全細胞パッチクランプを用いた蛍光ニューロンの興奮性の研究

aCSFを灌流した記録チャンバーで固定化されたトランスフェクトされたマウス冠状スライスを取ります。

ライスには、標的酵素と蛍光タンパク質を発現するまばらな錐体ニューロン集団が含まれています。

細胞内溶液と、ニューロン信号を測定するための増幅器に接続された電極で構成される記録ピペットを組み立てます。

標的組織領域を顕微鏡で同定し、蛍光ニューロンを特定します。

ピペットに陽圧を加えて目詰まりを防ぎ、標的ニューロンに進めます。

陽圧は、接触時に神経膜にわずかなくぼみを引き起こします。

圧力を解放し、膜と先端の間にしっかりとしたシールを形成します。

保持電位を一定の負の値に設定して、ニューロンを安定させます。

短時間の負圧を加えて膜を破裂させ、細胞質をピペット内部に接続し、全細胞構成を確立します。

電流クランプモードに切り替えて正の電流パルスを印加し、ニューロンの興奮性を示す活動電位を生成します。

パスツールピペットまたは小さなブラシを使用して、スライスを記録チャンバーに移します。ハープでスライスを押さえ、毎分2ミリリットルの速度でACSFを灌流します。GFP陽性ニューロンにパッチを当てるには、顕微鏡で10倍で関心のある領域を見つけます。次に、60倍の対物レンズを使用してGFP陽性細胞を見つけます。

次に、記録電極に細胞内溶液を充填します。その後、ガラスピペットをピペットホルダーに入れます。その後、ピペットチップを浴槽に入れ、チップに焦点を合わせます。ピペットが浴槽に入れたら、背圧制御システムを介して正圧を加えます。

ピペット内の背圧を維持しながら、視覚的誘導下で目的の細胞に近づきます。細胞表面に小さなくぼみが現れたら、圧力を解放します。この時点で、1ギガオームを超える抵抗で密閉性が形成される可能性がある。それ以外の場合は、それを容易にするために軽い負圧を加えます。

シールが形成されている間に、保持電圧クランプを負60ミリボルトにします。ギガオームシールが形成されたら、吸引パルスを加えて細胞膜を破裂させ、全細胞モードに侵入します。全セルモードになったら、電圧クランプから電流クランプモードに切り替えて記録を開始します。