Name: 高スループット シロイヌナズナ種子の殺菌のための標準化された方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: 学ぶ シロイヌナズナ種子の高スループット殺菌法。50%次亜塩素酸ナトリウム溶液または6%塩素ガスを用いて数百の系統を同時に処理し、微生物汚染を防ぎながら高い発芽率を確保する標準化されたプロトコルです。

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実験材料の準備で彼女の援助の Gauri ダッタに感謝したいと思います。また、原稿の批判的検討のベッティーナ郷土料理とジェームス ・ マンに感謝しております。この作品は、NSF の補助金 DBI 1049341 と MCB 1143813 によって支持されました。

1。 培地、培 (MS) 媒体 x 1 の準備 0.8 L 蒸留水と溶解する攪拌を含むビーカーに <ol><li>追加 4.31 g MS 基底の塩の混合物、10 g ショ糖と 2-(N-Morpholino) ethanesulfonic の 0.5 g の酸 (MES)。チェックし、1 M 水酸化カリウム (KOH) を用いた 5.7 に pH を調整します。追加蒸留水 1 l.</li>
	<li>は、2 つの 1 L ボトル 500 mL にメディアを分割します。それぞれのボトルに寒天 5 g を追加します。蓋が緩い保つ</li>。
	<li>121 ° c、15 psi 電磁攪拌棒瓶の中で 20 分間オートクレーブします</li>。
	<li>、オートクレーブから出した後低速で攪拌板にボトルを配置し、MS 培地 (ボトルが素手で実施される) まで 45-50 ° C に冷却するを許可します</li>。
	<li>この手順から始まって、層流フードの無菌状態ですべての手順を実行します。500 μ l 添加 Gamborg ' s ボトル各ビタミン ソリューションを均等に分散させる MS 培地を攪拌しビタミン ソリューションです</li>。
	<li>プレート約奥行きの板の半分をカバーするために十分なメディアを注ぐ</li>。
	<li>寒天を固めるように約 1 時間室温で冷却するプレートを許可します 。
	注: プレートは、すぐに使用することが、プラスチックでそれらをラップし、4 ° C (冷蔵庫温度) で格納します。カバー プレート、ボックス、または凝固寒天管気密の容器で 4 ° C で数週間のため格納できます</li>。
</ol> 2。漂白剤とシロイヌナズナ種子の滅菌 <ol><li>プロトコルのセクション 1 に従って準備 MS プレート。オートクレーブの MS メディアとして同時に蒸留水 100 mL。これを使用後に洗浄水と種を中断させてめっきで支援するために. 
	注: 必要な場合 0.8% 寒天ブレンド (w/v) (例えば phytagar) することができますこの手順でオートクレーブ。寒天のブレンドは、めっき中に蒸留水を置き換えることができます (ステップ 2.5.3。)。寒天のブレンドの余分な粘度やすくプレートや植物の種子をスペース行で必要に応じてします</li>。
	<li>準備 50% (v/v) は、種子を殺菌するためのソリューションを漂白剤します。漂白剤を希釈して 100 mL の蒸留水に漂白剤 100 mL を追加します。漂白剤溶液にトゥイーン 20 洗剤の 50 μ L を追加します 。
	注: 準備された漂白剤の解決に格納できる限り無菌状態で開くのみ月まで</li>。
	<li>1.5 mL 遠心チューブに分注 100 種</li>。
	<li>50% の漂白剤溶液を用いた種子を滅菌します。
	<ol><li>層流フードの種子を含む遠心チューブに 50% 漂白液 500 μ L を追加。漂白剤溶液で種子を中断するチューブの下端をタップします 。
		注: また、回転子またはプラットフォーム シェーカー可能性があります使用する中断された種子を維持する</li>。
	</ol></li> <li>チューブから漂白液をリンスします。
	<ol><li>10 分後ピペットまたは端にピペット チップ装備アスピレーターを使用して遠心チューブから漂白剤溶液を削除します</li>。
		<li>チューブの滅菌蒸留水の追加 500 μ L。チューブを閉じ、ミックスに反転します。管の底に沈殿するための種子を許可します。種子はチューブの底に落ち着いて慎重に一度は、ピペッティングにより漂白剤溶液を削除します。洗浄プロセス 6 回この手順を繰り返します</li>。
		<li>種子を中断する管にオートクレーブ蒸留水 1 mL を追加します</li>。
	</ol></li> <li>MS プレート滅菌種子をプレートします。
