Name: モデル植物アラビドプシスタリアナのチグモ形態形成の研究のための省力と反復可能なタッチフォースシグナル伝達変異スクリーンプロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: 学ぶロボットアームと人毛ブラシを用いた自動タッチフォース装置によるアラビドプシスタリアナの機械刺激応答解析。省力化と再現性を高めたシグナル伝達変異スクリーニング法で植物形態形成研究を効率化します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この研究は、以下の助成金によって支援されました: 31370315, 31570187, 31870231 (中国国立科学財団), 16100318, 661013, 16101114, 16103615, 16103617, AoE/M-4GC/香港(香港)。著者は、図1に示すいくつかの回路図の提供のためにJu Feng Precisionとオートメーション技術リミテッド(深セン、中国)に感謝したいと思います。
著者はまた、タッチフォースローディングマシンの開発に貢献してくれたS.K.チャンとW.C.リーに感謝したいと思います。

1. 種子の準備
注:野生型(Col-0)とmkk1およびmkk2機能喪失変異体の両方のアラビドプシス種子は、アラビドプシス生物資源センター(ABRC、https://www.arabidopsis.org、コロンバス、オハイオ州)から購入した。
<ol><li>信頼性の高い統計分析に使用される各遺伝子型の植物個体数を計算します。各ラインの発芽率に基づいて十分な数の種子を準備し、通常は実験に必要なものよりも4〜5倍多く。健康で均一なサイズの植物の十分な数をタッチ応答アッセイに使用できることを確認します。このプロトコルによれば、遺伝子型当たり300〜500種子は、通常、同様のサイズの80〜90植物を生産するために使用される。</li>
	<li>冷たい水に種子を浸し、種子浸漬のために4 °C(暗く保つためにアルミ箔で覆われた)にそれらを保存します。浸漬の5-7日後に種子をまきます。</li>
</ol>2. 植物の成長
<ol><li>植物の成長に適した土壌を選択します(材料表を参照)。大きな塊を避け、均質にそれらを混ぜます。</li>
	<li>24個のプラスチックカップを準備する:保持容量は207 mLで、上部の縁の直径は7.4センチメートルです。</li>
	<li>混合土壌でこれらのプラスチックカップを埋めます。カップリムより1~2cm高く積み重ねて、積み重ねた土の表面を柔らかく平らにしましょう。</li>
	<li>24カップをプラスチックトレイ(21インチ×10.8インチ×2.5インチ)に移し、一定の光条件下にトレイを置きます(下記参照)。</li>
	<li>種子播種の2時間前に各トレイに2.5Lの水を加えます。カップの底にある穴から水を吸収し、土の表面がカップリムレベルに落ちるのを待つために土壌をしましょう。</li>
	<li>3-4種子を単一の場所に種をまき、カップ内に4つの均等に分散したスポット。</li>
	<li>各トレイの上に透明なプラスチックカバーを置き、種子を1週間発芽させます。その後、カバーを削除し、苗が別の週のために成長できるようにします。</li>
	<li>間引きによって余分な植物を削除し、種子播種後9-10日、各カップで同様のサイズの4植物の個体を保ちます。</li>
	<li>種子が発芽した後、1日おきに1.5Lの水で植物を灌漑します。</li>
</ol>3. 成長条件
<ol><li>成長室の温度を23.5±1.5°C、湿度35~45%に設定します。</li>
	<li>180 ~ 240 μE∙m-2°S-1 (IL 1700研究放射計、国際光)14の間の光強度を設定します。光合成活性放射は90~120 μE∙m-2°S-1です。</li>
	<li>光条件を 24 h 定数に設定します。</li>
</ol>4.タッチフォースローディングマシンの構築
注:このロボットヘアタッチフォースローディングマシン(モデルK1)は、タッチフォースシグナリング変異スクリーニングと植物チグモルフォジェネシス生成の両方の目的を果たすように設計されています(図1、図2)。
<ol><li>プレインストール モジュール (マウント解除、図 1C)<ol>
<li>2 つのスライド ブロック (I)と 1 つの57 ステッパー モータ (II)を X/Y 軸ガイド レール モジュール(III/V)に取り付けます。</li>
		<li>X/Y 軸補助桁(IV/VI)に 2 つのスライド ブロック (I)を取り付けます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>その他の機械部品の取り付け (図 1C)<ol>
<li>ガイドレールの両端に2つのジャンクションプレート(VII)を組み立て、X軸ガイドレールモジュール(III)とX軸補助桁(IV)を一緒に固定します。</li>
		<li>Y軸ガイドレールモジュール(V)を2つのスライドブロック(X軸)の背面に固定し、その間に2つのジャンクションプレート(VIII)を組み立てることによって交差位置に固定します。</li>
		<li>Y軸補助桁(VI)を他の2つのスライドブロック(X軸)の背面に固定し、その間に2つのジャンクションプレート(VIII)を組み立てることによって交差位置に固定します。</li>
		<li>ロボットアーム(IX)のホルダーを2つのスライドブロック(Y軸)の前面にジャンクションプレート付きの交差位置に組み立てます(図2A)。</li>
		<li>クランプ付きロボットアーム(IX)に4本のヘアブラシ(X)を組み立てます(図2B)。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5.タッチフォースローディングマシン設定
注:下の太字フォントでモデルK1タッチマシンを設定するための制御パラメータはすべて、コントロールパネル(図2F)に示されています。
<ol><li>ロボットアームにタッチヘアブラシを取り付けます。330 mm の長さのスチール ルーラーをホルダーとして使用して、人間の髪の 1 つの層(3,600~4,600 本のヘア/ブラシ)を均等に固定します。髪の長さは126mm(図1C)です。</li>
	<li>これらのスチールルーラーを 2 つの金属クランプでロボットアームに固定します。</li>
	<li>最初に垂直寸法(Y軸)に沿ってマシンアームの高さを設定します。ジョグ F+を押して上げ、ジョグ R-を押してロボットアームとブラシを下げます。ヘアブラシの先端をカップリムより0.5cm低くします。ゼロセットを押します。すべての植物の個人が触れていることを確認するためにマシン1-2サイクルを事前に実行します。タッチ期間中、ブラシとヘアチップを毎日同じ高さに調整し、調整します。</li>
	<li>電子スケールを使用してタッチフォース(垂直ローディング)を測定し、タッチフォースレベルを1-2 mN14で維持します。</li>
	<li>水平寸法(X軸)に沿った機械アームの開始位置を手動で設定します。ヘアブラシを各トレイの端に掛け、触れる実験が始まる前に植物が触れていないことを確認します。ジョグF+/ジョグR-を押して、マシンアームを少しずつ水平に動かして開始位置を設定します。</li>
	<li>移動ボタンを押して、ヘアブラシの移動距離を水平寸法(X軸)で365mmに設定します。プレス株式会社F+/Inc. R-は、完全な移動距離を取得し、すべての処理された植物が全体の接触実験中に触れていることを確認するために、マシンアームを移動します。</li>
	<li>自動速度ボタンを押して、マシンアームのX軸に沿った移動速度を5,000mm/minに設定します。タッチ実験全体で同じ移動速度を維持します。</li>
	<li>マイナーサイクルボタンを押して、20回のトライアルでタッチタイムを設定します。タッチ実験全体の間にラウンドあたりのタッチ数を同じにしてください。 注:1マイナーサイクルは2つの移動距離に等し、マシンアームが開始位置から終了位置に移動し、開始位置に戻ることを意味します。1つのマイナーサイクルは2つのタッチを生成します。ヘアブラシは20回の試行内で植物に40回触れる(2タッチ×20トライアル=40タッチ)。40タッチは、タッチフォースローディングの1ラウンドであると定義されています。</li>
