Name: ケラチン生成細胞増殖の 2 次元と 3 次元の評価タイプ I コラーゲン基板 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: 学ぶタイプIコラーゲンを用いた2次元と3次元培養基板の調製法。ケラチン生成細胞の増殖と形態を比較評価し、生体内に近い環境での細胞挙動を解析する実験手法を習得できます。

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博士関口 (大阪大学蛋白質研究所) に感謝しております山田昌博士 (大阪大学蛋白質研究所)、博士隆池島 (中国日本研究所の医療、薬学、Wuya の大学技術革新、瀋陽薬科大学) と有用なコメントのための林孝信 (中国日本研究所の医療、薬学、Wuya イノベーション大学瀋陽薬科大学)。

1. 表皮細胞培養培地の調製
注: は、無菌条件の下ですべての手順を実行します。
<ol><li>ペニシリン-ストレプトマイシンの K110 タイプ II 媒体 (K110) の 500 mL に添加サプリメント K-1 の 10 mL のピペットを使用して 5 mL を追加します。</li>
</ol>2. 線維状の準備 I 型コラーゲン
注: は、無菌条件下でステップ 2.6 までの手順を実行します。
<ol><li>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS (-))、脱イオン水、コラーゲン、96-well 培養プレート、氷の上の空の 2 mL チューブ × 10 を維持します。 注: 線維と非線維性フォームを準備するのに同じプレートを使用しないでください。</li>
	<li>ピペットを使用して空の 2 mL チューブに 1.12 mL の脱イオン水を追加します。ピペットを使用して 2 mL チューブに脱イオン水に 200 μ L の 10 x PBS (-) を追加します。数回チューブを軽く振る。</li>
	<li>コラーゲンの 0.66 mL をピペットを使用して 2 mL チューブに追加します。慎重かつ迅速には、チューブを数回振る。 注: は、気泡の可能な限りのソリューションを避けてください。使用する前にすぐにコラーゲン溶液を準備します。</li>
	<li>96 ウェル培養プレートの各ウェルにステップ 2.3 からコラーゲン溶液 100 μ L を注ぐ。左右の動きからの培養プレートを軽く振る。 注: は、コラーゲン溶液と井戸の表面全体をカバーします。ソリューションが表面全体をカバーしていない場合は、ピペット チップを使用して、ソリューションを普及します。気泡の可能な限りのソリューションを避けてください。</li>
	<li>CO2のインキュベーターで培養プレートを配置し、, 1 h. チェック コラーゲンのゲル化の 37 ° C で培養プレートをクリーン ベンチに移動します。 注: は、培養プレートを傾けることによってゲル化を確認します。</li>
	<li>場所文化 CO2インキュベーターでプレートし、, 1 h. クリーン ベンチへの培養プレートの 37 ° C で、井戸の壁に沿ってピペットを使用してゲルの K110 の 150 μ L をそっと注ぐ。細胞培養の前にそっと破棄、K110 ピペットを使用しています。 注: ゲルを保護するためにピペットの先端は井戸の壁をタッチする必要があります。</li>
</ol>3. 非繊維状の準備 I 型コラーゲン
注: は、無菌条件の下ですべての手順を実行します。
<ol><li>1.2 mL 1 mM 塩酸 (HCl) 1.5 mL チューブにコラーゲンの 4 μ L を追加し、ピペットを使用して軽く混ぜます。 注: 使用する前にすぐにコラーゲンを準備します。コラーゲンを保ち、使用時まで冷蔵して HCl。</li>
	<li>ピペットを使用して 96 ウェル培養プレートの各ウェルに 100 μ L のコラーゲンを注ぐ。運動し 1 時間室温で孵化させなさい左の培養プレートを軽く振る。 注: は、井戸の表面全体がソリューションで覆われていることを確認します。</li>
	<li>、孵化後コラーゲン液を捨て、PBS (-) 2 回ピペットを使用しての洗浄します。</li>
	<li>1% ウシ血清アルブミン/PBS (-) (1 %bsa) 96 ウェル培養プレートの井戸までの 150 μ L を注ぐと細胞培養の前に 1 時間室温で孵化させなさい、1 %bsa を破棄します。 注: は、井戸の表面全体がソリューションで覆われていることを確認します。</li>
</ol>4. FEPE1L 8 細胞の培養
注: は、無菌条件の下ですべての手順を実行します。
<ol><li>100 mm の K110 で FEPE1L 8 セル CO2インキュベーターで皿を文化し、37 ° C、5% CO2、半合流で維持します。</li>
	<li>K110、トリプシン、トリプシン ・ インヒビターの 37 ° C の水浴中準備します。</li>
	<li>慎重に培養皿からメディアを取り出して、ピペットを使用して 0.05% トリプシンの 3 mL を加える、CO2インキュベーターに皿を置き、5 分の 37 ° C で孵化させなさい。インキュベーション後、10 倍の倍率で位相差顕微鏡を用いた培養皿の表面の細胞の剥離を確認します。 注: 独立した細胞の形態になるラウンド。細胞が広がっている場合は、5 分の追加期間インキュベートします。</li>
	<li>トリプシン ・ インヒビターの 3 mL を追加し、ピペットを使用して 15 mL 遠心管中の剥離細胞を収集します。5 分間 200 x g で 15 mL 遠心管の細胞を遠心します。</li>
	<li>上澄みを廃棄し、再 K110 の 10 mL のピペットを使用してにペレットを中断します。10 倍の倍率で位相差顕微鏡を使用してセルをカウントし、K110 適切な希釈による細胞濃度 5.0 x 104セル/mL を準備します。</li>
	<li>優しく K110 井戸の壁に沿ってピペットを使用して培養プレートの各ウェルに細胞を 0.1 mL をシードします。CO2インキュベーターで培養プレートを置き、37 ° C で示された時間 (2 時間、1 日、3 日) 孵化させなさい。 注: ゲルを保護するためにピペットの先端は井戸の壁をタッチする必要があります。</li>
</ol>5. 生菌数の推定
<ol><li>K110 37 ° C の水浴中に孵化させなさいテトラゾリウム塩、2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2Hテトラゾリウム、ナトリウム塩 (WST-8)、K110 の 1.3 mL をピペット 2 mL チューブにミックス 130 μ L。</li>
	<li>培養プレートをクリーン ベンチに移動し、優しく破棄、K110 ピペットを使用しています。優しく洗い流す K110 と非付着性のセル ピペットを使用して</li>
	<li>よくピペットを使用して各 WST 8 混ぜ K110 の 110 μ L を追加、CO2インキュベーターで培養プレートを配置、37 ° C 2 時間で孵化させなさい。</li>
	<li>培養プレートをクリーン ベンチに移動、各ウェルから馴化培地の 100 μ L を収集し、別の 96 ウェル培養プレートのウェルに移動します。450 の波長で吸光度を測定 nm (外径450) マイクロ プレート リーダーおよび実行可能なセルの数の見積もりを使用しています。</li>
</ol>