	<ol><li>層流フードの銘柄名と現在の日付と MS 板の下部のラベルします</li>。
		<li>は、MS プレート遠心チューブから種を注ぐ。滅菌、使い捨ての接種ループまたは滅菌ピペット チップを使用して MS 平板まわりの種を広めるためです 。
		注: 行にまかれた種が、先端が 200 μ L ピペットが個別に種子を目的の位置に配置する使用ことができます。種の流れを高めるためには、ピペット チップの終わりははさみを使用して 3 〜 5 mm でトリミングことができます。任意の見当違い種子や種のクラスター、位置を変更することができますまたは滅菌の単回使用接種ループを使用して分離します</li>。
		<li>はの後ろで MS プレートを置き、蓋を半分閉めた状態層流フードの。MS プレートから蒸発する水分をできるようにします</li>。
		<li>は、MS プレートに蓋を配置します。シール用紙多孔手術でプレートをラップすることにより MS 板テープ (材料の表 を参照してください).</li>
	</ol></li></ol> 3。塩素ガスによるシロイヌナズナ種子の滅菌 <ol><li>プロトコルのセクション 1 に従って準備 MS プレート。オートクレーブの MS メディアとして同時に蒸留水 100 mLこれは、めっきで支援するために種子を中断する後で使用されます 。
	注: 必要な場合 0.8% 寒天ブレンド (w/v) (例えば phytagar) することができますこの手順でオートクレーブ。寒天のブレンドは、めっき中に蒸留水を置き換えることができます (ステップ 3.6.2。)。寒天のブレンドの余分な粘度やすくプレートや植物の種子をスペース行で必要に応じてします</li>。
	<li>滅菌を開始、する前に漂白剤と塩酸 (HCl) の塩素ガスを作り出すために必要な金額を計算します。
	<ol><li>6.1% Cl 2 滅菌に必要なを生成する必要がある塩酸の量を計算します</li>。
		<li>は、次の数式を使用して: 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56587/56587eq1.jpg"> 滅菌コンテナーのボリュームとして 7,000 mL と 6.1% Cl 2 として塩酸の量は、3 mL に計算されます 。
		注: コンテナーと % の Cl 2 の別のボリュームの計算を実行するようにプログラム スプレッドシートは、補足表 1 として提供されます</li>。
	</ol></li> <li>0.5 mL 遠心チューブに分注 100 種。各バイアルのキャップを閉じて、プラスチック ラックにバイアルを配置、脇を設定します 。
	注: 種子は適切な条件に格納されている限り、この時点で時間の長時間にわたって格納できます。保管条件は、リベロや同僚 4 プロトコルのセクション 3.3.2 で見つけることが。96 ウェル プレート形式も使用できます</li>。
	<li>塩素ガス滅菌に必要な材料を準備します。
	<ol><li>漂白剤と塩酸をそれらの格納場所から取得します</li>。
		<li>カット手順 3.5.3 で使用する大規模なパラフィンのストリップ映画 (材料の表 を参照してください). 滅菌コンテナーのシールにします</li>。
		<li>は、滅菌が発煙のフードの中の場所を取る、ふた付きのプラスチックの容器を置きます。すべての種子のバイアルのキャップを開くし、プラスチック コンテナー内種全体ラックを置きします</li>。
	</ol></li> <li>室温で塩素ガス滅菌を行う 。
	注意: 漂白剤と酸を分離して使用します。流出のリスクを軽減する上限なしいずれかのボトルを放置しないでください。手袋、白衣など適切な個人用保護具 (PPE) を使用します。漂白剤や酸は、手袋にはね、他の材料を処理する前に手袋を変更します。漂白剤や酸汚染の場合発煙のフードで手袋を必ず取り外してください。
	<ol><li>コンテナー内の 250 mL のビーカーを置き漂白剤 100 mL を追加します 。
		注: HCl と漂白剤の反応には、漂白剤の少なくとも 22 ボリューム過剰が必要です。反応は、HCl を消費し、副産物として水と塩化ナトリウム (NaCl) の Cl 2 ガスを解放することによって漂白剤します。大過剰の漂白剤を使用すると、追加の HCl d の消費処分のためのソリューションを中和するために必要な時 (NaHCO 3) 炭酸水素ナトリウムの量を減らすガス抜き期間 。
		注意: ビーカーは漂白剤 + HCl の総液量の少なくとも 2 倍にする必要があります。これは種子をダメージ、漂白剤衣服や露出した皮膚に書き込む次のステップ中にビーカーをエスケープ水しぶきを防ぐことができます</li>。
		<li>は、漂白剤を含むビーカーに塩酸 3 mL を追加します 。