	<li>メジャー期間ボタンを押して、タッチラウンドの繰り返し間隔を1日あたり480分に設定します。タッチ実験全体の間、タッチラウンドの同じ頻度を維持します。 注:これは、ヘアブラシが1日3ラウンドの植物に触れ、各ラウンド間の間隔時間は480分(8時間)です。表示される青色の数字は、各タッチラウンドの間隔時間を表します。マシンは、下のカウントダウン(赤い数字)が0000に変わると、自動的にタッチの新しいラウンドを開始します。</li>
	<li>メジャーサイクルを12回のトライアルで設定すると、機械は4日間以内に12ラウンドのプラントに自動的に触れます。この 12 の試行の設定は、タッチの日をスキップする人為的なエラーを回避するために使用されます。</li>
	<li>開始ボタンを押して、あらかじめ設定されたプログラムを開始します。モデルK1タッチマシンは、自動的に設定に応じてタッチフォースロードを実行します。</li>
</ol>6. 生理学的データ収集・分析
<ol><li>
ボルト締めまでの日数: 触れる実験の中で、各プラントのボルト締結日を個別に記録します。ボルト締めは、植物が成長期を栄養相から生殖段階に変化させるシンボルです。アラビドプシスでは、ボルト締結日は、植物が最初の花序の茎の長さが1cmに達するために使用される日数として定義されます。 注:上記の成長条件下では、野生型植物のボルト締めは通常、種子播種後19日から23日に開始し、28-32日で終了します。</li>
	<li>
ロゼット半径:ロゼットの中心から最も長い葉の先端までの距離を測定します。<ol>
<li>上からトレイ全体の写真を撮ります。対照群とタッチ処理グループの写真を別々に撮ります。</li>
		<li>適切なソフトウェアをダウンロードします。たとえば、無料でダウンロードしたソフトウェアImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/download.html) を使用します。</li>
		<li>写真ファイルを開き、ズーム機能を使用して写真を適切なサイズにズームします。</li>
		<li>ロゼットの中心と最も長い葉の先端の間に直線を描画するには、[直線]ツールを選択して、ロゼット半径を測定します。</li>
		<li>1つのプラントを選択し、左ボタンを押して、ロゼットの中心から最も長い葉の先端に直線を描きます。</li>
		<li>分析測定機能を選択するか、Ctrl + Mキーを押して線の距離を分析します。</li>
		<li>1 つのカップを選択し、前の 2 つの手順を繰り返して、各プラスチック カップの直径を同時に分析します。これらのデータを使用して計算を実行し、写真撮影によるバイアスを排除します。 注: 方程式は次のとおりです。 Ra/Da = Rm/Dm (Ra, 植物の実際のロゼット半径;Da, プラスチックカップの実際の直径;Rm, ソフトウェアによって決定された同じプラントの測定ロゼット半径;Dm、同じ植物を栽培するために使用されるプラスチックカップの測定直径)</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ロゼット面積:ロゼットの葉の水平2次元表面積を測定します。<ol>
<li>ロゼット器官の残りの部分に影響を与えることなく、花序を削除します。</li>
		<li>近くに配置されたスケール定規と一緒に各植物の上部から写真を撮ります。</li>
		<li>ImageJ、ロゼットトラッカーの1つの無料プラグインを使用し、以前に公開されたプロトコルに従ってください22.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Jaffe, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thigmomorphogenesis%3A+the+response+of+plant+growth+and+development+to+mechanical+stimulation+with+special+reference+to+Bryonia+dioica%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Thigmomorphogenesis: the response of plant growth and development to mechanical stimulation with special reference to Bryonia dioica.</a> Planta. 114, 143-157 (1973).</li>
<li>Vandenbrink, J. P., Kiss, J. Z., Herranz, R., Medina, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+and+gravity+signals+synergize+in+modulating+plant+development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Light and gravity signals synergize in modulating plant development.</a> Frontiers in Plant Science. 5, 563(2014).</li>
<li>Hashiguchi, Y., Tasaka, M., Morita, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+higher+plant+gravity+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Mechanism of higher plant gravity sensing.</a> American Journal of Botany. 100, 91-100 (2013).</li>
<li>Salisbury, F. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSalisbury%2C+FB+%22The+Flowering+Process%22">The Flowering Process</a>. , Macmillan. New York. (1963).</li>
<li>Darwin, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDarwin%2C+C+%22The+Power+of+Movement+in+Plants%22">The Power of Movement in Plants</a>. , Appleton. New York. (1881).</li>
<li>Chehab, E. W., Eich, E., Braam, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thigmomorphogenesis%3A+a+complex+plant+response+to+mechano-stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Thigmomorphogenesis: a complex plant response to mechano-stimulation.</a> Journal of Experimental Botany. 60, 43-56 (2008).</li>
