モデル植物アラビドプシスタリアナのチグモ形態形成の研究のための省力と反復可能なタッチフォースシグナル伝達変異スクリーンプロトコル
August 6th, 2019
穏やかなタッチフォースローディングマシンは、人間のヘアブラシ、ロボットアーム、コントローラーから構築されています。ヘアブラシは、機械に取り付けられたロボットアームによって駆動され、植物にタッチフォースを適用するために定期的に移動します。機械駆動のヘアタッチの強さは、手動で適用されたタッチの強度に匹敵します。
植物シグナル形態形成を観察する自動タッチ力機械を構築します。私は植物に穏やかなタッチ力を適用するために人間の髪のブラシでインストールロボットアーム。人間の指のタッチと比較して、自動人間のヘアタッチマシンは、より多くの省力、均一なタッチ力の負荷を提供することができます。
1ラウンドの荷重に必要な時間は、数分以内に制限できます。数時間の指の接触および綿棒の接触と比較して、ロボット機械は植物の商業的応答の調査を大きく改善できる。処理された植物の効率と人口を増やすことで、自動タッチ機が4つのシグナル伝達変異スクリーンと、動植物の両方での商業的応答研究に適用されることを期待しています。
まず、7日間MS培地で8%寒天プレートで種子を育てた後、各遺伝子型の発芽率をテストします。発芽率に応じて、種子を生産する植物の所望の数よりも4〜5倍以上の量を調製する。1.5ミリリットルのプラスチックチューブに冷たい水に種子を浸し、暗闇の中で保つためにアルミ箔で覆います。
種子のインビビションのために摂氏4度で保管してください。インビビションの5~7日後に、植物の成長に適した土壌を選択する。大きな塊を避け、フォークを使用して均一に混ぜます。
上縁径7.4センチの24個の207ミリリットルのプラスチックカップを用意します。灌漑目的でカップの底部に3つの丸い穴を開けます。これらのプラスチックカップを混合土壌で満たします。
土がカップリムよりも約1センチメートル高く積み重ね、ルーラーを使用して積み上げられた土壌の表面を柔らかく平らにします。プラスチックトレイに24カップを移します。成長チャンバーの光強度を1平方メートルあたり180~240マイクロインスタインの間に設定し、植物の速い成長のための光合成活性放射よりも高い。
ライト条件を24時間一定に設定します。成長チャンバーの温度を摂氏23.5プラスマイナス1.5度、湿度を35~45%に設定し、各トレイに2.5リットルの水を加えます。土は、カップの底にある穴から水を吸収し、カップリムレベルに落ちる土壌の表面を待ちます。
2時間後、3~4種を1つの場所にまき、カップ内に4つの均等に分布したスポットをまきます。各トレイの上に透明なプラスチックカバーを置き、種子を1週間発芽させます。その後、カバーを取り外し、苗がさらに1週間成長できるようにします。
種子が発芽した後、1日おきに1.5リットルの水で植物を灌漑する。種まき後9~10日後、薄くして余分な芽を取り除きます。シュートをカットし、土壌から植物全体を直接引っ張り出さないように小さなはさみを使用してください。
各カップに同様のサイズの3〜4個の植物個体。タッチヘアブラシをロボットアームに取り付けるには、まず接着剤を使用して、人間の髪の1層を330ミリメートルの長さのスチール定規に均等に固定します。髪の長さは126ミリメートルです。
2つの金属クランプで、それらのスチールルーラーをロボットアームに取り付けます。コントロールパネルで、ジョグFプラスを押して上げ、ジョグRを引いてロボットアームとブラシを下げるので、垂直寸法に沿って機械アームの高さを設定します。ヘアブラシの先端をカップリムより5センチ低く保ちます。
Inc FプラスまたはRマイナスを押して機械を1〜2サイクル前に動かして、すべての植物個体が触れられていることを確認します。公式実験の前に、電子スケールを使用してタッチ力を測定します。1~2ミリニュートン間の接触力を維持するために、機械アームの高さを調整します。
次に、水平寸法に沿って機械アームの開始位置を手動で設定します。ヘアブラシを各トレイの端に掛けさせます。ジョグFプラスまたはジョグRマイナスを押して、機械アームを少しずつ水平に動かして、触れる実験が始まる前に植物が触れられていないことを確認します。
移動ボタンを押して、水平寸法のヘアブラシの移動距離を365ミリメートルに設定します。プレス社FプラスまたはRマイナスは、完全な移動距離を取得し、すべての処理された植物が触れていることを確認するために、マシンアームを移動させます。次に、自動速度ボタンを押して、機械アームのx軸に沿った移動速度を毎分5000ミリメートルに設定します。
マイナーサイクルボタンを押して、ラウンドあたり40タッチに等しい20回のトライアルでタッチ時間を設定します。ヘアブラシが8時間の間隔で1日3ラウンド植物に触れることができる主要な期間ボタンを押して、1日あたり480分でタッチラウンドの繰り返し間隔を設定します。カウントダウンがゼロになると、マシンは自動的に新しいタッチラウンドを開始します。
12回の試験で主要なサイクルを設定し、機械が4日間の期間内に12ラウンドのプラントに触れるようにします。開始ボタンを押して、プリセットプログラムを開始します。触れる期間全体の間に、ブラシと髪の先端を毎日同じ高さに調整し、調整します。
触れる実験の中で各植物のボルト締め日を追跡するために、各植物の最初の発泡性茎を毎日観察する。長さを測定し、それが1センチメートルに達したときに成長の持続時間を記録し、それは栄養段階から生殖段階に移行したことを意味します。ロゼット半径の尺度は、上から全体のトレイの写真を撮ります。
画像処理ソフトウェアを使用して、ロゼットの中心から最長葉の先端までの距離を、カップリムを定規として測定します。ロゼット領域を測定するには、まず、ロゼットの器官の残りの部分に影響を与えることなく、花序を除去する。近くに配置スケール定規と一緒に各植物の上から写真を撮ります。
画像処理ソフトでは、ロゼット葉の水平2次元表面積を測定する。本実験では綿棒手動タッチ処理を野生型コントロールコロンビアゼロ植物での機械駆動ヘアタッチ処理と比較した。連続綿棒タッチ処理後1.7日遅れ。