		注意: 最初の反応ガス濃度 6.1% 以上で特に気泡が生成されます。長袖の白衣はこの手順が必要です</li>。
		<li>滅菌コンテナーを閉じるし、すぐにパラフィン フィルムでそれを封印します</li>。
		<li>ガスの蓄積を確実に滅菌時の滅菌コンテナーの監視; 塩素ガスの蓄積はコンテナーの中のかすかな黄色煙霧として表示する必要があります 。
		注意: 定期的にチェックの中の圧力が蓋を落選しないように滅菌コンテナーまたはパラフィン フィルム。蓋が空いている来ているパラフィン フィルムが緩んでいる場合、蓋を閉めるし、慎重にパラフィン フィルムのレイヤーが追加されたコンテナーをラップします</li>。
		<li>後の 1 h 滅菌はパラフィン フィルムを取り外して、1 つのコーナーのカバーを開く期間、コンテナーを開きます。反応を完了させるし、塩素ガスを排除するため 3 時間を発散するコンテナーを許可します</li>。
		<li>シード ラックですべての遠心チューブのキャップを閉じます 。
		注: 滅菌種子は乾燥した状態で格納されている限り、めっき時間まで格納できます</li>。
		<li>シード ラックを削除し、層流フード</li>。
		<li>は塩素ガス反応 <ol><li>追加 1.5 g NaHCO 3 粉末漂白剤/塩酸溶液を含むビーカーにゆっくりを中和し、ソリューションに NaHCO 3 を分解するガラス棒でかき混ぜます。二酸化炭素 (CO 2) 気泡が形成を停止するまで NaHCO 3 の追加を続行します 。
			注意: 追加の飛散を防ぐためにゆっくりと。手袋、白衣など適切な PPE を使用します</li>。
			<li>テストの pH ストリップまたは pH メーターを使用して、ソリューションの pH。溶液の pH まで必要がニュートラルの場合追加 NaHCO 3 を追加 (pH 7.0)。ソリューションがヒューム フードから削除され、すべての該当する処分ガイドラインに従って処分この時点 。
			警告: 処理中に任意のにおいを気づいた場合、ソリューション必要がありますすぐに返されヒューム フード</li>。
		</ol></li></ol></li> <li>MS プレート滅菌種子をプレートします。
	<ol><li>層流フードの銘柄名と現在の日付と MS 板の下部のラベルします</li>。
		<li>種子を中断する各微量遠心チューブの滅菌蒸留水の追加 500 μ L。MS のプレート上に種子を注ぎ、滅菌、使い捨ての接種ループまたは滅菌ピペット チップを使用してプレート全体に均一に種子を広げ</li>。
		<li>はの後ろで MS プレートを置き、蓋を半分閉めた状態層流フードの。MS プレートから蒸発する水分をできるようにします</li>。
		<li>は、MS プレートに蓋を配置します。多孔質紙サージカル テープでプレートをラップすることにより MS プレートをシールします</li>。
	</ol></li></ol> 4。MS 板でシロイヌナズナの成長 <ol><li>は 4 ° C、湿度で 3 日間の上ふた付きプレートを配置します 。
	注: このプロセスは階層と呼ばれる、個々 の種子の発芽を同期するを提供しています</li>。
	<li>プレートを生育環境に転送します。
	<ol><li>23 ° C で維持温度および光 120-150 µmol/m 2 s 16 h 光/暗い 8 h で日長。培地に根が育つので、上部のふたの育てる環境にフラット プレートを配置します</li>。
	</ol></li> <li>プレートの苗は、8 日間の成長させ 。
	メモ: 8 日間成長は遅く発芽する種子の発芽できます。すべての種子が発芽した場合 8 日より早くプレートを獲得することができます</li>。
	<li>発芽率をスコアします。
	<ol><li>レコード発芽して、芽が種子の数。発芽率を計算する種子の発芽数を割る皿の上の種の合計数で 。
		メモ: 発芽幼根が種皮外投影は、2 個の子葉が表示されるときに数えられます</li>。
		<li>も種子滅菌条件の有効性を判断する型によって影響を受けるの数をカウントします</li>。
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

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シロイヌナズナ種子滅菌メディアに成長している、殺菌のいくつかのフォームが適用されなければなりません。漂白剤や塩素のガス殺菌処置は、似たような発芽率と金型生長阻害の結果します。どちらも殺菌法ポテンシャル高い発芽と種子の発芽率の重要な減少を原因します。ただし、漂白殺菌は低い発芽電位 (20-70%)、小型のためラインの推奨とはいえ非重要、(図 3 a) ガス殺菌に比べて発芽率の向上。