<li>Telewski, F. W., Jaffe, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thigmomorphogenesis%3A+anatomical%2C+morphological+and+mechanical+analysis+of+genetically+different+sibs+of+Pinus+taeda+in+response+to+mechanical+perturbation%5BTitle%5D)+AND+%22Physiologia+Plantarum%22%5BJournal%5D)">Thigmomorphogenesis: anatomical, morphological and mechanical analysis of genetically different sibs of Pinus taeda in response to mechanical perturbation.</a> Physiologia Plantarum. 66, 219-226 (1986).</li>
<li>Vogel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+precision+measurements+of+radial+increment+in+a+mature+spruce+stand+and+interpretation+variants+of+short+term+changes+in+increment+values%5BTitle%5D)+AND+%22Allgemeine+Forst-und+Jagdzeitung%22%5BJournal%5D)">Automatic precision measurements of radial increment in a mature spruce stand and interpretation variants of short term changes in increment values.</a> Allgemeine Forst-und Jagdzeitung. , Germany. (1994).</li>
<li>Braam, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+touch%3A+plant+responses+to+mechanical+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">In touch: plant responses to mechanical stimuli.</a> New Phytologist. 165, 373-389 (2005).</li>
<li>Jaffe, M. J., Leopold, A. C., Staples, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thigmo+responses+in+plants+and+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Thigmo responses in plants and fungi.</a> American Journal of Botany. 89, 375-382 (2002).</li>
<li>Telewski, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unified+hypothesis+of+mechanoperception+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Botany%22%5BJournal%5D)">A unified hypothesis of mechanoperception in plants.</a> American Journal of Botany. 93, 1466-1476 (2006).</li>
<li>Gutiérrez, R. A., Ewing, R. M., Cherry, J. M., Green, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+unstable+transcripts+in+Arabidopsis+by+cDNA+microarray+analysis%3A+rapid+decay+is+associated+with+a+group+of+touch-and+specific+clock-controlled+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Identification of unstable transcripts in Arabidopsis by cDNA microarray analysis: rapid decay is associated with a group of touch-and specific clock-controlled genes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11513-11518 (2002).</li>
<li>Lee, D., Polisensky, D. H., Braam, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+of+touch-and+darkness-regulated+Arabidopsis+genes%3A+a+focus+on+calmodulin-like+and+XTH+genes%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification of touch-and darkness-regulated Arabidopsis genes: a focus on calmodulin-like and XTH genes.</a> New Phytologist. 165, 429-444 (2005).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+functional+posttranslational+modification+proteomics+reveals+that+TREPH1+plays+a+role+in+plant+touch-delayed+bolting%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Quantitative and functional posttranslational modification proteomics reveals that TREPH1 plays a role in plant touch-delayed bolting.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences United States of America. 115, 10265-10274 (2018).</li>
<li>Hamilton, E. S., Schlegel, A. M., Haswell, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((United+in+diversity%3A+mechanosensitive+ion+channels+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">United in diversity: mechanosensitive ion channels in plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 66, 113-137 (2015).</li>
<li>Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+plant+aequorin+reports+the+effects+of+touch+and+cold-shock+and+elicitors+on+cytoplasmic+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium.</a> Nature. 352, 524(1991).</li>
