高スループット シロイヌナズナ種子の殺菌のための標準化された方法

この手順の全体的な目標は、微生物の増殖を防ぎながら、多数のシロイヌナズナの遺伝子型の種子滅菌を成功させるための標準化された条件を提供することです。この方法により、一度に数百の種子サンプルを滅菌できるため、ゲノミクス、プロテオミクス、メタボロミクス、その他のハイスループット研究の分野で重要な植物材料調製ステップが簡素化されます。この技術の主な利点は、効率的な滅菌と多数の種子サンプルに対する高い発芽率が組み合わされる条件を提供することです。

まず、蒸留水で50%漂白剤溶液を準備します。漂白剤溶液200ミリリットルごとに、50マイクロリットルのTWEEN 20洗剤を追加します。漂白剤溶液は、無菌状態でのみ開封されている限り、最大1か月間保存できます。

次に、100個の種子を1.5ミリリットルの微量遠心チューブに分注します。これは、手動で行うことも、カスタムメイドのシードロボットを使用して行うこともできます。次に、層流フードで、500マイクロリットルの50%漂白剤溶液を種子に加えます。

次に、チューブをローテーターに移し、種子を漂白剤で10分間穏やかに攪拌しながらインキュベートします。10分後、チューブから漂白剤溶液を吸引し、できるだけ取り除きます。次に、500マイクロリットルの滅菌蒸留水を再度加え、チューブを反転させて混合します。

種子が落ち着くのを待ってから、水を吸引し、別のアリコートと交換して種子を再度洗います。滅菌した蒸留水で合計6回の洗浄を行います。種子を水で十分に洗浄したら、1ミリリットルの水に懸濁してからメッキします。

滅菌プロセスを開始する前に、塩素ガスを生成するために必要な漂白剤と塩酸の量を計算してください。提供された式を使用して、推奨される6%塩素ガスを取得します。滅菌を成功させ、飛散を防ぐために必要なHClの量を正確に計算してください。

このプロトコルでは、必ず手袋と白衣を着用し、酸や漂白剤で濡らされたときは必ず手袋を交換してください。ドラフトの下で、種子バイアルを蓋を開けた状態でラックに移します。次に、滅菌を行うことができるプラスチック容器にラックを置き、蓋を容器に密封するためのパラフィンフィルムストリップを準備します。

次に、ビーカーに100ミリリットルの漂白剤をロードしてから、250ミリリットルのビーカーを中に入れます。漂白剤を過剰に使用することは安全上の特徴であり、ビーカーはそれに含まれる溶液の総体積の少なくとも2倍である必要があります。また、漂白剤と酸は常に別々に取り扱ってください。

次に、ビーカーに3ミリリットルの塩酸を加え、すぐに容器を閉じてパラフィルムで密封します。滅菌中にガスが蓄積していることを確認するために、容器を1時間監視します。塩素ガスは、容器内のかすかな黄色のもやとして見えるか、溶液が黄色に変わるかどうかを確認できます。

容器のシールを定期的に確認してください。蓋が外れたり、パラフィンシールが緩み始めた場合は、パラフィンフィルムの追加層で蓋をしっかりと再シールします。1時間の滅菌後、容器の角を開けて3時間かけてガスを排出します。

3時間の通気後、すべてのチューブにキャップをし、滅菌した種子をメッキするまで乾燥状態で保管します。次に、ガラス棒で攪拌しながら1.5グラムの重曹粉末をゆっくりと加えて固体を溶解することにより、反応を中和します。炭酸ガスの泡の形成が止まるまで、重曹を加え続けます。

次に、溶液のpHを測定し、必要に応じて、pHが中性になるまで重炭酸ナトリウムを追加します。溶液が臭くなければ、廃棄できます。それ以外の場合は、すべての臭いが消えるまで待ちます。

ガス滅菌種子の各チューブに500マイクロリットルの滅菌蒸留水を追加します。次に、種子をMSプレートに注ぎ、滅菌された単回使用の接種ループまたは滅菌ピペットチップを使用して均等に広げます。摂氏4度で種子の層別化を3日間行った後、プレートを摂氏23度に移し、毎日16時間の光にさらされます。

根が培地に成長するように、蓋を上に置いておきます。成長の8日後、発芽した種子の割合をスコアリングします。発芽は、ラジカルが種皮の外側に突出し、2つの子葉が見えるときにカウントされます。

また、カビの影響を受けた種子の数を数え、滅菌条件の有効性を判断します。5つの異なる曝露時間での4つの異なる濃度の漂白剤を、コロンビアの野生型種子で試験しました。漂白剤濃度が高いと、曝露が多すぎると発芽に悪影響を及ぼしました。

しかし、すべての曝露時間で40%と50%の漂白剤で高い発芽率が観察されました。高濃度の漂白剤で滅菌された種子は死亡率が高く、しばしば成長欠陥を示しましたが、通常は完全にカビが生えていませんでした。50%漂白剤による10分間の滅菌は、カビ抑制と健康な発芽の最適なバランスを有することが決定された。

塩素ガスの滅菌条件を最適化するために、3つの異なる濃度の塩素ガスを使用して、コロンビア野生型種子を2つの異なる時間にわたって滅菌しました。時間とガス濃度の間には有意な相互作用がありました。1時間では発芽に影響はなかったが、最大ガス濃度では3時間で有害であった。

したがって、1時間の滅菌期間が選択されました。カビの成長は、3時間のガス曝露または6または17%ガスを使用した1時間の曝露によって効果的に抑制されました。したがって、1時間の6%ガス濃度が発芽とカビ抑制に最適であると判断されました。

この手法を習得すると、適切に実行されれば、1日あたり数百の種子系統を成功裏に滅菌するために使用できます。ガス滅菌された種子は、乾燥した状態で長期間保存することもできます。この手順を試行する際は、提供された方程式を使用してHClと漂白剤の必要量を計算することを忘れないでください。

この手順に続いて、ゲノムワイド関連研究などの他の方法を実行して、さまざまな異なる遺伝子型と目的の表現型を関連付けることができます。あなたの実験に頑張ってください。