10 分の 40-100% から漂白剤濃度とシロイヌナズナの種子を滅菌良好な発芽率および効果的なカビ抑制を提供します。ただし、漂白剤濃度が 40% 未満の場合 40% の濃度またはも重く汚染された種子の多くの高い保証の効果的な滅菌を使用してほとんどの種子ロットのため十分な滅菌を提供します。死亡率高い種子種苗開発の欠陥を避けるために 80% 以上の漂白剤濃度等を使用する場合、滅菌の 10 分を超えることが重要です。
6.1% または高発芽率および十分なカビ除去の 1 h の結果の 16.5% の塩素ガス濃度とシロイヌナズナの種子を扱います。低塩素ガス濃度 (2.1%) は、3 h に殺菌の持続時間を増やすことで正常に使用できます。
数行を滅菌する場合、10 分の 50% の漂白剤の解決策で液体殺菌をお勧めします。以来、行数が少ない操作で迅速かつ容易に滅菌することがラインの大きい数のため 1 時間 6.1% のガス濃度とガス滅菌は良いオプションです。
我々 の結果は、異なる遺伝子型の種子の数が多いと潜在的な低い発芽と種子を殺菌する為の標準化された条件を提供します。これらの滅菌技術の唯一の制限は種子発芽率により広範な種の死亡率 20% 未満に適用できません。超音波処理など17滅菌の不在で発芽率を高めるための代替方法は、これらのケースで有益かもしれない。

シロイヌナズナ(シロイヌナズナ) は植物生物学1,2,3の基礎・応用研究のプライム モデル生物です。シロイヌナズナ成長のための標準条件は、よく確立された4をされているが、種子の生存率に種子殺菌効果は厳しくテストされていません。板やボックスで固体媒体は分離の人口での初期のシュートと根の表現型の観察でホモ接合体致死突然変異体の同定など、多くの実験的アプリケーション シロイヌナズナ実生植物の成長を促進する使用します。無料の病原体組織、苗の組織、発芽1,2,3,4 を形質転換体や薬剤耐性植物の選択および評価の大量のコレクションの分離の段階.温室で育つ植物から採取した種子または成長室が時折微生物やほこりで汚染されました。滅菌メディアのさまざまな種類のシロイヌナズナの幼植物の生育には、菌など細菌の種の表面に微生物汚染物質を除去する前の種子滅菌が必要です。効果的な種子滅菌政権の使用は、高発芽、最小の汚染と活発な植物成長のバランスにとって重要です。
シロイヌナズナ種子の殺菌のために使用される 2 つの最も一般的な方法は、市販の漂白剤 (液相)、塩素ガス (気相) に基づいています。両方液相滅菌1,4,5,6,7,8,9のさまざまな手順が採用されています。,10と気相滅菌シロイヌナズナの種子8,10、11,12,13,14,15 、16。ただし、これらのプロシージャは利用の遺伝子型の種子滅菌を達成するために効果的なされている、異なった遺伝子型の種で異なる殺菌治療の効果の詳細に分析しない報告されています。したがって、効率的な殺菌は高い発芽率と組み合わされ条件を定義するこれらの滅菌手順の最適化が必要です。
A) 内部的に適用する品質管理手順のコレクションと b) 利用で、ユーザーからのフィードバックに応えてさまざまな異なった遺伝子型の種子の生存率をテストするのには、シロイヌナズナ生物学的リソース センター (ABRC) も地の利種子の発芽についてここで示した実験の目的は、シロイヌナズナの範囲の遺伝子型の種子発芽に及ぼす様々 な滅菌方法を決定するあった。漂白剤や塩素のガス殺菌のため最小限の病原体汚染を維持しながら高い種子の発芽率は、最適化された滅菌の手順が掲載されています。

高スループット シロイヌナズナ種子の殺菌のための標準化された方法

Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

シロイヌナズナ(シロイヌナズナ) 苗は、しばしば無菌メディア上に成長させる必要があります。微生物汚染種子表面に存在の成長を防ぐために事前の種子滅菌が必要です。シロイヌナズナの種子を殺菌する現在、ラボで若干異なります、標準化されていない条件で 2 つの異なる殺菌技術を使用して、しばしばのみ部分的に効果的な滅菌や過剰シード死亡率の結果します。これらのメソッドのほとんどはまた多数の多様な品種の種子のラインへの拡張が容易ではありません。シロイヌナズナの高スループット分析のための技術が増殖するのにつれ、多数の異なった遺伝子型の種子を殺菌する為の標準化された技術はこれらのタイプの実験を行うために不可欠になっています。シロイヌナズナ行数の 2 つの異なる殺菌手法への応答は、発芽率および種子混入微生物や他の病原体のレベルに基づいて評価されました。治療には、滅菌剤とシロイヌナズナ種子の殺菌のための最適条件を決定するために結合、露出回数の異なる濃度が含まれています。最適化されたプロトコルは、2 つの異なる滅菌法の開発されている: 漂白剤 (液相) と塩素 (Cl2) ガス (気相)、発芽率の高い種子と最小限の微生物汚染の両方の結果します。これらのプロトコルのユーティリティは、発芽電位の範囲で野生型と変異種の両方のテストによって示されました。その種子滅菌することが効果的に過剰な種子死亡なしのいずれかの方法を使用してがより最適な発芽の可能性も低い種子の殺菌の弊害がみが分かった。さらに、数式は気密の容器のサイズが異なるに標準化された塩素ガス滅菌条件を適用する研究者を有効に開発されました。ここで説明したプロトコルでは、シロイヌナズナの線の数が多いため簡単に、効率的かつ安価な種子殺菌を許可します。

