高スループット転送化学遺伝学の画面シロイヌナズナを行う液体処理ロボットの使用を最適化します。

このプロトコルの全体的な目標は、シロイヌナズナの実生でハイスループットのフォワード化学遺伝学スクリーニングを実施することです。この方法により、植物の生理機能に影響を与える新しい低分子を効率的かつ効果的に発見することができます。これらの発見は、細胞壁合成などの生理学的プロセスに関するさらなる研究の基盤を提供します。

この手法の主な利点は、数万の小分子を短時間でスクリーニングできることです。このプロトコルは、モデル植物種であるシロイヌナズナ向けに設計されていますが、昆虫、微生物、細胞培養などの他の生物にも簡単に適応できます。このプロトコルのアイデアを最初に思いついたのは、大学のゲノムセンターが余剰の液体処理ロボットの家を見つける必要があることを知ったときでした。

私たちはすぐにそれを彼らの手から取り除くことを志願しました。希釈ライブラリーとMultichannel Tip Wash Automated Labware PositionerまたはALPを、テキストプロトコールに記載されているように調製します。スタッカーカルーセルに取り付けられたスタッカー10を手動でロードします。

ホテルAからDでは、まずルーム1にAP96 P20ピペットチップを1箱セットセットします。次に、ルーム2から5に4枚の96ウェルVボトムプレートをロードし、2つの上部プレートには注文したライブラリからのストック濃度が含まれ、他の2つの下部プレートは空です。さらに、AP96 P20ピペットチップを1箱、ルームシックスにセットします。

部屋 7 から 9 に 4 枚の 96 ウェル V ボトムプレートをロードし、上の 2 つのプレートには注文したライブラリのストック濃度が含まれ、下の 2 つのプレートは空です。P3の貯水池に300ミリリットルの水、P7に300ミリリットルの70%エタノールバス、Tip Loader ALP、マルチチャンネルTip Wash ALPでデッキを設置します。リキッドハンドリングロボットの操作ソフトウェアを使用して、Stacker 10からAP96 P20ピペットチップを提示し、Tip Loader ALPに移動します。

ホテルAの部屋2を提示し、デッキ上の4つの96ウェルVボトムプレートすべてを分離し、下部の2つをP4とP8に、上部の2つをP5とP9に配置します。AP96 P20ピペットチップをTip Loader ALPで96チャンネル200マイクロリットルヘッドにロードします。300ミリリットルの貯水池から90マイクロリットルを吸引し、P4の96ウェルV底希釈プレートに分注します。P8のプレートに対して手順を繰り返します。P5上のケミカルライブラリープレートを15マイクロリットルを3回繰り返し吸引して分注することにより、混合します。さらに、P5のケミカルライブラリープレートから10マイクロリットルを吸引し、P4の希釈プレートに10マイクロリットルを分注します。50マイクロリットルを合計3回繰り返し吸引して分注することにより、プレートの溶液をP4で混合します。

混合したら、P7から70マイクロリットルの70%エタノールを吸引して分注してAP96 P20ピペットチップを洗浄し、110%容量の水を4回吸引して分注してマルチチャンネルチップウォッシュALPで洗浄します。P8 と P9 の 2 番目のプレート ペアに対して、これらの手順を繰り返します。2枚目の96ウェルV底希釈プレートを作成したら、P9、P5、P8、P4プレートを下から上に順番に積み重ねます。次に、スタックを 1 つの空の静的 ALP に配置します。

P1、P2、P6、P10、P11、P12、または P13 のいずれかを使用します。ホテルAの部屋5が空になるまでこれらの手順を繰り返し、部屋6に到達したらプロセスを再開し、新しいAP96 P20ピペットチップをTip Loader ALPに移動し、使用済みのAP96 P20ピペットチップを空の静的ALPに置きます。ホテルAの9号室が空になるまで、この手順を繰り返します。

ホテルBに進むためには、デッキ上のプレートとチップをホテルAにリロードする必要があります.ロボットは監視なしで作業できますが、各希釈サイクルの後に貯水池を補充する必要があります。水が不足している状態でサイクルが再開すると、ロボットは空気を吸引し、薬品は希釈されません。300ミリリットルの貯水池を手動で補充します。

コンピュータプログラムは、このメッセージを詳述する一時停止を組み込むことができ、ユーザーは次のステップを実行する前に「続行」を押す必要があります。残りの 3 つのホテルについて、希釈手順を繰り返します。100ミリリットルあたり0.1グラムの密度で培地に種子を手動で追加します。

この密度により、96ウェルプレートのウェルあたり平均3〜10個のシードが得られます。AP96 P250ピペットチップの箱をTip Loader ALPに、300ミリリットルのリザーバーに培地種子混合物を充填し、300ミリリットルのリザーバーをP7に70%エタノールを充填して、ホテルAの部屋1と2に4つの96ウェル平底プレートを手動で配置します。オペレーティングソフトウェアを使用して、ホテルAの部屋1と2を表示し、4つのプレートのスタックを分離します。空の静的ALPのそれぞれにプレートを1つずつ置き、AP96 P250ピペットチップを96チャンネルの200マイクロリットルヘッドにロードします。