同様に自動機械駆動ヘアタッチでは、遅れたボルト締めが観察された。1変量コックスハザード分析は、タッチグループ内の植物のボルト締めリスクが、それぞれ対照群の植物と比較して31%および52%であることを示しています。しかしながら、このボルト締め遅延はtDNA挿入変異体、NKK1およびNKK2では認められなかった。
1変量コックス比例ハザードモデルは、野生型コロンビアゼロのみが41の推定HRを有する対照植物とタッチ植物の間に有意な差を示したことを示す。形態学的変化のために、野生型コロンビアゼロ植物は、一定かつ繰り返し自動マシン駆動ヘアタッチの3日後に有意に小さいロゼット半径と短い葉の長さを示した。予想ロゼットエリアは、タッチの13日後に20から16平方センチメートルに変更されました。
タッチ力の荷重が傷につながらないようにするには、適切なタッチ力を慎重に設定する必要があります。タッチ応答アッセイに適したシロイヌナズナズナシスプラントを製造するには、一連の適切な成長条件が必要です。例えば、信号形態形成を観察するには、1平方メートル当たり180~240マイクロインスタインの間の光強度が24時間必要である。
機械的な力の負荷の他の形態に拡張するために、機械はまた、将来的に雨や風の影響を模倣するために、水を散水ノズルや風の送風機で変更することができます。
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概要
この研究は、植物のシグナル形態形成を探索するために人間の毛髪ブラシとロボットアームを利用した自動タッチ力装置を提示します。この装置は植物に均一なタッチ力を適用することを可能にし、手動方式と比較して効率を大幅に向上させます。
主要な研究構成要素
研究領域
- 植物のシグナリングと反応
- 生物学研究における自動化
- 効率的な植物処理手法
背景
- 植物にタッチ力を適用する従来の方式は、労働集約的で時間がかかります。
- ロボットシステムの開発により、実験の一貫性と速度を向上させることができます。
- この研究は自動化を通じて機械的刺激に対する植物の反応を改善することを目指しています。
使用された方法
- 一貫した力の適用のための人間の毛髪ブラシを用いたロボットタッチ力装置の開発。
- 発達段階のArabidopsis植物に焦点を当てた研究。
- 技術的アプローチには、自動化されたタッチサイクルと制御された環境条件が含まれます。
主要な結果
- 自動化されたシステムは、手動適用と比較可能なタッチ力を提供します。
- 処理時間と植物の反応集団の両方で効率の改善が見られました。
- 実装の成功により、シグナリング変異体スクリーニングにおけるより広範な応用が示されました。
結論
- この研究は植物生理学研究におけるロボット自動化の有効性を強調しています。
- 発見は、機械化されたタッチが研究プロセスを大幅に効率化し、遺伝子およびシグナリング研究を支援することを示唆しています。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Automated mechanical stimulation platforms address bottlenecks in phenotypic screening for mechanotransduction pathways, enabling higher throughput and reproducibility in target validation studies. By reducing labor-intensive manual force application, the method supports scalable assessment of genetic mutants in mechanosensitive signaling networks. This positions the technology as a enabling tool for early discovery workflows focused on force-sensing mechanisms in model systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of touch-force signaling mutants such as MKK1 and MKK2 to clarify mechanistic roles in mechanotransduction.
- Operational Value: Provides repeatable, quantifiable touch-force application reducing variability from manual handling.
- Predictive Value: Supports phenotypic comparison of wild-type and mutant lines under standardized mechanical stress to de-risk target hypotheses.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable morphological outputs (e.g., rosette radius, bolting timing) for high-content phenotypic screening.
- Operational Value: Allows unlimited touch rounds with adjustable force strength, enabling dose-response-like experimental designs.