オープン フィールド、温室効果や成長室から採集されたシロイヌナズナ種子は、カビや細菌の1,4のような様々 な微生物によって汚染されて時。したがって、種子供給が限られている場合は特に、生殖不能メディアに及ぼす発芽、特にプレートの汚染のために挑戦されます。結果を以下に示します、漂白剤や塩素のガス殺菌のための最適化されたプロトコルはこの問題を最小限に抑え、高スループットのアプリケーションに必要な種子の生存率が維持されます。
シロイヌナズナ Col 0 種子の発芽に漂白剤殺菌処理の影響
漂白剤は、最も一般的に使用される多数の植物で種子殺菌剤です。滅菌剤と露光時間の最適な濃度は、種によって異なります。シロイヌナズナの種子1,4,5,6,7,8,9の殺菌のため漂白剤を使用してプロトコル数を採用されています。,10. 4 濃度の異なる期間がテストされた 5 つの異なる露光時間で漂白剤と結果がで表示されます図 1。治療は、コロンビア野生型 (コル-0) 種に適用されました。漂白剤濃度と殺菌の時間の間の重要な相互作用によって示されているように、殺菌の時間に応じて様々 な漂白剤濃度 Col 0 種子の発芽に及ぼす影響 (図 1、 P &lt; 0.001、分散-分散分析)。
5 〜 10 分間滅菌時間と実験、すべて漂白剤濃度の処理結果 Col 0 種子 (図 1) の同様に高い発芽率。高発芽率は 40% と 50% の世帯の漂白剤濃度の常時殺菌のも認められました。80% と 100% の漂白剤とトリートメント 10 分よりも長い期間が大幅に結果の増減浸漬時間の短縮と比較して発芽率 (P &lt; 0.01, ANOVA)。さらに、80%、100%、20 分のトリートメントを漂白剤の発芽は低下した適切な 40% および 50% の漂白剤の治療法と比較して (P &lt; 0.001、ANOVA)。
種子には、漂白や shriveling 高い漂白剤濃度 15 分以上を使用するときのさまざまなレベルが表示されます。さらに比較的高 (最大 32%) 種子死亡、発達の停止の結果として頻繁の子葉と胚軸伸長、展開し失敗に反映成長欠陥を示したこれらの条件で滅菌発芽。ほとんどの治療 (14 のうち 20) 完全にあった金型フリー、全体的な金型レベル平均 0.21% ± 0.003 の (表 1) の結果します。
50% の漂白剤と 10 分間の浸漬時間による治療は、表面の病原体成長の抑制が良い高発芽率が低下するため、最高の滅菌体制として選ばれました。この治療法は、以下のように異なる突然変異系統の漂白殺菌効果をテストに選ばれました。
Col 0 種子の発芽に対する塩素ガス殺菌処理の影響
塩素ガス滅菌条件を最適化するには、(表 2) の 2 つの期間の Col 0 種子を殺菌する塩素ガスの 3 つの異なる濃度が使用されました。ガス濃度は濃塩酸の量、次の方程式を使用して滅菌コンテナー量に基づいて計算されます。
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56587/56587eq2.jpg">
この方程式は、12.3 M HCl、23 ° C の温度、標準気圧 101.3 kPa の理想気体の法則を使用して派生しました。
時間と集中係数との間の重要な相互作用によって示されるように、殺菌の時間に依存する Col 0 種子の発芽に対する塩素ガス濃度の効果を示した (図 2 a、 P &lt; 0.01, ANOVA).塩素ガス濃度 1 時間殺菌を受ける Col 0 種子の発芽に影響がなかった。この滅菌時間、塩素ガスの濃度をすべて推進同様に高レベルの 85% 以上の発芽 (P &gt; 0.05、ANOVA)。その一方で、3 h の長い殺菌結果 2 つの低いガス濃度と比較して塩素ガスの最高濃度の発芽率が大幅に低下 (P &lt; 0.05、ANOVA)。シロイヌナズナ種子、1 時間テストされた塩素ガス濃度のいずれか、3 h の 16.5% 以下のガス濃度のトリートメントが発芽率が大きい常にので、種子の生存を維持する均等に有効であることが示唆します。82%。しかし、16.5% のガスで 3 h のための種子を滅菌は種子の発芽に支障をきたす。
