知の発現パターンのない特性が不十分な新規ターゲットや、広く発現していて明確な発現パターンがないタンパク質には、限られた用途しかありません。これらのシナリオの両方において、明確に定義された発現パターンの欠如は、組織における特異的標識と非特異的標識を区別することを不可能にする。このような状況では、セルペレットは貴重な代替IHCコントロールを提供します。細胞ペレットコントロールには以下が含まれます:目的のタンパク質の内因性または内因性/非誘導発現レベルを有し、そのタンパク質発現がウェスタンブロッティング、フローサイトメトリー分析によって特徴付けられるか、転写プロファイリングから外挿され得る癌または他の細胞株。目的のタンパク質を過剰発現させるか、目的のコード遺伝子が欠失した改変された細胞株。または、目的のタンパク質発現またはシグナル伝達イベント(リン酸化など)を誘導するために特定の条件下で処理された細胞10,12。細胞株における十分に特徴付けられたタンパク質発現レベルは、高、中、低、および存在しないタンパク質発現を有する細胞株のパネルを使用してアッセイの感度を評価することも可能にする。さらに、操作された細胞ペレットは、獣医種にとって貴重な種特異的対照であり得、そのために限られた特性評価または利用可能な組織対照13がある可能性がある。細胞ペレットには、細胞株に存在する限られたプロテオームが組織中の多様なプロテオームを反映しないなどの制限がありますが、抗体が目的のターゲットを検出できることを確認し、アッセイ10における一次抗体、二次抗体、または他のリージェントによる無差別な結合を排除するための適切なコントロールとして機能します。
診断および調査病理学のほとんどの組織は、中性緩衝ホルマリンで固定され、一連のアルコールで脱水され、キシレンで除去され、パラフィンワックスで処理および包埋されます。ホルマリン固定はタンパク質を架橋し、組織処理における固定および各追加ステップは、タンパク質およびそれらを検出する抗体の能力に直接影響し得る9、14。したがって、IHCアッセイで使用されるすべてのコントロールが、同じ固定、組織処理、および包埋手順を経ることが重要です。この記事では、ホルマリン固定パラフィン包埋組織でIHCアッセイを開発するためのコントロールとして機能する培養細胞を処理して埋め込むための独自の考慮事項について説明し、方法論は主に組織学研究室での細胞ペレットの取り扱いと処理に焦点を当てています。

<table><tbody><tr><td>10% 中性緩衝ホルマリン</td><td>VWR</td><td>16004-128</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 円錐管</td><td>Becton Dickinson Labware</td><td>#0747-1886</td><td></td></tr><tr><td>70% エタノール</td><td>Koptec</td><td>V1401</td><td></td></tr><tr><td>95% エタノール</td><td>Koptec</td><td>V1101</td><td></td></tr><tr><td>生検ラップ</td><td>Surgipath Medical Industries, Inc</td><td>#01090</td><td></td></tr><tr><td>Costar Stripette 血清学ピペット 10mL</td><td>コーニング</td><td>CLS4101</td><td></td></tr><tr><td>フレックス 100</td><td>エプレディア</td><td>8101</td><td></td></tr><tr><td>フレックス 95</td><td>エプレディア</td><td>8201</td><td></td></tr><tr><td>ヒストゲル</td><td>サーモサイエンティフィック</td> <td>#R904012</td><td></td></tr><tr><td>ライカ 自動ロータリーミクロトーム</td><td>ライカ</td><td>RM2255</td><td></td></tr><tr><td>マイクロスパチュラ、丸みを帯びたテーパーエンド</td><td>テッド・ペラ</td><td>#13510</td><td></td></tr><tr><td>NanoZoomer 2.0 HT ホールスライドイメージャー</td><td>浜松</td><td></td><td></td></tr><tr><td>パラプラスト組織浸潤/埋め込みパラフィン</td><td>Surgipath</td><td>39601006</td><td></td></tr><tr><td>ピペットコントローラー</td><td>CAPP</td><td>PA-100</td><td></td></tr><tr><td>試薬 アルコール</td><td>Epredia</td><td>9111</td><td></td></tr><tr><td>スターリングプローブ 5" 2mm チップ Eye Roboz</td><td>Surgical Instrument Co., Inc</td> <td>#RS-9522</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plusは、正に帯電した顕微鏡スライドThermo</td><td>Scientific</td><td>6776214</td><td></td></tr><tr><td>Tissueカセットをスライドします。PrintMate スロット付きカセット</td><td>Epredia</td><td>B851120WH</td><td></td></tr><tr><td>TMA ティッシュ グランドマスター</td><td>3DHistech Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>キシレン</td><td>VWR</td><td>89370-088</td><td></td></tr></tbody></table>