<ol><li>Kanta, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+as+a+tool+in+studying+fibroblastic+cell+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adhesion+%26+Migration%22%5BJournal%5D)">Collagen as a tool in studying fibroblastic cell behavior.</a> Cell Adhesion & Migration. 9 (4), 308-316 (2015).</li>
<li>Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+adhesion+to+collagen+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+of+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Fibroblast adhesion to collagen substrates.</a> Methods of Enzymology. 82, 503-508 (1982).</li>
<li>Kleinman, H. K., et al. Use of extracellular matrix and its components in culture. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKleinman%2C+HK+%22Extracellular+Matrix%3A+A+Practical+Approach%2C+1st+ed%22">Extracellular Matrix: A Practical Approach, 1st ed</a>. Haralsonand, M. A., Hassell, J. R. , IRL Press. Oxford. 289-301 (1995).</li>
<li>Yamato, M., Hayashi, T. Topological distribution of collagen binding sites on fibroblasts cultured within collagen gels. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYamato%2C+M+%22Extracellular+Matrix-Cell+Interaction%22">Extracellular Matrix-Cell Interaction</a>. Ninomiya, Y., Olsen, B. R., Ooyama, T. , 123-140 (1998).</li>
<li>Suzuki, Y., Someki, I., Adachi, E., Irie, S., Hattori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+collagen+molecules+from+the+aspect+of+fibril+formation%3A+Acid-soluble%2C+alkali-treated+and+MMP1-digested+fragments+of+type+I+collagen%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Interaction of collagen molecules from the aspect of fibril formation: Acid-soluble, alkali-treated and MMP1-digested fragments of type I collagen.</a> Journal of Biochemistry. 126, 54-67 (1999).</li>
<li>Fujisaki, H., Hattori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocyte+apoptosis+on+type+I+collagen+gel+caused+by+lack+of+laminin+5%2F10%2F11+deposition+and+Akt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Keratinocyte apoptosis on type I collagen gel caused by lack of laminin 5/10/11 deposition and Akt signaling.</a> Experimental Cell Research. 280, 255-269 (2002).</li>
<li>Sasaki, J., Fujisaki, H., Adachi, E., Irie, S., Hattori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delay+of+cell+cycle+progression+and+induction+of+death+of+cancer+cells+on+type+I+collagen+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Connective+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Delay of cell cycle progression and induction of death of cancer cells on type I collagen fibrils.</a> Connective Tissue Research. 52 (3), 167-177 (2011).</li>
<li>Wang, Z., Li, R., Zhong, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+promotes+proliferation%2C+migration+and+airway+smooth+muscle+cells+in+a+rat+model+of+chronic+obstructive+pulmonary+disease+via+upregulation+of+the+PI3K%2FAKT+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine+Reports%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix promotes proliferation, migration and airway smooth muscle cells in a rat model of chronic obstructive pulmonary disease via upregulation of the PI3K/AKT signaling pathway.</a> Molecular Medicine Reports. 18, 3143-3152 (2018).</li>
<li>Shih, Y. -R., Tseng, K. F., Lai, H. -Y., Lin, C. -H., Lee, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+stiffness+regulation+of+integrin%E2%80%90mediated+mechanotransduction+during+osteogenic+differentiation+of+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Matrix stiffness regulation of integrin‐mediated mechanotransduction during osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 26, 730-738 (2011).</li>
<li>Breitkreutz, D., Koxholt, I., Thiemann, K., Nischt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+basement+membrane%3A+The+foundation+of+epidermal+integrity-+BM+functions+and+diverse+roles+of+binding+molecules+nidogen+and+perlecan%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Resesrch+International%22%5BJournal%5D)">Skin basement membrane: The foundation of epidermal integrity- BM functions and diverse roles of binding molecules nidogen and perlecan.</a> BioMed Resesrch International. , 179784(2013).</li>
<li>Fujisaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respective+optimal+calcium+concentrations+for+proliferation+on+type+I+collagen+fibrils+in+two+keratinocyte+line+cells%2C+HaCaT+and+FEPE1L-8%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Therapy%22%5BJournal%5D)">Respective optimal calcium concentrations for proliferation on type I collagen fibrils in two keratinocyte line cells, HaCaT and FEPE1L-8.</a> Regenerative Therapy. 8, 73-79 (2018).</li>