<li>Toyota, M., Furuichi, T., Tatsumi, H., Sokabe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+calcium+increases+in+response+to+changes+in+the+gravity+vector+in+hypocotyls+and+petioles+of+Arabidopsis+seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic calcium increases in response to changes in the gravity vector in hypocotyls and petioles of Arabidopsis seedlings.</a> Plant Physiology. 146, 505-514 (2008).</li>
<li>Knight, M. R., Smith, S. M., Trewavas, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wind-induced+plant+motion+immediately+increases+cytosolic+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Wind-induced plant motion immediately increases cytosolic calcium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 4967-4971 (1992).</li>
<li>Braam, J., Davis, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rain-%2C+wind-%2C+and+touch-induced+expression+of+calmodulin+and+calmodulin-related+genes+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Rain-, wind-, and touch-induced expression of calmodulin and calmodulin-related genes in Arabidopsis.</a> Cell. 60, 357-364 (1990).</li>
<li>Chehab, E. W., Yao, C., Henderson, Z., Kim, S., Braam, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+touch-induced+morphogenesis+is+jasmonate+mediated+and+protects+against+pests%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis touch-induced morphogenesis is jasmonate mediated and protects against pests.</a> Current Biology. 22, 701-706 (2012).</li>
<li>Telewski, F. W., Pruyn, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thigmomorphogenesis%3A+a+dose+response+to+flexing+in+Ulmus+americana+seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22Tree+Physiology%22%5BJournal%5D)">Thigmomorphogenesis: a dose response to flexing in Ulmus americana seedlings.</a> Tree Physiology. 18, 65-68 (1998).</li>
<li>De Vylder, J., Vandenbussche, F. J., Hu, Y., Philips, W., Van Der Straeten, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rosette+tracker%3A+an+open+source+image+analysis+tool+for+automatic+quantification+of+genotype+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Rosette tracker: an open source image analysis tool for automatic quantification of genotype effects.</a> Plant Physiology. , (2012).</li>
<li>Clark, T., Bradburn, M., Love, S., Altman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+analysis+part+I%3A+basic+concepts+and+first+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Survival analysis part I: basic concepts and first analyses.</a> British Journal of Cancer. 89, 232(2003).</li>
<li>Bradburn, M. J., Clark, T. G., Love, S., Altman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+analysis+part+II%3A+multivariate+data+analysis%E2%80%93an+introduction+to+concepts+and+methods%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Survival analysis part II: multivariate data analysis–an introduction to concepts and methods.</a> British Journal of Cancer. 89, 431(2003).</li>
<li>Jaffe, M., Forbes, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thigmomorphogenesis%3A+the+effect+of+mechanical+perturbation+on+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Growth+Regulation%22%5BJournal%5D)">Thigmomorphogenesis: the effect of mechanical perturbation on plants.</a> Plant Growth Regulation. 12, 313-324 (1993).</li>
<li>Kutschera, U., Niklas, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+plant+physiology%3A+Charles+Darwin%E2%80%99s+forgotten+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Naturwissenschaften%22%5BJournal%5D)">Evolutionary plant physiology: Charles Darwin’s forgotten synthesis.</a> Naturwissenschaften. 96, 1339(2009).</li>
</ol>