ホルマリン固定パラフィン包埋細胞ペレット免疫組織化学制御のための標準化された処理(英語)

Standardized Processing for Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Cell Pellet Immunohistochemistry Controls

標的タンパク質の発現が既知のポジティブおよびネガティブコントロールは、免疫組織化学(IHC)アッセイの開発に不可欠です。組織コントロールは、明確な組織および細胞発現パターンを持つ十分に特性評価されたタンパク質には有益ですが、新規タンパク質、特性評価が不十分なタンパク質、または遍在的に発現するタンパク質のIHCアッセイの初期開発にはあまり適していません。あるいは、標準化された性質により、定義されたタンパク質または転写産物発現レベル(高、中、低発現など)を有する癌細胞株、トランスフェクトされた過剰発現細胞株、またはCRISPRなどの細胞工学技術によって遺伝子が欠失した細胞株を含む細胞ペレットは、特に初期の抗体の特性評価および選択において、貴重なコントロールとして役立ちます。これらの細胞ペレットをホルマリン固定パラフィン包埋組織のIHCアッセイの開発に使用するには、組織処理に使用される手順を再現する方法で処理および埋め込む必要があります。このプロトコルは、IHCメソッド開発に使用できるホルマリン固定パラフィン包埋細胞ペレットコントロールを作成および処理するためのプロセスについて説明します。