<li>Kaur, P., McDougall, J. K., Cone, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalization+of+primary+human+epithelial+cells+by+cloned+cervical+carcinoma+DNA+containing+human+papillomavirus+type+16+E6%2FE7+open+reading+frames%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Immortalization of primary human epithelial cells by cloned cervical carcinoma DNA containing human papillomavirus type 16 E6/E7 open reading frames.</a> Journal of General Virology. 70, 1261-1266 (1989).</li>
<li>Kaur, P., Carter, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+expression+and+differentiation+in+transformed+human+epidermal+cells+is+regulated+by+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Integrin expression and differentiation in transformed human epidermal cells is regulated by fibroblasts.</a> Journal of Cell Science. 103, 755-763 (1992).</li>
<li>Fujisaki, H., Adachi, E., Hattori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocyte+differentiation+and+proliferation+are+regulated+by+adhesion+to+the+three-dimensional+meshwork+structure+of+type+IV+collagen%5BTitle%5D)+AND+%22Connective+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Keratinocyte differentiation and proliferation are regulated by adhesion to the three-dimensional meshwork structure of type IV collagen.</a> Connective Tissue Research. 49 (6), 426-436 (2008).</li>
<li>Hirose, M., Kosugi, H., Nakazato, K., Hayashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+to+a+quiescent+and+contractile+phenotype+from+a+proliferative+phenotype+of+myofibroblast-like+human+aortic+smooth+muscle+cells+by+culture+on+type+IV+collagen+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Restoration to a quiescent and contractile phenotype from a proliferative phenotype of myofibroblast-like human aortic smooth muscle cells by culture on type IV collagen gels.</a> Journal of Biochemistry. 125, 991-1000 (1999).</li>
<li>Yonemura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Sensitivity+of+Epithelial+Cells+to+Extracellular+Matrix+in+Polarity+Establishment%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Differential Sensitivity of Epithelial Cells to Extracellular Matrix in Polarity Establishment.</a> Plos One. 9, 112922(2014).</li>
<li>Sato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possible+Involvement+of+Aminotelopeptide+in+Self-assembly+and+Thermal+Stability+of+Collagen+I+as+Revealed+by+Its+Removal+with+Proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Possible Involvement of Aminotelopeptide in Self-assembly and Thermal Stability of Collagen I as Revealed by Its Removal with Proteases.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (33), 25870-25875 (2000).</li>
<li>Nakazato, K., Muraoka, M., Adachi, E., Hayashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gelation+of+lens+capsule+type+IV+collagen+solution+at+a+neutral+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Gelation of lens capsule type IV collagen solution at a neutral pH.</a> Journal of Biochemistry. 120, 889-894 (1996).</li>
<li>Japan Institute of leather Research and Osaka University. Type I -Type IV collagen hybrid gel. European patent. , 2489375 (11F019-EP) (2015).</li>
<li>Henriet, P., Zhong, Z. D., Brooks, P. C., Weinberg, K. I., DeClerck, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contact+with+fibrillar+collagen+inhibits+melanoma+cell+proliferation+by+up-regulating+p27KIP1%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Contact with fibrillar collagen inhibits melanoma cell proliferation by up-regulating p27KIP1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (18), 10026-10031 (2000).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+levels+of+reactive+oxygen+species+in+murine+preadipocyte+3T3-L1+cells+cultured+on+type+I+collagen+molecule-coated+and+gel-covered+dishes+exert+opposite+effects+on+NF-%CE%BAB-mediated+proliferation+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Research%22%5BJournal%5D)">Differential levels of reactive oxygen species in murine preadipocyte 3T3-L1 cells cultured on type I collagen molecule-coated and gel-covered dishes exert opposite effects on NF-κB-mediated proliferation and migration.</a> Free Radical Research. 28, 1-16 (2018).</li>
</ol>

