リズミカルにアクティブな準備体外新生児齧歯動物脳幹-脊髄損傷で薄くスライス

この方法は、ミリアン髄質呼吸ネットワークの捕捉された分析のためのげっ歯類の脳幹の再現性解剖およびスライスを容易にする。この技術は、大きな実験的柔軟性を提供し、インビトロのブロック解除または記録のためのスライス調製のいずれかを可能にします。この方法は、呼吸リズムを発生させる神経制御回路を探索し、遺伝子組み換えげっ歯類における呼吸の病理および調節不変を理解するために、電気生理学実験に使用することができる。

神経軸の解剖後、動物の単離された幹を素早く、解剖顕微鏡下で通気管腔に移し、槽の端部をチャンバーの正面に向けて、組織の裏側を上に置く。肩と脊髄の最も尾末に組織を固定し、頭頂縫合糸に続いて頭蓋骨を通して中頭座切開を行い、頭蓋骨の根底にある皮質と脳幹を損傷しないようにします。矢状縫合糸から始まり、横に働き、頭蓋骨の後頭縫合糸を切り取り、頭蓋骨の滑門部分を固定して安定させるために反射して固定することができる骨のフラップを作成します。

両方の頭蓋骨のフラップを反射した後、大脳皮質の残りの部分を切除し、小脳の尾骨部分を比較的無傷のままにして、後部切除術を行う。マイクロスプリングハサミと鉗子を使用して、頭蓋骨と椎骨柱を取り巻く筋肉を取り除きます。胸部の後側に沿って組織を取り除き、肋骨をそのままにして、椎骨層の側工程を慎重に切り取ります。

ポンと髄質の上に組織を切断した後、ベルミ、小脳、ポンおよび脊髄の始まりははっきりと見える。腹側ラミネ切除術を行うために、胸部背側を下に置き、胸部と脊椎の最も尾骨の端部にピン留めします。頭蓋骨のフラップを使用して組織のロストラル側を固定し、胸骨と腹部の器官のすべてを含む胸部の腹側半分を取り除きます。

胸部に取り付けられた軟部組織を解剖して肋骨と脊髄を露出させ、舌、食道、気管、喉頭、および頭蓋骨と脊柱の基部を覆う他のすべての軟部組織および筋肉を取り除く。硬いパレットを識別するために、v字型のインデントを含む頭蓋骨の基部にある骨のこの長方形のプレートの上に組織を解剖する。その後、パレットの正中線に沿って切断し、慎重に組織を上に持ち上げ、それを取り除くために横断カットを行います。

腹側ラミネ切除術を開始するには、薄層を取り除き、脳幹の腹側表面と脊髄を最初の頸椎から胸椎7程度に露出させ、薄層の脊柱の両側に沿って5〜10ミリメートルを切り取ります。脊髄が露出したら、両側に約20〜25ミリメートルの根根を両側に切り取り、脊柱に沿って約T7に切り取り、C1、C2、C3の鼻の端を引っ掛けたり曲げた鉗子で慎重に持ち上げ、骨の下を切り取って3本の椎骨を取り除くことができます。脊髄の所望の長さが脊椎柱から分離された場合、脊髄組織を除去するために横断的に切断する。

硬膜を取り除いた後、プラスチック切断ブロックのパラフィンプラットフォームの中央に脳幹を置き、細かい昆虫ピンを使用し、遠位脊髄を通して脳幹の尾端を固定するために長さが1センチメートル以下にトリミングします。次に、パラフィンで覆われた切断ブロックをバイブレーターブロックホルダーの固定された脳幹に合わせて、ブレードが脳幹の鼻の顔に垂直に切断されるようにします。次に、最初のスライスを行い、組織の最も外側の端にある不均一な無関係組織の200〜300マイクロメートルを除去し、必要に応じて小さな調整を行い、PARPの直線性を確保し、不均一な組織を除去する小さな切り傷を行います。

舌咽頭の根源は、脳幹の横端に見えるようになり、これらの眼底神経解剖学的マーカーから脳幹の300〜500マイクロメートルのスライスを切断し、ボッツィンガー前複合体および関連する伝達回路を捕捉する。すべてのスライス手順ステップは、再現可能で実行可能なスライスを作成するために重要であり、必要なすべてのニューロン回路を正しい方向に作成して、堅牢なリズムを生成します。この方法を用いて、刺激リズムを生成し、伝達するための最低限必要な神経回路要素のすべてを薄いスライスに捕捉することができる。

ボッツィジンガー前複合体を含む、低光沢運動ニューロンおよび低光沢神経根管に突出するプレモーターニューロン。ボッツィンガー前の複合体、低光沢または第12回頭蓋神経根源およびC4神経根板は、刺激的な記録に使用することができる。この手順の重要な側面は、ルートレットの慎重な分離と、最終的なスライスを切断する前に脳幹が損傷していないことを確認することです。

この手順に従って、電気生理学の記録は、ネットワークによって生成された電気的活動を記録するために、パッチクランプ法、余分な細胞記録または吸引電極を使用して行うことができる。以前に公開されたプロトコルは、ステップバイステップの詳細をほとんど提供しなく、新しい研究者が別の実験室に移動し、熟練した研究者と一緒に時間を過ごすことなく、この方法を使用することは困難でした。