著者は何も開示していない。

チグモルフォジェネシスは、細胞シグナル伝達と植物ホルモンの作用のネットワークを含む機械的摂動に対する複雑な植物成長応答である。それは望ましくない環境条件の下で生き残るために植物の適応進化の結果である25,26.機械的な接触、特に人間の指のタッチおよび手持ち型綿棒タッチは、以前のチグモ形態遺伝学的研究14、20におけるこの形態学的変化を研究するために選択されている。植物の接触応答をトリガするタッチフォースローディングのこの簡素化されたバージョンは、制御し、適用することが容易です。さらに、このタイプのタッチフォースローディング方法は、自然環境19で生成される風および雨滴滴刺激力信号を何らかの方法で模倣することができる。タッチ力は、カルシウムスパイクを引き起こすことができる、タンパク質リン酸化14および下流遺伝子発現...

植物チグモルフォジェネシスは、1973年1月にJaffe、MJによって造られた用語です。これは植物のトロピズムですが、太陽光や重力の刺激によって引き起こされるよく知られた光トロピズムや重力とは異なります 2,3.これは、初期の時間4、5で植物学者によって頻繁に観察されている周期的な機械的刺激に関連する表現力学的変化について説明する。雨滴、風、植物、動物および人間の接触、動物咬傷であっても、植物4、5における力シグナル伝達を引き起こす異なるタイプのメカノ刺激であると考えられている。植物のチグモルフォジェネシスの特徴は、ボルト締めの遅れ、より短い茎、草本植物におけるより小さいロゼット/葉のサイズ、および木質植物6、7、8の厚い茎を含む。これは、ミモザ植物または他のメカノ感受性ブドウによく見られるチグモナスチックまたはチグモトロピック応答とは異なり、これらの急速なタッチ応答は1、9、10を観察することが容易である。一方、チグモルフォジェネシスは、成長応答が遅いため観察が比較的困難である。チグモルフォジェネシスは、通常、数週間または連続的な力負荷刺激の後に観察されます。植物のタッチ応答のこのユニークな性質は、強い方法でタッチフォースシグナリング耐性変異体を分離するために、人間の手のタッチ刺激を使用して前方遺伝スクリーンを実行することが困難になります。
チグモルフォジェネシス6、11の根底にある力信号伝達経路および分子機構を解明するために、過去6、分子および細胞生物学的実験が行われてきた。12,13,14.これらの研究は、植物力シグナル受容体が主にメカノ感受性イオンチャネル(MSC)と膜スパンタンパク質の多重体複合体によって構成されるテザリングMSC複合体で構成することを提案している11,14,15.最初のタッチの数秒以内に生成された細胞質Ca2+過渡スパイク。風、雨、または重力刺激は、下流のカルシウムセンサと相互作用して、力信号を核イベント14、16、17、18に伝達してもよい。分子および細胞の研究に加えて、植物の手動指触りを持つ前方遺伝スクリーンは、植物ホルモンおよび二次代謝産物が、その後のタッチ誘導性(TCH)遺伝子発現に関与していることを発見した。タッチフォースローディング13,19.例えば、aosおよびopr3 20変異体は、遺伝的研究から遠く離れて同定されている。しかし、チグモルフォジェネシスの研究における前方遺伝学の適用に関連する主な問題は、タッチ応答のレベルを定量化し、遺伝的に変異した多数の集団に触れるのに必要な集中的な労働である。個々の植物。時間のかかる問題は、手触りベースの変異スクリーン14、20にも持続します。例えば、タッチフォース刺激の1ラウンドを完了するには、人は個々の植物で30〜60回(毎秒1タッチ)に触れる必要があります。統計的表現型解析に十分な数の植物を持つためには、通常、タッチフォースローディングプロセスには、同じ遺伝子型の20~50個の植物が必要です。このタッチフォースローディング体制は、人が選択した1つの遺伝子型に対して600-3,000タッチを繰り返し実行する必要があることを意味します。このタイプのタッチは通常、1日に3〜5ラウンド繰り返す必要があり、これは植物の遺伝子型ごとに1日あたり約1,800〜15,000本の指または綿棒のタッチに相当します。十分な訓練を受けた人は、通常、力と強度の大きな変動を避けるために、1日の繰り返しの多くのラウンドを通じて、望ましい範囲内で複数のタッチの強さと力を維持するために必要とされます。チグモルフォジェネシスが飽和性および用量依存性プロセス6、21であることがよく知られているように、タッチ力/強度は、植物のタッチ応答をトリガすることに成功するために重要になります。
人依存のタッチフォース負荷を除去し、許容誤差範囲内で機械的な適用を維持するために、我々は、したがって、手操作タッチを置き換えるために自動タッチフォースローディングマシンを設計しました。機械に4つの動く腕が造られて、それぞれ1つの人間の毛のブラシが装備されている。このバージョンは、人間の髪のタッチフォースローディングの特徴を指定するためにモデルK1と名付けられています。1台の機械下でのチグモ形態形成またはタッチ応答に対して4つの遺伝子型を定量的に測定すれば、遺伝子型当たり40~48個個体を測定することができます。タッチ繰り返しの各ラウンド(植物あたりのタッチの60回未満)は、移動速度調整可能なロボットアームを使用して5分未満持続します。したがって、モデルK1タッチマシン上の植物は、最初にプログラムされた一定のタッチフォース負荷または異なるレベルの強度を持つ1日に複数のラウンドのために機械的に刺激することができます。
したがって、モデル植物生物であるアラビドプシス・タリアナは、全自動ヘアタッチフォースローディングマシンアプリケーションをテストするためのターゲット植物種として選ばれました。変異体の様々な胚芽と開花の大きさを取り出すために利用可能ないくつかの大きな種子バンクがあるので、アラビドプシスは、モデルK1タッチマシンに取り付けられた成長棚で利用可能なスペースによくフィットします。
モデルK1自動タッチマシンは、(1)2つのベルト駆動リニアアクチュエータで構成されるH字型金属ラック、(2)ヘアブラシを装備したロボット金属アーム、(3)コントローラーの3つの主要コンポーネントで構成されています。カスタマイズされたモデルK1タッチマシンの場合、各X/Y軸モジュールは、1つのベルト駆動ガイドレール、2つのスライドブロック(赤)、1つの57ステッパーモータ(プリインストールおよび取り外し可能)で構成されています(図1A、B)。上部の水平アクチュエータは、ロボット金属アームを左右水平に動かすことを可能にし、下部垂直ベルト駆動の線形アクチュエータは、ロボット金属アームを垂直に上下に動かすことを可能にします(図1B、図2 A)).垂直アクチュエータには4本の取り外し可能なロボットアームが取り付けられました(図1C、図2B)。4本のヒト毛ブラシをそれぞれ4本のロボットアームに結合した(図1C、図2B)。下の太字フォントでモデルK1タッチマシンを構築するすべての機械部品は、図1Cにマークされています(また、材料の表を参照してください)。