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

など、いくつかの ECM コンポーネント I 型コラーゲン、フォームの三次元構造体内の1。このような 3次元培養、ゲル基板は二次元、プラスチック表面に vitroよりもより生理的条件を提供します1,2,3,4。ゲル培養法に関する多数のプロトコルが報告されている, 使用するなど I 型コラーゲン1,2,3,4,6,7、マトリゲル16IV 型コラーゲン14,15、 11。I 型コラーゲンは明確に定義され広く使用されている素材、その豊かさと取り扱いの容易さのため。精製タイプの特徴私コラーゲンは、動物種、年齢、および浄化方法5,17に依存します。I 型コラーゲンは、酢酸やペプシン、パパイン、プロクターゼ5,17などのプロテアーゼを使用して精製することができます。酸可溶性コラーゲンは、アミノ酸テロペプチドとプロテアーゼ可溶性コラーゲンは、劈開アミノ テロペプチド5,17を保持します。アミノ テロペプチドの予約の長さ、プロテアーゼの種類に依存してゲル強度5,17テロペプチドの存在線維の形態に影響を与えます。酸可溶性コラーゲン細線維の粘度は、プロテアーゼ処理コラーゲン17のより大きいです。この研究では、酸可溶性を用いてウシ型コラーゲン。ペプシン可溶化コラーゲンはこのゲル文化プロトコルにも使用できます。しかし、ゲル強度は弱い17です。材料のこれらの相違はセル動作の違いを引き起こす可能性が、彼ら現在よく理解されていません。
本研究で記述されているゲル文化プロトコルは非常に簡単です。このメソッドの多くの変更が報告されています。ケラチノ サイトの文化の 1 つの可能な変更は、基底膜を模倣することです。IV 型コラーゲン ・ ゲル培養15,18で基底膜のような基板構造を維持するより良いかもしれません。ただし、長い潜伏期間は、タイプ IV コラーゲン ゲル14,15,18の準備のため必要です。代わりに、IV 型コラーゲンとの混合タイプ I コラーゲン ・ ゲル培養基質を作り出すことができる (タイプ I/タイプ IV コラーゲン複合ゲル)19。これらのハイブリッドのゲル、ゲル化に必要な短い時間、処理し易い、ケラチノ サイトのより多くの基底膜のような条件をもたらします。種/IV 型コラーゲン複合ゲル、ケラチノ サイト生き残るためのコロニーを形成、分化19を誘発します。このハイブリッド法には、多彩なアプリケーションがあります。
I 型を用いたゲル上培養コラーゲンががん細胞に影響します。線維状の I 型コラーゲン、Akt の活性化、caco-2 細胞 (大腸癌細胞株) の成長が抑制された7。さらに、ひと悪性黒色腫細胞 (M24met) 線維フォーム上の成長は G1/S チェックポイント20で逮捕されました。さらに、線維フォーム上で培養したマウス 3t3-l1 脂肪前駆細胞における活性酸素のレベルを著しく増加が観察されます。さらに、反対の方向で非繊維による細胞増殖および移行を刺激、線維状タイプ I コラーゲン21。