カビの発生率は、ガス濃度と曝露時間に依存しても。カビの生育は 3 時間 (図 2 b) すべてのガスの濃度と 1 h 長期治療のための 6.1%、16.5% の塩素ガスの比較的高濃度で効果的に抑制されました。
これらの結果に基づき、1 h (表 2) の 6.1% のガス濃度と治療選択された最高の気相滅菌条件としてそれ結合高発芽率 (ので別の突然変異系統のガス殺菌効果をテストするのには85%) カビ汚染 (0.02%) の非常に低いレベルで。
潜在的な別の発芽種子に漂白剤や塩素ガス殺菌処理の影響
統計分析は滅菌方法発芽応答が行の発芽の可能性に依存していたことを示した (図 3 a、 P &lt; 0.01, ANOVA)。漂白剤も塩素のガス滅菌は、高発芽潜在的な (グループ 4 および 5) 種子の発芽率を減少します。どちらの治療が最低の発芽とグループの既に低発芽率に及ぼす影響可能性 (グループ 1)。対照的に、塩素ガス滅菌は約 12-18% の大幅な削減結果 (P &lt; 0.01, ANOVA) 発芽の可能性 (グループ 2 および 3) 種子の発芽。漂白殺菌も発芽率 13% 減のグループ 2、グループ 3 の発芽率は減少しなかった。発芽・ グループのガス治療漂白剤と塩素の発芽率に有意差はない (図 3 a、 P &gt; 0.442, ANOVA)、種子殺菌漂白剤を使用したやや高いがガス滅菌の種子発芽のすべてのグループでより発芽率。
滅菌処置が大幅に変更 (P &lt; 0.001、ANOVA) 金型 (図 3 b) により影響を受ける種の割合。両方の塩素ガスと漂白剤の殺菌が少ないカビで起因した (P &lt; 0.05、ANOVA) ない殺菌と比較して。グループのガスと漂白剤の殺菌の間検出金型レベルで差はありませんでした (図 3 b、 P &gt; 0.4 ANOVA)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56587/56587fig1.jpg"> 
図 1: シロイヌナズナ Col 0 種子の発芽に及ぼす漂白剤濃度と殺菌時間。値は、平均 ± SD 実験 5 独立したレプリケーションから得られます。* 漂白剤濃度の範囲のデュレーションを浸漬 5 分を基準にして有意差を示す (P &lt; 0.01, ANOVA)。#80%、40%、20 分の 50% を基準にして 100% の漂白剤の濃度の差を示す期間 (P &lt; 0.01, ANOVA)。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56587/56587fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56587/56587fig2.jpg"> 
図 2: 塩素の効果ガス濃度と殺菌時間シロイヌナズナ Col 0 種。(A) 発芽率および (B) 金型レベル。誤差範囲を表す平均 ± SD 5 生物学的実験の 5 技術的なレプリケーションから得られました。手紙を共有しないことを意味が大幅に異なる (P &lt; 0.05、ANOVA)。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56587/56587fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56587/56587fig3.jpg"> 
図 3: 潜在的な別の発芽種子に漂白剤や塩素のガス殺菌効果。(A) 発芽率および (B) 金型レベル。100 のソーク T-DNA 行は、潜在的な発芽させ発芽率がない場合は、滅菌剤として定義されている 5 段階のグループに分類されました。発芽率に基づくグループは次のとおり: グループ 1 (0-20%)、グループ 2 (21-50%)、グループ 3 (51 ~ 70%)、グループ 4 (71-90%)、グループ 5 (91-100%)。行はランダムに選ばれ、発芽の潜在的な遺伝子型には依存しなかった。値は、平均 ± SD 実験の 3 つの独立したレプリケーションから得られます。上記の各値の文字 ("a"、"ab"、"c"、等) は、カテゴリという統計グループを示します。手紙を共有しないことを意味が大幅に異なる (P &lt; 0.05、ANOVA)。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56587/56587fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">殺菌時間 (分)</td>
			<td colspan="4">漂白剤濃度 (%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40</td>