<table><tbody><tr><td>4本のヘアブラシカスタマイズ</td><td></td><td></td>4<td></td></tr>本、<tr><td>1つのホルダー</td><td></td><td></td>付きロボットアーム4本、<td>長さ1000mmのホルダーと長さ560mmのロボットアーム</td></tr><tr><td>57ステッピングモーター57HS22-A</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>万能培養土</td><td>プランメイト、香港</td><td></td><td></td></tr><tr><td>シロイヌナズナ植物種</td><td>シロイヌナズナ生物資源センター、オハイオ州</td><td></td><td>コロンバスシロイヌナズナの種子購入</td></tr><tr><td>のために、BIO-MIX培養土層</td><td>Jiffy Products International BV、オランダの</td><td>1000682050</td><td>2つの土壌を混ぜてシロイヌナズナを育てました。すべての目的の培養土と&nbsp;BIO-MIXは、1:2</td></tr><tr><td>IL 1700研究用放射計</td><td>International Light, Newburyport, MA</td><td></td><td>全波長と光合成活性放射の両方の光強度を測定することができます。</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td><td></td><td>無料でダウンロードできるソフトウェア</td></tr><tr><td>Ju Feng Precision and Automation Technology Limited</td><td>Shenzhen, China</td><td></td><td>ベルト駆動リニアアクチュエーターやその他の機械モジュールを購入</td></tr><tr><td>スライドブロック</td><td></td><td></td>のジャンクションプレートを購入 <td>スライドブロックの背面にYガイドレールモジュールまたはY補助ガーダーを固定するには</td></tr><tr><td>X軸のジャンクションプレートカスタマイズされたモジュール</td><td></td><td></td><td>XガイドレールモジュールとX補助ガーダーを接続するには</td></tr><tr><td>スライドブロック</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>WDT4045 X軸ガイドレールモジュール</td><td></td><td>843mm、カスタマイズ</td><td>2つのスライドブロックと1つの57ステッピングモーターがプリインストール</td></tr>されています <tr><td>WDT4045 Y軸ガイドレールモジュール</td><td></td><td>1038 mm、カスタマイズ</td><td>2つのスライドブロックと1つの57ステッピングモーター</td></tr><tr><td>がプリインストールされていますX軸補助桁</td><td></td><td>843mm、カスタマイズ</td><td>スライドブロック2個付き</td></tr><tr><td>Y軸補助桁</td><td></td><td>1038mm、カスタマイズ</td><td>スライドブロック2個付き</td></tr></tbody></table>

モデル植物アラビドプシスタリアナのチグモ形態形成の研究のための省力と反復可能なタッチフォースシグナル伝達変異スクリーンプロトコル

A Labor-saving and Repeatable Touch-force Signaling Mutant Screen Protocol for the Study of Thigmomorphogenesis of a Model Plant Arabidopsis thaliana

細胞内および細胞外の機械的刺激(または力信号)の両方に応答し、特別な形態変化を開発する植物は、チグモルフォジェネシスと呼ばれる。過去数十年にわたり、いくつかのシグナル伝達成分が同定され、メカノトランスダクション(例えば、カルシウムイオン結合タンパク質およびジャスモン酸生合成酵素)に関与していると報告されている。しかし、力シグナル伝達またはチグモルフォ形成の研究における研究の比較的遅いペースは、主に2つの理由に起因する:チグモルフォジェネシスの手で操作されたタッチ誘導の面倒な人間の要求と力強度誤差人の手触りに関連付けられています。植物生物の外力負荷の効率を高めるために、自動タッチフォースローディングマシンを構築しました。このロボットアーム駆動ヘアブラシタッチは、省力で簡単に再現可能なタッチフォースシミュレーション、タッチ繰り返しの無制限のラウンドと調整可能なタッチ強度を提供します。この毛髪タッチフォースローディングマシンは、タッチフォースシグナリング変異体の大規模スクリーニングと植物チグモルフォジェネシスのフェノミクス研究の両方に使用することができます。また、人間の毛髪などのタッチ素材は、動物の毛髪、絹糸や綿繊維などの他の天然素材と置き換えることができます。機械の自動移動腕は、それぞれ雨滴と風の自然な力を模倣するために、水振りノズルと空気送風機を装備することができます。この自動ヘアタッチフォースローディングマシンを手で行った綿棒タッチと組み合わせて、M AP KINASE KINASE 1(MKK1)とMKK2プラントの2つの力シグナリング変異体のタッチ応答を調べました。.タッチフォースロード野生型植物と2つの変異体のフェノームを統計的に評価した。彼らはタッチ応答に大きな違いを示した。

自動ヘアタッチフォースローディングマシン 植物の形態変化を観察するためには、再現可能な成長条件と治療方法の両方が反復可能な結果を得るための鍵となります。このハイスループットと自動タッチフォースシグナリング変異スクリーニングは、新たに構築されたヘアタッチフォースローディングマシン、モデルK1(図1、図2)によって達成されます。これらのヘアブラシは、同時に植物の最大4トレイに触れることができます。トレイに24杯入れられ、12カップの植物が対照植物と処理植物の両方として使用されたグループ(図2C,D)。各カップで、4つの植物が栽培され、合計48以下の植物の個体が同じヘアブラシに触れられ、後の統計分析に十分な植物を保証します。植物の最大4つのゲノムタイプは、1つのモデルK1タッチマシンで同時にタッチ処理することができます。チグモルフォジェネシスは用量依存性6、21であるため、重要なポイント<su...

穏やかなタッチフォースローディングマシンは、人間のヘアブラシ、ロボットアーム、コントローラーから構築されています。ヘアブラシは、機械に取り付けられたロボットアームによって駆動され、植物にタッチフォースを適用するために定期的に移動します。機械駆動のヘアタッチの強さは、手動で適用されたタッチの強度に匹敵します。

Plants responding to both intracellular and extracellular mechanical stimulations (or force signals) and develop special morphological changes, a called ...