間質の結合組織を構成する三次元異種組成のタンパク質網目主, I 型コラーゲン線維1。コラーゲン線維は細胞1,2,3の足場として重要な役割を果たすし、他の細胞外マトリックス (ECM) 蛋白質3対話します。生体外で, 別のフォーム タイプ I コラーゲンを処理によって細胞培養の基板として使用することができる方法1,2,3,4。酸性条件下でタイプ I コラーゲンは非繊維様式5を維持します。細胞接着と増殖6,7を促進するフォームを非線維性培養皿の表面をコーティングします。生理的な pH や温度の変化で I 型コラーゲン分子立体構造1,2,3,4,を有するゲルを形成する繊維に再構築5,6,7,8。いくつかの重要の違い線維と非繊維状タイプ私コラーゲン、剛性マトリックスと文化1セルによる ECM 成分の復興の効率などを含むがあります。剛性マトリックスは細胞文化1, 9の最も研究の規制要因の一つです。ただし、基板と電池の間の複雑な相互作用は明らか。細胞と環境要因間の複雑な相互作用を調べるシンプルなシステムが便利です。コラーゲンの 2 つの異なる形式の携帯電話の動作の比較は環境要因の影響を簡素化に役立つかもしれない。私の使用、種類の異なるフォームの目的に応じてコラーゲン選択的に使用できます。通常、表皮基底膜と接触しているではなく I 型コラーゲン。しかし、創傷治癒、皮膚の結合組織にケラチノ サイトを移動中に、増殖、10の傷を癒します。
最近では、細胞外カルシウム濃度はケラチノ サイトの増殖に重要なデモンストレーションを行った線維状培養系を用いた細胞タイプ I コラーゲン真皮結合組織11を模倣しました。FEPE1L 8 が線維状に培養した表皮細胞ライン I 型コラーゲン、細胞の形状が丸いと彼らの増殖が細胞外カルシウム濃度 30 μ M11で停止していた。カルシウム濃度は 1.8 mM に増加した、細胞増殖は回復11をだった。セルの両方のカルシウム濃度 (30 μ M と 1.8 mM) の下で育った線維フォーム上で培養したときの外因性カルシウム濃度に対する感受性が高かったに対し非線維性フォーム11、培養した場合。FEPE1L 8 がヒトパピ ローマ ウイルスの型 16 変形遺伝子 E6 のトランスフェクションによって生成され、ひと子宮頸癌、非発癌性から E7 正常ケラチノ サイトのような潜在的な差別化と無制限の増殖を抑制します。12,13。FEPE1L 8 セルは、K110 タイプ II を含む添加剤サプリメント K-1 (K110)6ケラチノ サイトの特定のメディアのいくつかの種類を使用して管理できます。ここでは、非繊維のひと細胞株の培養のプロトコルについて述べるし、線維の形態 I 型コラーゲン。