P3の300ミリリットルの培地種子リザーバーから90マイクロリットルを吸引し、最初の96ウェル平底プレートに分注します。8つのプレートすべてに培地と種子の混合物が含まれるまで、このプロセスを繰り返します。P70に70%エタノールを充填した300ミリリットルのリザーバーから70マイクロリットルを吸引して分注することにより、AP96 P250ピペットチップを清掃します。マルチチャンネルチップウォッシュALPで110%の水を4回吸引して分注し、チップをTL1でアンロードしてチップを洗浄します。

最後に、プレートを手で集めます。AP96 P250ピペットチップの箱をホテルAの部屋1に手動でロードし、また、2つの96ウェルV底希釈ライブラリープレートをルーム2、4、6、および8にロードします。2枚の96ウェル平底スクリーニングプレートをルーム3、5、7、9にセットします。

オペレーティングソフトウェアを使用して、P300に70%エタノールの7ミリリットルのウォッシュリザーバーが含まれるようにデッキを構成します。培地シードリザーバーは、P3のデッキに残すことができます。さらに、デバイスコントローラーの接続を介してコンソールドライブの電源を入れ、マルチチャネルTip WashALPを介して水を循環させます。これは、プロトコルの終了時に自動的にオフになります。ホテルAからAP96 P250ピペットチップボックスを提示し、Tip Loader ALPに移動します。

次に、ホテルAの部屋2から96ウェルV底希釈ライブラリープレートをデッキに提示します。静的ALP P4に1つのプレートを置き、P8に1つのプレートを置きます。次に、ホテルAの部屋3にある96ウェル平底スクリーニングプレートをデッキに提示します。1つのプレートを静的ALP P5に、もう1つのプレートをP9に置きます。AP96 P250ピペットチップをTip Loader ALPとともに96チャンネル200マイクロリットルヘッドにロードします。

96ウェルV底希釈プレートをP4に混合し、50マイクロリットルを3回吸引して分注します。その後、このプレートから10マイクロリットルを吸引し、P5の96ウェル平底スクリーニングプレートに分注します。P5でプレート内の溶液を50マイクロリットルを3回吸引して分注することにより混合します。AP96 P250ピペットチップをエタノールで洗浄し、P7のリザーバーから70マイクロリットルの70%エタノールを吸引して分注します。次に、Multichannel Tip Wash ALPで110%の水を4回吸引して分注することにより、チップを洗浄します。

2 枚目の 96 ウェル V 底希釈ライブラリープレートと 96 ウェル平底スクリーニングプレートについて、これらの手順を繰り返します。2枚の96ウェルV底希釈ライブラリープレートを積み重ね、2枚の96ウェル平底スクリーニングプレートを積み重ねます。プレートを静的ALPに移動します。

次に、このプロセスを3回繰り返し、希釈した薬品をスクリーニングプレートに合計8回加えます。最後に、スクリーニングプレートの各ウェルのシード数を目視で確認します。滅菌および春化した種子を追加して、3つ未満の種子で井戸を補います。

苗が成長している培地が乾燥しないようにすることが重要です。これは発芽不良につながるためです。苗木が入ったプレートは、高湿度に保管するか、乾燥に強い容器に保管する必要があります。96ウェル平底スクリーニングプレートを、22°Cの環境チャンバー内で4日間インキュベートし、乾燥防止容器内の16/8の明暗サイクルでインキュベートします。

96ウェル平底スクリーニングプレートを解剖顕微鏡で可視化し、すべての異常な表現型を記録してさらなる調査を行います。正常な表現型と異常な表現型の例は、目に見える形態学的異常がない、茶色の根毛、発育不全の根、重度の発育不全の根、漂白、緑色の粘液、不完全な発芽、および発芽がないことです。パーセンテージで表示される表現型は、円グラフで表示されます。

実生は根の形態、色素沈着、根毛、発芽に異常が認められた。また、緑色の粘液の生産を含む他のさまざまなものも含まれています。この手法を習得すると、大規模なフォワードケミカル遺伝学的スクリーニングの効率と精度を大幅に向上させることができます。

この手順を試行する際は、種子の滅菌と春化、希釈ステップ中の貯水池の補充、サンプルが乾燥しにくい容器に保管されていること、およびすべてのイメージングが平底プレートで行われることを覚えておくことが重要です。調査したい生理学的プロセスに応じて、この初期スクリーニングをフォローアップして、各化学物質の作用機序を決定するのに役立つ追加のアッセイを行うことができます。このビデオを見れば、リキッドハンドリングロボットを使用して化学遺伝子スクリーニングの効率と精度を向上させる方法について十分に理解できるはずです。