- Assay Readiness: Compatible with alternative touch materials (e.g., animal hair, silk) and environmental simulators (rain, wind) for assay flexibility.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links molecular mutants to organism-level phenotypic changes under mechanical stress, supporting pathway validation.
- Mechanistic De-risking: Enables statistical evaluation of touch response differences between genotypes, informing target confidence.
- Model Relevance: Uses Arabidopsis thaliana as a genetically tractable system to study conserved mechanosensitive signaling principles.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery pipelines by providing a standardized mechanical stimulus for phenotypic screening of signaling mutants prior to lead identification efforts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of kinase-dependent touch signaling pathways through controlled force application and phenotypic readouts.
- Screening: Enables reproducible, high-throughput touch-force delivery for mutant screening campaigns with measurable growth and developmental outputs.
- Analytics: Facilitates quantitative measurement of bolting delay, rosette area, and leaf length for statistical comparison across genotypes.
- Translational Research: Connects molecular phenotypes (e.g., MKK1/MKK2 mutants) to whole-plant mechanomorphogenic responses, supporting target validation.
- Enterprise Reuse: Platform design allows adaptation to other mechanical stimuli (wind, rain) and model systems, supporting cross-project utility.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in force-sensing pathways through standardized, repeatable phenotypic assays.
- Operational Value: Increases experimental throughput by reducing touch-force application time from hours to minutes per round.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision confidence in target validation by minimizing false positives from manual force variability.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of mechanosensitive targets based on reproducible phenotypic outcomes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant growth conditions, mechanical stimulation protocols, and image-based phenotyping.
- Needs robotic arm system, custom touch-material fixtures, and environmental control chambers for reproducible results.
- Demands standardization of touch force (1–2 mN), timing intervals, and environmental conditions across users and sites.
- Adaptation considerations include exchanging touch materials (hair, silk, cotton) and adding nozzles for rain/wind simulation.
- Practical limitations include dependency on consistent plant size and developmental stage for comparable touch response measurements.