<table><tbody><tr><td>ウシ血清由来アルブミン(BSA)</td><td>Merck KGaA</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>1 % BSA&nbsp;</td><td>Merck KGaA</td><td>A4503</td><td>BSA粉末1gをPBS100mL(-)に溶解し、濾液化します&nbsp;</td></tr><tr><td>Cell Counting Kit-8</td><td>同人堂モレキュラーテクノロジーズ(株)</td><td>347-07621</td><td>テトラゾリウム塩、2-(2-メトキシ-4-ニトロフェニル)-3-(4-ニトロフェニル)-5-(2,4-ジスルホフェニル)-2H&nbsp;テトラゾリウム、一ナトリウム塩(WST-8)&nbsp;</td></tr><tr><td>I.型コラーゲン(酸性可溶性コルゲン)</td><td>ニッピ株式会社</td><td>ASC-1-100-20</td><td>ウシ由来 (他の任意の種、濃度は 3.0 mg/mL</td></tr><tr><td>ディスミック 酢酸セルロース</td><td>アドバンテック</td><td>25CS020AS</td><td>0.2 & マイクロ;m孔径</td></tr><tr><td>ヒトケラチノサイトラインセル&nbsp;FEPE1L-8</td><td></td><td></td><td>&nbsp;寄贈されたW.G.カーター博士(フレッドハッチンソンがん研究センター、ワシントン州シアトル)&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>K-1</td><td>極東製薬</td><td>28204</td><td>BSA500 mg、500 mgのウシ下垂体抽出物、2.5 mgのインスリン、0.05 &microを含む添加物サプリメント。h-EGFのgとヘパリン</td></tr><tr><td>K110 Type-IIの培地</td>5mg 極<td>東製薬</td><td>28204</td><td>ケラチノサイト基礎培養液&nbsp;</td></tr><tr><td>K-1とペニシリン・ストレプトマイシン(K110)を配合したK110 Type-II培地極</td><td>東製薬</td><td>28204</td><td>500 mLのK110 Type-IIケラチノサイト基礎培養培地に5 mLのペニシリン-ストレプトマイシンと10 mLの添加剤(K-1)を加えます&nbsp;</td></tr><tr><td>PBSの (-)&nbsp;</td><td>Merck KGaA</td><td>P-5368</td><td>PBS(-)粉末1袋を1000mLの脱イオン水に溶解し、濾液&nbsp;</td></tr><tr><td>10x PBS (-)</td><td>Merck KGaA</td><td>P-5368</td><td>PBS (-) 粉末 1 袋を 100 mL の脱イオン水と濾液に溶解します&nbsp;</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>MP バイオメディカルズ LLC</td><td>1670049</td><td>10000 ユニット/mL のペニシリン G と 10,000&mu;生理食塩水中のストレプマイシン硫酸塩のg/mL</td></tr><tr><td>リン酸緩衝液生理食塩水BioPerformance CertiCertified, pH 7.4</td><td>Merck KGaA</td><td>P-5368-10 pack</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin from porcine pancreas</td><td>Merck KGaA</td><td>T4799</td><td></td></tr><tr><td>0.05 % トリプシン&nbsp;</td><td>Merck KGaA</td><td>T4799</td><td>0.25 gのトリプシンと0.186 gのEDTA.2Naを500 mLのPBS(-)&nbsp;に溶解し、濾液&nbsp;</td></tr><tr><td>大豆由来トリプシン阻害剤</td><td>富士フイルム和光純薬株式会社</td><td>202-20123</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン阻害剤&nbsp;</td><td>富士フイルム和光純薬株式会社</td><td>202-20123</td><td>トリプシン阻害剤50mgとBSA500mgをPBS500mL(-)に溶かし、濾液&nbsp;</td></tr></tbody></table>

ケラチン生成細胞増殖の 2 次元と 3 次元の評価タイプ i コラーゲン基板

Evaluation of Keratinocyte Proliferation on Two- and Three-dimensional Type I Collagen Substrates

I 型コラーゲン、2 つの形態で存在する細胞培養の基質として有用な: 二次元非線維性フォームと立体的線維。両方のフォームは同じで準備できる I 型コラーゲン。一般に、非繊維のフォームは細胞接着と増殖を促進します。セルの多くの種類の生理学的な条件を提供する線維フォーム (ゲル)したがって、ゲル文化、薬効などの細胞の生理学的行動を調べるのに役立ちます。
研究者は、その使用目的に応じて適切な形式を選択できます。たとえば、ケラチノ サイトの場合、ゲルの文化は創傷治癒モデルとして使用されています。FEPE1L-8、ケラチノ サイト細胞株培養型の非繊維のフォームで私コラーゲン、細胞粘着を促進します。特に、表皮細胞の増殖、線維フォーム非線維性フォームより遅い。準備のためのプロトコルは細胞培養、単純な I 型コラーゲンと実験のニーズに応じて幅広い用途があります。

