全細胞パッチク電気生理学を用いたシナプスの多様性の評価
2019年4月23日
ここでは、急性脳スライスにおける全細胞パッチ クランプ電気生理学を使用して機能的なシナプスの多様性を評価するためのプロトコルを提案する.
脳では、ニューロンのペアはしばしばシナプス多重度と呼ばれる複数のシナプス接触を形成する。しかし、シナプス多重度の精密な検査には、技術的に困難な実験が必要です。このプロトコルは全細胞パッチクランプ電気生理学を用いたシナプス多重度の総推定のための簡単な方法を記述する。
この方法は、シナプス多重度を調査するために、任意の種および脳領域に適用することができる。この方法は、全細胞パッチクランプ電気生理学の基本的なスキルを必要とします。低く、安定したアクセス抵抗で高品質の記録を得ることは、データの正確な解釈のために重要です。
全セル構成を取得するには、録音ピペットをスライスの上に置き、ピペット電流を電圧クランプモードでオフセットします。ピペットにわずかな正圧を加え、栓をロックします。次に、無傷の膜を有する健康な細胞を選択し、ピペットで組織に近づく。
陽圧は組織に若干の障害を引き起こすはずです。細胞表面に小さなディンプルが形成されるまで、ピペットを斜めの動きでゆっくりと細胞に近づけます。次に、陽圧ロックを解除します。
セルはシールを形成し始め、抵抗は1ギガオームを超えて増加します。電圧クランプで、セルをマイナス68ミリボルトで保持します。その後、ピペットを細胞から斜めにわずかに引き離し、余分な圧力を取り除きます。
速く、遅いピペットの容量を補う。ピペットホルダーに接続されたチューブを通して短い吸引を施して、細胞を突破し、全細胞構成を得ます。次に、電気生理学データ取得および解析ソフトウェアで膜試験ウィンドウ上の細胞モードに切り替えます。
その後の実験では、記録浴の温度を摂氏27~30度、流量を1分あたり1.5~2ミリリットルに保ちます。多重度シナプスでは、作用電位は神経伝達物質放出を同期させ、より大きなポストナプティック電流を生成する。TTXおよびカドミウムによるブロッキング作用電位およびカルシウム依存性の小胞放出は、ポストナプティック電流の総和を妨げ、振幅を減少させる。
多重度がない場合、ブロックアクション電位は振幅を変えない。実験1では、多重度を推定するために、細胞をマイナス68ミリボルトで保持し、低カルシウムaCSFを浸透させます。自発性のEPSを少なくとも5分間記録して、安定したベースラインを確保します。
次に、30マイクロモル4-APをaCSFに加え、作用電位依存事象を増加させ、自発的なエプチクを少なくとも10分間記録して薬物効果を完全に得る。次に、4-APでaCSFに0.5マイクロモルTTXと10マイクロモルカドミウムを加え、ミニチュアのEPSCを少なくとも10分間記録します。オフライン分析の場合は、4-AP の適用直前のベースラインの最後の 1 分、4-AP アプリケーションの 10 分、および TTX アプリケーションの 10 分を使用します。
この実験では、シナプス小胞の放出を非同期化するために細胞外カルシウムをストロンチウムに置き換える。したがって、多重度が存在する場合、これは、ポストナプティック電流の振幅を減少させる必要があります。実験2では、通常のカルシウムaCSFで細胞を浸透させながら、少なくとも5分間自発的なEPSを記録する。
ベシクル放出を解除するには、ストロンチウムaCSFで細胞を浸透させ、自発的なEPSを記録します。オフライン解析では、大きな振幅の自発的なエプティックが小胞の同期放出によるものかどうかを判断するために、ベースラインの最後の1分間をストロンチウムaCSFアプリケーションの10分と比較します。多重度は多面的な放出を伴い、シナプス裂に高い神経伝達物質濃度を引き起こす。
低親和性AMPA受容体拮抗薬であるγ-DGGの添加は、小さな単一回の回価の心鼻波流に比べてより大きな多量体の効果的な阻害を招く。多面放出がなければ、ガンマ-DGGは大きく、より小さいポストナプティック電流に対して同様に有効である。実験3では、多面的な放出をテストするために、少なくとも5分間、低カルシウムaCSF中の自発的なエプチを記録する。
灌流システムを介してaCSFに30マイクロモル4-APを追加します。自発的なEPSを少なくとも10分間記録します。次に、4-AP を搭載した aCSF に 200 マイクロモルガンマ DGG を加え、少なくとも 10 分間、自発的なエプティクスを記録します。
別のセルでの制御実験として、手順を繰り返しますが、ガンマDGGの代わりに低濃度のDNQXを適用します。オフライン分析の場合は、各薬物アプリケーションの最後の分を分析します。シナプス活動のバーストは、一過性の自発的作用の潜在的な発火と刺激された発泡剤の放出確率を増加させることができます.
