完全自律型の特性と生体高分子の結晶からのデータ収集
March 22nd, 2019
ここでは、いくつかの放射光ビームラインで自動スクリーニングおよびデータ コレクションは、使用可能なオプションを使用する方法をについて説明します。科学者が、放射光に冷凍サンプルを送る回折特性を上映、データ セットが収集および処理し、構造解析は実施可能であれば、-すべての人間の介入なし。
X線結晶学は、タンパク質から3D構造情報を決定する主要な技術です。シンクロトロンビームラインは、タンパク質が生成する小さくて弱く拡散する結晶からデータを得るために必要です。それは完全に生物学的高分子からのデータ収集のプロセスを自動化するので、大規模なものはユニークなビームラインです。
サンプルの取り付け、場所、最終データ収集から。この種の完全な自動化は、研究者がビームライン上のデータを収集するのではなく、ラボで時間を過ごすことを可能にするので、非常に重要です。ビームラインもインテリジェントで、平均して、ビームラインが人間によって操作される場合よりも優れたデータを収集することができます。
このプロトコルを開始するには、テキストプロトコルで説明されているように、クリスタルマウントを実行し、マッシブ1にビームタイムを要求します。タンパク質結晶学ビームライン、またはISPyBのウェブサイトの情報システムに移動します。MX実験を選択し、実験番号とパスワードでログインします。
出荷をクリックし、新しい情報を追加して、必要な情報を入力します。次に、[保存] をクリックします。[パーセルの追加] をクリックし、要求された情報を入力します。
[保存] をクリックし、[コンテナーの追加] をクリックします。名前としてパックバーコードを与え、脊椎パックを選択し、再度保存をクリックします。容器のシンボルをクリックして編集し、パック内のタンパク質名、好ましいワークフロー、結晶位置などのサンプルに関する必要な情報を記入します。
ESRF安全グループによって承認されたタンパク質を選択してください。個々のサンプルを識別するために、一意のサンプル名を入力します。必要に応じて、ピンバーコードをスキャンします。
含める残りの情報もオプションです。個々のサンプルごとに、実験タイプを入力します。これは、各結晶を処理するために使用される自動ワークフローを定義します。
GCSH結晶が針であることを考えると、MXプレスP.Nextを選択し、スペースグループに入ります。存在する場合、これはデータ収集方針の計算、および使用可能な自動データ処理の配管で使用されます。目的の解像度を入力します。
これは、初期メッシュスキャン、特性評価、およびデフォルトのデータ収集からの結晶から検出器までの距離を定義します。ここで、必要なしきい値の解像度を設定して、この制限に diffract しない完全なデータ セットが集まるのを防ぎます。これにより、データの保存領域を節約し、時間を分析できます。
必要な完全性を設定します。次に、必要な多重度を設定します。サンプル支持体に複数の結晶が含まれている場合は、分析する結晶の最大数を設定します。
デフォルト値は、MX プレス P の 1 つまたは 5 つです。既知の場合は、フォース スペース グループ列にスペース グループを配置します。次に結晶の放射感度を設定します。
必要に応じて、データ セットコレクション全体に収集する合計回転角度を設定します。すべての情報がシステムに入力されたら、値を保存します。クリックして出荷に戻り、ESRFに出荷を送信します。
出荷ラベルを印刷し、サンプルを送信します。ユーザーは、ESRFアカウントの詳細を使用して宅配便でピックアップを手配する必要があります。実験当日、サンプルはマッシブ1つの大容量露に移されます。
ビームラインの科学者は、リモートでユーザーが続くことができるデータ収集を起動します。サンプルの種類ごとに、データ収集が開始されたことを知らせる電子メールがユーザーに送信されます。すべてのワークフローのすべてのステップの実行は、オンラインでリアルタイムで追跡することができます。
ISPyB にログインすることで、ユーザーがアクセスできます。結果は、表示およびダウンロードすることもできます。分析された各サンプルについて、ISPyB の自動実験の結果を調べます。
ID30A1で目的の実験セッションをクリックします。優先する自動処理パイプラインを選択します。最も高い完全性と最高の解像度で正しいスペースグループに書き出されたデータをダウンロードします。
最後の収集結果をクリックして、ダウンロードします。MXプレスPワークフローは、ESRFビームラインMassive 1によって完全に自動的にマウントし、X線ビームの中心、特徴付け、およびヒトGCSHの一連の結晶から完全な回折データセットを収集するために使用されました。サンプルを取り付け、ループをスキャンする領域を分析しました。
回折解析の後、結晶内で4点を選択してデータ収集を行った。分子置換による手動構造決定は、単一の自動改良サイクルの後に高品質の電子密度マップを生み出した。このデータセットでは、自動化されたパイプラインは、1 ポイント 3 つの 2 つのオングストローム解像度でデータをカットします。
ただし、ユーザーは低い解像度でデータを切り取ることを決定できます。連続電子密度は、エターミナルヒスチジンタグとは別に、アミノ酸鎖全体に対して見える。ヒトとウシGCSHを区別する4つの置換のうち、3つは電子密度において容易に識別可能である。
これは、アスパラギン酸が125置換に対してあまり明確ではない。側鎖の電子密度が柔軟性のために部分的にしか分解されない。現在取得されているモデルの R 作業値は 20 ポイント 4%、R フリー値は 23 ポイント 8% で、自動および手動モデルの構築と改良の追加サイクルによってさらに最適化できます。
システムに合わせて要件を調整することが重要です。たとえば、既に観測されている解像度を既知の値に設定すると、時間を節約し、データ収集を改善できます。全自動データ収集は結晶学を民主化しており、小さなラボでさえ、巨大な人の力だけで以前に実現可能であったときに有名なプロジェクトに着手できるようになりました。
概要
この記事では、タンパク質結晶学におけるシンクロトロンビームラインでの自動化されたスクリーニングとデータ収集プロセスについて説明します。完全に自動化されたシステムにより、研究者はヒト介入なしでクライオクールされたサンプルからデータを効率的に収集および処理することができます。
主要な研究要素
科学の分野
- タンパク質結晶学
- X線回折
- データ収集の自動化
背景
- X線結晶解析はタンパク質構造の決定に不可欠です。
- シンクロトロンビームラインは弱い回折を持つ結晶からデータを得るために重要です。
- 自動化はデータ収集の効率性と品質を向上させます。
- Massive oneビームラインは生物学的高分子のための完全に自動化されたワークフローを提供します。
研究の目的
- シンクロトロンビームラインでの自動化されたデータ収集プロセスを実証すること。
- タンパク質結晶学における自動化の利点を強調すること。
- 研究者が従うべき詳細なプロトコルを提供すること。
使用した方法
- サンプルの取り付けとシンクロトロンへの出荷。
- 実験管理のためのISPyB情報システムの活用。
- 自動化されたデータ収集および処理ワークフロー。
- データ収集と結果分析のリアルタイムモニタリング。
主要な結果
- ヒトGCSH結晶から高品質の回折データを成功裏に収集しました。
- 自動処理により高解像度の電子密度マップが得られました。
- ヒトとウシのGCSH間の構造の違いを特定しました。
- 結晶学における自動化されたワークフローの有効性を実証しました。
結論
- データ収集の自動化により結晶学へのアクセスが民主化されます。
- 小規模な研究所でも、これまでは大きな施設に限定されていた複雑なプロジェクトに取り組むことができます。