使用して培養皿の表面の治療の概略図は I 型コラーゲンが図 1に描かれています。非線維と線維の形態で観察された細胞の形態はそれぞれ図 2の左サイドと右パネルに表示されます。2 h (上部パネル) と 3 日 (下のパネル) FEPE1L 8 細胞を培養されました。培養初期の 2 h で細胞は付着し、コラーゲン (図 2、上部のパネル) の両方のフォームの上に広げ.播種後 3 日間非線維性フォームのセルは広がるし、細胞数増加 (図 2の左下パネル) を続けた。対照的に、線維フォームの細胞は限られた拡散 (図 2、右下のパネル) を示した。FEPE1L 8 細胞はコラーゲン (図 3、黒の実線は、黒い丸を閉じた状態) に型の非繊維のフォームで増殖する継続し、未処理の皿の表面 (図 3、灰色の点線をすれば、閉じた灰色の円)。対照的に、細胞は、線維の形 (図 3点線、白抜きの円) には増殖しなかった。図 2と図 3は、藤崎ら11から変更されています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59339/59339fig1v2.jpg"> 図 1: 培養皿表面の図式的な表示はマイク コラーゲンの種類で処理します。酸性条件下で I 型コラーゲンの分子が吸着した非繊維形 (左) の皿の表面に。37 ° C での中性条件下で I 型コラーゲンの分子が組み立てには線維および吸着ゲル形 (右側のパネル) で料理の表面に。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59339/59339fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59339/59339fig2.jpg"> 図 2: FEPE1L 8 細胞の形態。K110 FEPE1L 8 細胞培養非線維性のフォームを使用して (10 μ G/ml; 左パネル) または線維フォーム (1 mg/mL; 右パネル) のタイプ I コラーゲン 2 h (上部パネル) または 3 日 (下のパネル)。白いバーを示す 100 μ m.図 2で変更されている藤崎らから図 1のE-H11。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59339/59339fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59339/59339fig3v3.jpg"> 図 3: FEPE1L 8 細胞の増殖します。非線維性フォーム (黒実線、黒の塗りつぶされた円) で実行可能なセルの数を推定したまたは線維の形態 (点線, 白丸) I 型コラーゲン、または未処理のパラボラ面 (灰色の点線、灰色の黒丸) 2 h、1 日と 3 日。トリプリケートで実験を行なった、手段 + の SD として値が表示されます。この図は、図 1J11藤崎らから変更されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59339/59339fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

今回培養基板の 2 つの異なるフォームの準備のためのプロトコルを利用した I 型コラーゲン。コラーゲンの処理方法に応じて、コラーゲン分子は 2次元、非繊維状のフォームを維持するか、または立体的線維に再構築します。細胞増殖には I 型コラーゲンは線維形成によって大幅に影響を受けます。

ケラチン生成細胞増殖の 2 次元と 3 次元の評価タイプ I コラーゲン基板

Type I collagen, useful as a substrate for cell culture, exists in two forms: the two-dimensional, non-fibrous form and three-dimensional, fibril form. ...