ニューロンが多重度を示す場合、作用電位の増加は、ポストナプティック電流の振幅の一過性増加を引き起こすはずです。実験4では、通常のカルシウムaCSFに自発的なエプティクスを記録する。作用電位焼成を高めるには、aCSFを充填した単極ガラス電極を2秒間20ヘルツの割合で刺激し、インターバースト間隔20秒で10回繰り返します。
分析には、最初の刺激の前に5,000ミリ秒の自発的なEPSをベースラインとして使用し、最終的な刺激の後の10〜300ミリ秒の自発的なEPSCと比較します。次に、平均振幅と周波数変化を10回の試行で行います。シナプス電流を検出して解析するプログラムを用いて、自発性のEPCやミニチュアEPCを解析します。
AMPA受容体媒介性のEPSを検出するために、推奨される検出パラメータとノンストップ解析機能を使用してください。各記録を手動でスキャンして、プログラムが各イベントを正確に検出していることを確認します。イベント データをクリップボードにコピーしてエクスポートし、データ管理ソフトウェアに貼り付けます。
次に、各薬剤治療の平均頻度と振幅を計算し、関連する統計分析を行います。ここに示す例では、4-AP は、自発的な EPS の振幅と周波数の両方を増加させます。TTXとカドミウムのその後の適用は振幅および頻度の両方を減少させる。
ここでは、記録からの自発的なEPSC振幅の分布です。ここで調べた視床下部ニューロンでは、ベースラインとTTX条件の振幅と周波数は同じであり、ベースラインの自発的なEPSCは非常に少数の作用電位依存性のEPSを含み、示唆している。したがって、その後の実験では、ベースラインと4-APの差を比較して多重度を測定することができる。
シナプス伝達の強度は、シナプス活性のバーストによって一過性増加することができる。より生理的条件下での多重度を調べるには、不感な刺激を用いて、作用電位の発火および放出確率を高めることができる。シナプス刺激に続く自発的なEPSC周波数と振幅変化の要約を次に示します。
データを正確に解釈するには、安定した記録が不可欠です。このデータは、分析を混乱させる可能性があるため、記録中にアクセス抵抗が 20% 以上変化した場合にデータを記述します。このプロトコルは、シナプス多重度を推定する簡単な方法を提供します, これは、異なる生理学的および病態生理学的条件におけるシナプス効果とその可塑性の重要な決定要因であります.