植物シグナル形態形成を観察する自動タッチ力機械を構築します。私は植物に穏やかなタッチ力を適用するために人間の髪のブラシでインストールロボットアーム。人間の指のタッチと比較して、自動人間のヘアタッチマシンは、より多くの省力、均一なタッチ力の負荷を提供することができます。1ラウンドの荷重に必要な時間は、数分以内に制限できます。数時間の指の接触および綿棒の接触と比較して、ロボット機械は植物の商業的応答の調査を大きく改善できる。処理された植物の効率と人口を増やすことで、自動タッチ機が4つのシグナル伝達変異スクリーンと、動植物の両方での商業的応答研究に適用されることを期待しています。まず、7日間MS培地で8%寒天プレートで種子を育てた後、各遺伝子型の発芽率をテストします。発芽率に応じて、種子を生産する植物の所望の数よりも4〜5倍以上の量を調製する。1.5ミリリットルのプラスチックチューブに冷たい水に種子を浸し、暗闇の中で保つためにアルミ箔で覆います。種子のインビビションのために摂氏4度で保管してください。インビビションの5~7日後に、植物の成長に適した土壌を選択する。大きな塊を避け、フォークを使用して均一に混ぜます。上縁径7.4センチの24個の207ミリリットルのプラスチックカップを用意します。灌漑目的でカップの底部に3つの丸い穴を開けます。これらのプラスチックカップを混合土壌で満たします。土がカップリムよりも約1センチメートル高く積み重ね、ルーラーを使用して積み上げられた土壌の表面を柔らかく平らにします。プラスチックトレイに24カップを移します。成長チャンバーの光強度を1平方メートルあたり180~240マイクロインスタインの間に設定し、植物の速い成長のための光合成活性放射よりも高い。ライト条件を24時間一定に設定します。成長チャンバーの温度を摂氏23.5プラスマイナス1.5度、湿度を35~45%に設定し、各トレイに2.5リットルの水を加えます。土は、カップの底にある穴から水を吸収し、カップリムレベルに落ちる土壌の表面を待ちます。2時間後、3~4種を1つの場所にまき、カップ内に4つの均等に分布したスポットをまきます。各トレイの上に透明なプラスチックカバーを置き、種子を1週間発芽させます。その後、カバーを取り外し、苗がさらに1週間成長できるようにします。種子が発芽した後、1日おきに1.5リットルの水で植物を灌漑する。種まき後9~10日後、薄くして余分な芽を取り除きます。シュートをカットし、土壌から植物全体を直接引っ張り出さないように小さなはさみを使用してください。各カップに同様のサイズの3〜4個の植物個体。タッチヘアブラシをロボットアームに取り付けるには、まず接着剤を使用して、人間の髪の1層を330ミリメートルの長さのスチール定規に均等に固定します。髪の長さは126ミリメートルです。2つの金属クランプで、それらのスチールルーラーをロボットアームに取り付けます。コントロールパネルで、ジョグFプラスを押して上げ、ジョグRを引いてロボットアームとブラシを下げるので、垂直寸法に沿って機械アームの高さを設定します。ヘアブラシの先端をカップリムより5センチ低く保ちます。Inc FプラスまたはRマイナスを押して機械を1〜2サイクル前に動かして、すべての植物個体が触れられていることを確認します。公式実験の前に、電子スケールを使用してタッチ力を測定します。1~2ミリニュートン間の接触力を維持するために、機械アームの高さを調整します。次に、水平寸法に沿って機械アームの開始位置を手動で設定します。ヘアブラシを各トレイの端に掛けさせます。ジョグFプラスまたはジョグRマイナスを押して、機械アームを少しずつ水平に動かして、触れる実験が始まる前に植物が触れられていないことを確認します。移動ボタンを押して、水平寸法のヘアブラシの移動距離を365ミリメートルに設定します。プレス社FプラスまたはRマイナスは、完全な移動距離を取得し、すべての処理された植物が触れていることを確認するために、マシンアームを移動させます。次に、自動速度ボタンを押して、機械アームのx軸に沿った移動速度を毎分5000ミリメートルに設定します。マイナーサイクルボタンを押して、ラウンドあたり40タッチに等しい20回のトライアルでタッチ時間を設定します。ヘアブラシが8時間の間隔で1日3ラウンド植物に触れることができる主要な期間ボタンを押して、1日あたり480分でタッチラウンドの繰り返し間隔を設定します。カウントダウンがゼロになると、マシンは自動的に新しいタッチラウンドを開始します。12回の試験で主要なサイクルを設定し、機械が4日間の期間内に12ラウンドのプラントに触れるようにします。開始ボタンを押して、プリセットプログラムを開始します。触れる期間全体の間に、ブラシと髪の先端を毎日同じ高さに調整し、調整します。触れる実験の中で各植物のボルト締め日を追跡するために、各植物の最初の発泡性茎を毎日観察する。長さを測定し、それが1センチメートルに達したときに成長の持続時間を記録し、それは栄養段階から生殖段階に移行したことを意味します。ロゼット半径の尺度は、上から全体のトレイの写真を撮ります。画像処理ソフトウェアを使用して、ロゼットの中心から最長葉の先端までの距離を、カップリムを定規として測定します。ロゼット領域を測定するには、まず、ロゼットの器官の残りの部分に影響を与えることなく、花序を除去する。近くに配置スケール定規と一緒に各植物の上から写真を撮ります。画像処理ソフトでは、ロゼット葉の水平2次元表面積を測定する。本実験では綿棒手動タッチ処理を野生型コントロールコロンビアゼロ植物での機械駆動ヘアタッチ処理と比較した。連続綿棒タッチ処理後1.7日遅れ。同様に自動機械駆動ヘアタッチでは、遅れたボルト締めが観察された。1変量コックスハザード分析は、タッチグループ内の植物のボルト締めリスクが、それぞれ対照群の植物と比較して31%および52%であることを示しています。しかしながら、このボルト締め遅延はtDNA挿入変異体、NKK1およびNKK2では認められなかった。1変量コックス比例ハザードモデルは、野生型コロンビアゼロのみが41の推定HRを有する対照植物とタッチ植物の間に有意な差を示したことを示す。形態学的変化のために、野生型コロンビアゼロ植物は、一定かつ繰り返し自動マシン駆動ヘアタッチの3日後に有意に小さいロゼット半径と短い葉の長さを示した。予想ロゼットエリアは、タッチの13日後に20から16平方センチメートルに変更されました。タッチ力の荷重が傷につながらないようにするには、適切なタッチ力を慎重に設定する必要があります。タッチ応答アッセイに適したシロイヌナズナズナシスプラントを製造するには、一連の適切な成長条件が必要です。例えば、信号形態形成を観察するには、1平方メートル当たり180~240マイクロインスタインの間の光強度が24時間必要である。機械的な力の負荷の他の形態に拡張するために、機械はまた、将来的に雨や風の影響を模倣するために、水を散水ノズルや風の送風機で変更することができます。