			<td>50</td>
			<td>80</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>2.13%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.00%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.50%</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.36%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.68%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20</td>
			<td>0.19%</td>
			<td>0.28%</td>
			<td>0.00%</td>
			<td>0.00%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表 1: 金型 Col 0 種の漂白殺菌のレベルです。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>漂白剤</td>
			<td>ICM</td>
			<td>時間</td>
			<td rowspan="2">% 塩素ガス (mol Cl2/mol 総ガス)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(mL)</td>
			<td>(mL)</td>
			<td>(h)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25</td>
			<td>1</td>
			<td>3</td>
			<td>2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100</td>
			<td>3</td>
			<td>1</td>
			<td>6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200</td>
			<td>9</td>
			<td>1</td>
			<td>16.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200</td>
			<td>9</td>
			<td>3</td>
			<td>16.5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表 2:塩素 (Cl2) 7 L コンテナーを使用してコロンビア野生型種子の殺菌治療をガスします。
補足表 1:コンテナーと % の Cl2の別のボリュームの計算を実行するようにプログラム スプレッドシート。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56587/Supplemental_Table%20_1.xlsx" target="_blank">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。

本研究の目的は、漂白剤や塩素ガス滅菌滅菌メディア上に成長した範囲のシロイヌナズナ遺伝子型の種子発芽の効果を決定するためだった。最適化された殺菌のプロトコルは、満足のいく種子の生存を提供しながら汚染微生物の増殖を防ぐために開発されています。

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of ...

この手順の全体的な目標は、微生物の増殖を防ぎながら、多数のシロイヌナズナの遺伝子型の種子滅菌を成功させるための標準化された条件を提供することです。この方法により、一度に数百の種子サンプルを滅菌できるため、ゲノミクス、プロテオミクス、メタボロミクス、その他のハイスループット研究の分野で重要な植物材料調製ステップが簡素化されます。この技術の主な利点は、効率的な滅菌と多数の種子サンプルに対する高い発芽率が組み合わされる条件を提供することです。まず、蒸留水で50%漂白剤溶液を準備します。漂白剤溶液200ミリリットルごとに、50マイクロリットルのTWEEN 20洗剤を追加します。漂白剤溶液は、無菌状態でのみ開封されている限り、最大1か月間保存できます。次に、100個の種子を1.5ミリリットルの微量遠心チューブに分注します。これは、手動で行うことも、カスタムメイドのシードロボットを使用して行うこともできます。次に、層流フードで、500マイクロリットルの50%漂白剤溶液を種子に加えます。