アガロースベースのゲルの添加に続いて、細胞ペレットは取り扱いに適した固体ゼラチン状の塊を形成するはずです(図1B)。一度埋め込まれると、ペレットは固体組織に似た粘稠度を持ち、ミクロトーム上で日常的に切断するのが比較的容易でなければなりません。細胞ペレットが埋め込まれると、ホルマリン固定、パラフィン包埋組織と同じ方法で組織学およびIHC実験に使用できます。これには、市販のIHCプラットフォームを用いた間接発色検出法(例えば、図2および図3に示すように西洋ワサビペルオキシダーゼおよびジアミノベンジジン検出を有する二次抗体を使用する)による熱誘導エピトープまたは酵素抗原賦活化の使用が含まれる9。組織学的には、細胞は最小限の細胞凝集で切片全体に均一に分散する必要がありますが、接着細胞はペレット内で細胞間相互作用を維持する可能性があります。この分散により、個々の細胞を区別することができますが、この区別は、ゲルペレット内の細胞サイズと相対密度に大きく影響されます。核、細胞質、および細胞膜はより明確になり、分散時に視覚化しやすくなります(図2)。図2では、3つの細胞株がTEAD転写因子について免疫標識されています。免疫標識は、茶色のジアミノベンジジン(DAB)色原体で視覚化されます。細胞株は、TEAD転写因子の発現レベルが異なり、発現なし(図2A)から発現が弱い(図2B)、強い発現(図2C)までさまざまです。この例では、転写因子から予想されるように、核内で標識が観察され、目に見えるが標識がない細胞質および細胞膜には存在しない(図2)。細胞ペレットは、標準の23 mm x 75 mm x 1 mmスライド上の細胞ペレットマイクロアレイ(図3)に組み込むことができます。細胞ペレットをマイクロアレイに組み込むことで、同じスライド内で発現レベルが異なるコントロールの評価が可能になります。この例では、PEG10欠損マウス胚性幹細胞(左)がネガティブコントロールとして機能し、PEG10を過剰発現する293T細胞(右、茶色の免疫標識)がマイクロアレイのポジティブコントロールとして機能します(図3)。マイクロアレイに含まれる細胞ペレットの組織および埋め込み手順にばらつきはなく、マイクロアレイは、組織19に使用されるものと同様の方法を使用して生成することができる。
<img alt="細胞処理と包埋のワークフロー、サンプル調製から切片化までのステップを示す図。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64276/64276fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 図1:セルペレット処理 。 (A)細胞を50mLのコニカルチューブでペレット化し、ゲルと混合する。(B)固化したら、ペレットを26 mm x 26 mm x 5 mmのティッシュカセットに収まるように連続スライスします。(C)細胞ペレットは、組織処理装置に入れられる前に生検紙で包まれる。(D)最大3つの細胞ペレットを1枚の25mm x 75mmのガラス組織スライドに連続的に収集できます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64276/64276fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="免疫組織化学の結果;組織サンプル中の抗体染色;A、B、Cとラベル付けされた細胞マーカー。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64276/64276fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 図2:異なるレベルのタンパク質または転写産物発現を有する細胞ペレットを使用して、アッセイのダイナミックレンジを評価できます。 細胞ペレットは、TEAD転写因子について免疫標識されており、さまざまなレベルのTEAD発現を示します。(A)DAUDI細胞はTEAD発現を欠いており、細胞質または核に免疫標識がありません。青色染色は核のヘマトキシリン対比染色である。(B)293T細胞は、TEAD転写因子の弱い核標識(褐色ジアミノベンジジン(DAB)色原体)を示す。(C)デトロイト562細胞は、核内の強い茶色の標識によって実証されるように、TEADを強く発現します。細胞質(褐色核の周りのオフホワイトから灰色の領域)ではなく、核内の標識は、免疫組織化学アッセイの適切な標識を示しています。3つの細胞株すべてにおいて、細胞は分散しており、核および細胞質の形態を含む個々の細胞の可視化を可能にすることに注意してください。スケールバー = 25 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64276/64276fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="細胞染色プロセス;組織サンプルを比較する顕微鏡画像。セル密度の違いを強調します。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64276/64276fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 図3:タンパク質発現レベルが異なる複数の細胞ペレットを使用して作成された細胞ペレットマイクロアレイにより、1枚のスライドでコントロールを同時に評価できます。 PEG10欠損マウス胚性幹細胞(左)およびPEG10を過剰発現する293T細胞(右)は、PEG10について免疫標識されています。PEG10を過剰発現する293T細胞では強い標識(褐色DAB色原体)が観察されますが、PEG10欠損細胞では標識は見られません。青色はヘマトキシリン対比染色を表す。スケールバー= 200μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64276/64276fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

ここには、免疫組織化学のためのホルマリン固定パラフィン包埋細胞ペレットコントロールを生成するためのプロトコルが示されています。

Positive and negative controls with known expression of target proteins are essential for the development of immunohistochemistry (IHC) assays. While ...