このビデオでは、I型コラーゲンと2次元および3次元培養法を用いて、2種類の細胞培養基質を調製する方法を示します。この三次元培養法は、生物環境に対して考えられ、三次元培養基質を容易に調製する方法を実証することは、研究に有用である。多くの細胞型では、同じコラーゲンを用いたにもかかわらず、細胞の挙動は2次元および3次元基質間で大きく異なる。三次元培養基質を用い、生物の細胞行動と類似した細胞挙動を容易に調べることができる。この方法は非常に簡単で、最小限の特別な試薬を必要とします。この方法が簡単に試みられるのは、3次元ゲルが壊れやすく、適切に取り扱うことが非常に重要であるため、視覚的なデモンストレーションは非常に重要です。開始するには、適切な培養培地を調製する。コラーゲンの調製を開始するには、10倍のPBS、脱イオン水、コラーゲン、96ウェル培養プレート、氷の上に空の2ミリリットルチューブを置きます。ピペットを使用して、空の2ミリリットルのチューブに1.12ミリリットルの脱イオン水を加えます。200マイクロリットルの10倍PBSを脱イオン水に加え、チューブを数回軽く振ります。使用直前に、2ミリリットルのチューブに0.66ミリリットルのコラーゲンを加えます。軽く、素早くチューブを数回振ります。このコラーゲン溶液の100マイクロリットルを96ウェル培養プレートの各ウェルに注ぎ、井戸の表面全体を覆うことを確認します。左右の動きを使ってプレートを軽く振ります。培養プレートを摂氏37度で1時間培養します。次にプレートを傾けてコラーゲンのゲル化を確認し、培養プレートをクリーンベンチに移動させます。ウェルの壁に沿ってピペットを作り、150マイクロリットルのK110をゲルにそっと注ぎます。摂氏37度で1時間インキュベートします。その後、培養プレートをクリーンベンチに移動します。細胞培養の直前に、ピペットを使用してK110を軽く廃棄する。まず、ピペットを使用して、1.5ミリリットルのチューブに1ミリモル塩酸1.2ミリリットルにコラーゲン4マイクロリットルを加え、穏やかに混ぜます。新しい96ウェル培養プレートの各ウェルに、このコラーゲン混合物の100マイクロリットルを注ぎます。プレートを左から右に動かしてそっと振り、室温で1時間インキュベートします。この後、コラーゲン溶液を捨てます。ピペットを使用して、PBSでそれぞれをよく洗います。培養プレートの各ウェルに1%BSAとPBSの150マイクロリットルを加え、室温で1時間インキュベートします。細胞培養の前に、1%BSA溶液を廃棄する。まず、FEPE1L-8細胞およびK110、トリプシン、およびトリプシン阻害剤をテキストプロトコルで概説するように調製する。慎重に培養皿から培地を取り出し、ピペットを使用して0.05%トリプシンの3ミリリットルを加えます。皿を二酸化炭素インキュベーターに戻し、摂氏37度で5分間インキュベートします。次に、10倍倍の位相コントラスト顕微鏡を使用して、培養皿の表面からの細胞剥離を確認します。トリプシン阻害剤の3ミリリットルを追加し、15ミリリットル遠心管に剥離した細胞を収集するためにピペットを使用しています。200回gで5分間遠心分離機。この後、上清を捨て、10ミリリットルのK110でペレットを再懸濁する。10倍倍の位相顕微鏡を使って細胞を数え、K110で細胞を1ミリリットル当たり50,000細胞の細胞密度に希釈します。ウェルの壁に沿ってピペット処理を行い、培養プレートの各ウェルに細胞懸濁液の0.1ミリリットルをそっと種付けする。適切な時間の摂氏37度で二酸化炭素インキュベーターでインキュベート。まず、テトラゾリウム塩130マイクロリットルとWST-8を1.3ミリリットルの予熱K110を2ミリリットルのチューブに混ぜます。培養プレートをクリーンベンチに移動し、ピペットを使用してK110をウェルから静かに捨てます。K110で優しく洗い流し、非接着性の細胞。その後、各ウェルにWST-8と混合K110の110マイクロリットルを追加します。2時間摂氏37度で二酸化炭素インキュベーターでインキュベートします。その後、培養プレートをクリーンベンチに移動します。各ウェルから100マイクロリットルのコンディション培地を収集し、新しい96ウェル培養プレートの井戸に移動します。マイクロプレートリーダーを用いて、450ナノメートルで吸光度を測定し、生存細胞数を推定する。細胞形態は非繊維状および線維形態で観察され、ここに示されている。培養の最初の2時間では、細胞は両方の形態のコラーゲンに接着し、広がる。播種の3日後、非繊維形の細胞は広がり続け、細胞数は増加し、線維状の細胞は限られた広がりを示す。FEPE1L-8細胞は、I型コラーゲンの非繊維状形態および未処理の皿表面上で増殖し続ける。対照的に、細胞は線維の形態で増殖しない。この手順を試みる場合、立体ゲルが非常に壊れやすいということを覚えておくことが重要です。溶液やヒントがゲルに直接接触しないように注意する必要があります。このメソッドは、さまざまな方法で変更できます。例えば、検体の膜成分を混合するために、基質膜を模倣する細胞培養基質を作ることができる。多くの場合、生体における細胞外マトリックスの機能は不明である。三次元培養上の細胞を培養するために、生体に類似した細胞外マトリックス成分の機能を調べることができる。3次元ゲル培養技術を適用することにより、細胞内の薬物濃度を効果的に試験することができる。このプロトコルは、目的に基づいて、ゲル化中に他のEGM成分または成長因子を混合することによって複雑な三次元培養基質を開発するために使用することができる。

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Research

JoVE Journal

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ケラチン生成細胞増殖の 2 次元と 3 次元の評価タイプ I コラーゲン基板

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