次に、チューブをローテーターに移し、種子を漂白剤で10分間穏やかに攪拌しながらインキュベートします。10分後、チューブから漂白剤溶液を吸引し、できるだけ取り除きます。次に、500マイクロリットルの滅菌蒸留水を再度加え、チューブを反転させて混合します。種子が落ち着くのを待ってから、水を吸引し、別のアリコートと交換して種子を再度洗います。滅菌した蒸留水で合計6回の洗浄を行います。種子を水で十分に洗浄したら、1ミリリットルの水に懸濁してからメッキします。滅菌プロセスを開始する前に、塩素ガスを生成するために必要な漂白剤と塩酸の量を計算してください。提供された式を使用して、推奨される6%塩素ガスを取得します。滅菌を成功させ、飛散を防ぐために必要なHClの量を正確に計算してください。このプロトコルでは、必ず手袋と白衣を着用し、酸や漂白剤で濡らされたときは必ず手袋を交換してください。ドラフトの下で、種子バイアルを蓋を開けた状態でラックに移します。次に、滅菌を行うことができるプラスチック容器にラックを置き、蓋を容器に密封するためのパラフィンフィルムストリップを準備します。次に、ビーカーに100ミリリットルの漂白剤をロードしてから、250ミリリットルのビーカーを中に入れます。漂白剤を過剰に使用することは安全上の特徴であり、ビーカーはそれに含まれる溶液の総体積の少なくとも2倍である必要があります。また、漂白剤と酸は常に別々に取り扱ってください。次に、ビーカーに3ミリリットルの塩酸を加え、すぐに容器を閉じてパラフィルムで密封します。滅菌中にガスが蓄積していることを確認するために、容器を1時間監視します。塩素ガスは、容器内のかすかな黄色のもやとして見えるか、溶液が黄色に変わるかどうかを確認できます。容器のシールを定期的に確認してください。蓋が外れたり、パラフィンシールが緩み始めた場合は、パラフィンフィルムの追加層で蓋をしっかりと再シールします。1時間の滅菌後、容器の角を開けて3時間かけてガスを排出します。3時間の通気後、すべてのチューブにキャップをし、滅菌した種子をメッキするまで乾燥状態で保管します。次に、ガラス棒で攪拌しながら1.5グラムの重曹粉末をゆっくりと加えて固体を溶解することにより、反応を中和します。炭酸ガスの泡の形成が止まるまで、重曹を加え続けます。次に、溶液のpHを測定し、必要に応じて、pHが中性になるまで重炭酸ナトリウムを追加します。溶液が臭くなければ、廃棄できます。それ以外の場合は、すべての臭いが消えるまで待ちます。ガス滅菌種子の各チューブに500マイクロリットルの滅菌蒸留水を追加します。次に、種子をMSプレートに注ぎ、滅菌された単回使用の接種ループまたは滅菌ピペットチップを使用して均等に広げます。摂氏4度で種子の層別化を3日間行った後、プレートを摂氏23度に移し、毎日16時間の光にさらされます。根が培地に成長するように、蓋を上に置いておきます。成長の8日後、発芽した種子の割合をスコアリングします。発芽は、ラジカルが種皮の外側に突出し、2つの子葉が見えるときにカウントされます。また、カビの影響を受けた種子の数を数え、滅菌条件の有効性を判断します。5つの異なる曝露時間での4つの異なる濃度の漂白剤を、コロンビアの野生型種子で試験しました。漂白剤濃度が高いと、曝露が多すぎると発芽に悪影響を及ぼしました。しかし、すべての曝露時間で40%と50%の漂白剤で高い発芽率が観察されました。高濃度の漂白剤で滅菌された種子は死亡率が高く、しばしば成長欠陥を示しましたが、通常は完全にカビが生えていませんでした。50%漂白剤による10分間の滅菌は、カビ抑制と健康な発芽の最適なバランスを有することが決定された。塩素ガスの滅菌条件を最適化するために、3つの異なる濃度の塩素ガスを使用して、コロンビア野生型種子を2つの異なる時間にわたって滅菌しました。時間とガス濃度の間には有意な相互作用がありました。1時間では発芽に影響はなかったが、最大ガス濃度では3時間で有害であった。したがって、1時間の滅菌期間が選択されました。カビの成長は、3時間のガス曝露または6または17%ガスを使用した1時間の曝露によって効果的に抑制されました。したがって、1時間の6%ガス濃度が発芽とカビ抑制に最適であると判断されました。この手法を習得すると、適切に実行されれば、1日あたり数百の種子系統を成功裏に滅菌するために使用できます。ガス滅菌された種子は、乾燥した状態で長期間保存することもできます。この手順を試行する際は、提供された方程式を使用してHClと漂白剤の必要量を計算することを忘れないでください。この手順に続いて、ゲノムワイド関連研究などの他の方法を実行して、さまざまな異なる遺伝子型と目的の表現型を関連付けることができます。あなたの実験に頑張ってください。

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