a-labor-saving-repeatable-touch-force-signaling-mutant-screen

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

細胞生物学の基本的なクエストは、真核生物の細胞を作る細胞内小器官のアイデンティティの根底にあるメカニズムを定義することです。ここでは、蛍光顕微鏡と次世代シーケンシングツールを用いた植物オルガネラの形態と機能の整合性の責任遺伝子を同定する手法を提案する。...

蛍光顕微鏡スクリーニングと次世代シーケンシング：オルガネラの整合性に関与する遺伝子の同定のための有用なツール

細胞内レベルでは、シグナル伝達イベントは発生的および環境的な手がかりによって動的に調節されます。ここでは、タバコの一過性発現システムを使用して、動的なタンパク質間相互作用を監視し、植物細胞におけるシグナル伝達の空間的構成を明らかにするプロトコルについて説明します。...

タバコ一過性発現系を使用したMAPKシグナル伝達経路の空間再編のイメージング

このプロトコルでは、顕微鏡下で胚パターン形成の検査続く胚珠クリアランスを介してシロイヌナズナの胚発生を観察するためのメソッドについて説明します。...

シロイヌナズナの胚発生の特性評価法

このプロトコルは、アブラムシなどの半翅目昆虫の摂食によって生成される植物のカルシウム信号の分析のための簡単な方法をについて説明します。シロイヌナズナを用いたGFP カルシウム センサー GCaMP3...

リアルタイム体内シロイヌナズナカルシウム信号の間に記録して蛍光バイオ センサーを用いた昆虫の餌

本研究の目的は、漂白剤や塩素ガス滅菌滅菌メディア上に成長した範囲のシロイヌナズナ遺伝子型の種子発芽の効果を決定するためだった。最適化された殺菌のプロトコルは、満足のいく種子の生存を提供しながら汚染微生物の増殖を防ぐために開発されています。...

高スループット シロイヌナズナ種子の殺菌のための標準化された方法

ここでは、我々 は生成を記述して形質転換シロイヌナズナのセットのアプリケーション線 3...

誘導、細胞型における発現シロイヌナズナLhGR を介したトランス-活性化

本論文では、免疫エリミターへの曝露後のアラビドプシス・タリアナにおける防御応答を定量化する2つの方法について、一過性酸化バーストと苗増殖の抑制について述べた。...

アラビドプシスタリアナにおけるパターン誘発酸化バーストと苗成長抑制アッセイ

リボソームアフィニティー精製(TRAP)を翻訳すると、臓器や組織の最小限の処理で開発プログラムを解剖する可能性があります。このプロトコルは、緑色蛍光タンパク質(GFP)標識リボソームサブユニットを標的とした細胞から高品質のRNAを生成します。qRT-PCR や RNA-seq...

細胞型特異的スケールでのシロイヌナズナ・タリアナの開発を調査するためのリボソーム親和性精製(TRAP)の翻訳

ここでは、細胞内の細胞骨格を撮影する上皮状の微小管細胞骨格を生細胞イメージングするためのプロトコルを説明し、物理的な力の変化に対する応答を監視する。...

ミクロチューブ細胞骨格の生細胞イメージングと シロイヌナズナの 微小機械的操作

読み出しとしてCa2+の標高に基づく前方遺伝的スクリーンは、植物のカルシウム依存性シグナル伝達経路に関与する遺伝的成分の同定につながる。...

トランスジェニックカルシウムレポーターエークオリンを用いたニューシグナル伝達の新しい標的の同定を用いた遺伝子スクリーンの前方

細胞外グルタミン酸誘発全身カルシウムシグナル伝達は、植物における機械的創傷および草食動物攻撃に対する植物防御応答の誘導にとって極めて重要である。本稿では、カルシウムとグルタミン酸に敏感な蛍光バイオセンサーを発現する シロイヌナズナ植物...

シロイヌナズナにおける局所および全身創傷信号の広視野、リアルタイムイメージング

学ぶロボットアームと人毛ブラシを用いた自動タッチフォース装置によるアラビドプシスタリアナの機械刺激応答解析。省力化と再現性を高めたシグナル伝達変異スクリーニング法で植物形態形成研究を効率化します。

モデル植物アラビドプシスタリアナのチグモ形態形成の研究のための省力と反復可能なタッチフォースシグナル伝達変異スクリーンプロトコル

さらに動画を探す