- 実験パラメータを調整することでデータ収集の効率性を向上させることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Fully automated synchrotron beamlines reduce manual intervention in macromolecular crystallography, enabling high-throughput screening and data collection from weakly diffracting crystals. This automation enhances data quality and throughput, allowing biopharma R&D teams to allocate scientific effort toward target validation and lead optimization rather than beamline operations. The technology democratizes access to structural biology, supporting early-stage de-risking of therapeutic targets through reliable 3D structural insights.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by providing high-resolution structural data on biological macromolecules.
- Operational Value: Supports functional target validation through automated characterization and data collection from crystallization trials.
- Predictive Value: Increases confidence in target models by delivering consistent, high-quality electron density maps for structure-guided design.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated crystal systems for downstream workflows by automating mounting, centering, and diffraction analysis.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility via predefined workflows and real-time monitoring through ISPyB.
- Scalability: Enables screening of large numbers of crystals and reuse of automated pipelines across projects.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-stage structural data to preclinical validation by providing reliable models for mechanistic studies.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by identifying structural differences between species variants, such as human and bovine GCSH.
- Mechanistic De-risking: Clarifies binding sites and flexibility, aiding in the interpretation of structure-activity relationships.
Pipeline & Workflow Integration
The automated beamline integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification, supporting data generation for downstream analytics and modeling.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification by solving crystal structures of proteins and complexes.
- Screening: Delivers assay-ready systems with quantitative outputs such as resolution, completeness, and multiplicity for reliable compound evaluation.
- Analytics: Provides measurable readouts including R-work and R-free values, resolution cutoffs, and electron density maps to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects structural insights to preclinical continuity by enabling species-specific model refinement, as demonstrated with GCSH.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for structural screening across multiple targets, reducing dependency on site-specific expertise.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target models, reduction of mechanistic ambiguity, and support for structure-based drug design.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of data collection across samples and projects.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency through reduced beamline staffing, and lowered biological risk in lead selection.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of targets based on structural confidence and data quality metrics.
Implementation Considerations
- Expertise in protein crystallography and sample preparation is required for successful crystal mounting and characterization.
- Access to synchrotron facilities and instrumentation such as the Massive one beamline is essential for automated data collection.
- Standardization across teams requires consistent use of ISPyB for experiment tracking, workflow selection, and result retrieval.
- Adaptation across model systems involves adjusting parameters such as resolution thresholds, space group, and radiation sensitivity based on crystal properties.
- Practical limitations include the need for cryocooled samples and dependency on crystal quality, which affects automated workflow success rates.