定義されたタンパク質または転写産物の発現レベルを有する十分に特徴付けられた陽性および陰性の細胞ペレットコントロールは、免疫組織化学アッセイの開発に不可欠です。このプロトコルは、固定されたパラフィン包埋細胞ペレットコントロールの処方を作成および処理するためのプロセスを記載する。このようなコントロールは、新しい免疫組織化学アッセイを開発しながら結合特異性を特徴付けるために使用できます。IHCアッセイは、治療領域全体での発見とバイオマーカー開発の取り組みに不可欠であり、これらのアッセイの開発には検証済みのコントロールの開発が不可欠です。ヒドロキシエチルアガロースベースのゲルをセルペレットに添加する前に、少なくとも摂氏40度に加熱することが不可欠です。ゲルは固化する前に細胞とよく混合されなければならない。30ミリリットルの10%中性緩衝ホルマリンを3ミリリットルのセルペレットに加え、10対1の固定液と細胞の比率を作成することにより、293T細胞ペレットの固定を開始します。しっかりと蓋をした50ミリリットルのチューブを繰り返し反転させて細胞を再懸濁し、室温で一晩沈降させます。固定を改善するには、翌日チューブを反転させ、細胞を再懸濁することにより、表面と体積の比率を増やします。24時間の固定後、チューブを摂氏5度で930倍Gで10〜15分間遠心分離します。細胞ペレットが見えることを確認し、滅菌トランスファーピペットを使用してデカントまたは慎重に吸引して固定液を取り除きます。溶融ヒドロキシエチルアガロースベースのゲルを摂氏40〜60度で、ゲルとセルペレットの比率で1〜4個でペレットに加えます。水道水ですすいだ目できれいな5インチと2ミリメートルの先端スターリングプローブを使用して、50ミリリットルのコニカルチューブの内容物を静かに攪拌し、底部の溶融ゲルに固定された細胞の均一な懸濁液を作成します。固定した細胞を溶融ゲルに均等に懸濁した後、クロニクルチューブに蓋をして湿った氷の上に5〜10分間置きます。ゲルペレットが固まったら、チューブの側面に沿ってきれいなマイクロスパチュラを慎重に置き、ペレットを突き刺さずにそっと活用します。固化したペレットを生検紙の上に置きます。きれいなマイクロスパチュラを使用して、細胞ペレットを4〜5ミリメートルの厚さのスライスにトリミングして、26ミリメートルx 26ミリメートルx 5ミリメートルの組織カセットに収めます。個々のゲルペレットスライスを生検紙の中央に置きます。反対側の2つの側面を折り、スライスを紙で包んでから、26 x 26 x 5ミリメートルのティッシュカセットに入れます。ふたを閉めます。トリミングした細胞ペレットカセットを、10%中性緩衝ホルマリンを充填したティッシュプロセッサーレトルトに入れ、短い処理スケジュールで実行します。セルペレットを包埋するには、処理されたカセットを包埋センターの保持領域に配置する。ティッシュカセットの蓋を開き、生検用紙を慎重に広げます。セルペレットを切断面を下にして15×15ミリメートルの小さな使い捨て埋め込み型に入れる。細胞ペレットを鉗子で型底にそっと保持しながら、62°Cの組織浸潤またはパラフィンを型に埋め込み、細胞ペレットを覆います。金型をコールドブロックに移動して、パラフィンを固化させます。パラフィンが固化している間にセルペレットを調整し、金型の下部の適切な位置に固定します。カセットから蓋を取り外します。カセットの下面を下にして埋め込み型の上に置き、カセットを覆うために溶融パラフィンを追加します。ティッシュカセットの上にパラフィンが充填されたら、金型をコールドブロックに戻して固化させます。回転式ミクロトームを使用して調製したパラフィン切片を浮遊浴から正に帯電したスライドにピックアップします。最初のセクションをカバースリップと染色境界内のスライドの上部に配置し、次のセクションを上下に連続して配置します。完了したら、最初に摂氏23度で24時間、次に摂氏60度で30分間スライドを乾燥させます。この方法を使用して調製された包埋細胞ペレットは、ペレット内の細胞凝集および相互作用を最小限に抑えながら、切片全体に均一な細胞分布を示した。茶色のジアミノベンゼン、色原体、および3つの細胞株で免疫標識を視覚化すると、核内でTEAD転写因子発現のレベルが、なしから弱い、強い発現までさまざまに観察されました。細胞ペレットをマイクロアレイに組み込むことで、手順を変化させることなく、同じスライド内で発現レベルを変化させたコントロールの評価が可能になりました。本実施例に示すように、PEG10欠損マウス胚性幹細胞の陰性対照及びPEG10を過剰発現する293T細胞の陽性対照が見られる。細胞が適切に固定され、ゲルペレット全体に均一に分布していることを確認することで、均一な標準化されたアッセイコントロールが作成されます。細胞ペレットは、標準的な抗原賦活化および標識法を用いた下流の免疫組織化学およびNC2ハイブリダイゼーションアッセイのコントロールとして使用できます。細胞ペレットコントロールにより、特に新規または最小限の特性評価のタンパク質について、多くの免疫組織化学アッセイの開発が可能になりました。それらは、抗体特異性の特性評価に役立つ明確に定義されたコントロールとして機能します。

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Research

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ホルマリン固定パラフィン包埋細胞ペレット免疫組織化学制御のための標準化された処理(英語)

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