完全なトランスクリプトを表示し、数千本の科学動画にアクセス
概要
この研究は、急性脳切片における全細胞パッチクランプ電気生理学を使用して神経細胞の機能的シナプス多重性を評価するためのプロトコルを提示します。このアプローチにより、研究者は様々な種や脳領域にわたってシナプス多重性を推定することができ、高品質の記録を得ることの重要性を強調しています。
研究の主要な構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 電気生理学
- シナプス機構
背景
- シナプス多重性を理解することは、神経伝達を解読するために不可欠です。
- 以前の実験では、シナプス接触の研究の複雑さが強調されています。
- 様々なモデルにおけるシナプス多重性の粗推定のための信頼できる方法が必要です。
- このプロトコルは、シナプスダイナミクスへの洞察を提供するために全細胞パッチクランプ技術を利用しています。
研究の目的
- シナプス多重性を推定するための簡単なプロトコルを開発すること。
- 神経伝達物質放出メカニズムの理解を促進すること。
- 異なる脳領域と種に適応可能な方法を提供すること。
使用された方法
- 急性脳切片における全細胞パッチクランプ電気生理学。
- モデルには様々な脳領域にわたる神経細胞ペアが含まれます。
- 実験には、多重性を評価するための活動電位とカルシウム依存性小胞放出のブロックが含まれます。
- 重要な手順には、記録中に安定したアクセス抵抗と温度制御を維持することが含まれます。
- データ分析には、様々な条件下での興奮性シナプス後電流（EPSC）の統計的比較が含まれます。
主な結果
- EPSC振幅の変化を通じてシナプス多重性を推定する方法を特定しました。
- 小胞放出の干渉がシナプス後電流反応を変化させることを示し、シナプス多重性を確認しました。
- シナプスの効果と神経伝達物質濃度に対する多重小胞放出の影響に対処しました。
- 異なる実験条件下でプロトコルを検証し、シナプスダイナミクスに関する堅固なデータを提供しました。
結論
- この研究は、神経細胞ペアにおけるシナプス多重性を評価するための信頼できるプロトコルを確立しました。
- 結果は、シナプス伝達とその基礎となるメカニズムの理解を深めます。
- この方法は、シナプスの挙動と可塑性を研究するために様々な神経生物学的文脈で利用できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Understanding synaptic multiplicity provides critical insight into the functional organization of neuronal circuits, which is essential for target validation in neuropsychiatric drug discovery. This electrophysiology-based method enables mechanistic de-risking by quantifying synaptic efficacy and plasticity under physiological conditions, supporting predictive confidence in early-stage target engagement. The approach aids in evaluating how pharmacological or environmental interventions alter synaptic connectivity, informing portfolio decisions in CNS therapeutic development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of synaptic transmission mechanisms by estimating functional multiplicity of excitatory inputs onto postsynaptic neurons.
- Operational Value: Provides a quantitative electrophysiological readout to assess target-mediated changes in synaptic efficacy.
- Predictive Value: Supports biological de-risking by linking molecular targets to measurable changes in synaptic strength and release probability.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Establishes a standardized whole-cell patch-clamp protocol for measuring spontaneous and miniature EPSCs as functional synaptic outputs.
- Reproducibility: Requires stable access resistance and controlled perfusion conditions to ensure reliable amplitude and frequency comparisons across drug treatments.
- Scalability: Adaptable to various brain regions and species, enabling cross-model validation of synaptic phenotypes in discovery workflows.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects in vitro synaptic measurements to in vivo behavioral or pharmacological interventions affecting synaptic organization.
- Mechanistic De-risking: Differentiates action potential-dependent from independent release, clarifying presynaptic mechanisms of drug action.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by quantifying how targets influence synaptic multiplicity and neurotransmitter release dynamics.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing in target validation and enabling assay development for screening synaptic modulators prior to lead identification.
- Discovery Biology: Facilitates pathway clarification by measuring changes in EPSC amplitude and frequency in response to pharmacological perturbations.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible electrophysiological outputs suitable for assessing compound effects on synaptic transmission.
- Analytics: Generates amplitude and frequency distributions of sEPSCs and mEPSCs, enabling statistical comparison of synaptic activity under baseline and drug conditions.
- Translational Research: Supports continuity to preclinical models by linking synaptic multiplicity changes to behavioral or environmental manipulations.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable electrophysiological capability for evaluating synaptic function across multiple CNS targets and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into synaptic efficacy, reducing ambiguity in target-mediated effects on neuronal communication.
- Operational Value: Delivers standardized, quantifiable electrophysiological measurements that enhance reproducibility across laboratories.
- Strategic Value: Improves target selection confidence by linking molecular interventions to functional synaptic outputs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on their effects on synaptic multiplicity and release probability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in whole-cell patch-clamp electrophysiology and acute brain slice preparation.
- Dependent on stable access resistance (<20% change) and precise temperature control (27–30°C) for valid data interpretation.
- Necessitates perfusion systems for sequential drug application (e.g., 4-AP, TTX, cadmium, gamma-DGG) and electrophysiology software for event detection.
- Must account for variability in synaptic activity due to burst firing or changes in release probability during afferent stimulation.
- Limited to relative estimates of multiplicity; absolute quantification requires complementary anatomical or imaging approaches.
