Name: マウスの複数の臓器からのジカウイルスの単離と定量 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-15T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: 学ぶ マウス複数臓器からのジカウイルス単離・定量法。ウイルス病原性と免疫応答のメカニズム解明に有用で、他のフラビウイルスやアルファウイルス研究にも応用可能です。

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ピント博士は、セントルイス大学医学部のシード助成金とセントルイス大学医学部のスタートアップ資金から資金を提供しています。ブライアン博士は、NIH NIAIDからK22AI104794早期調査者賞とセントルイス大学学校からの種子助成金によって資金提供されています。資金提供を受けたすべての個人に対して、資金提供者は、研究の設計、データ収集と分析、出版の決定、または原稿の準備に役割を持ちなかった。

<ol><li>Lazear, H. M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+Virus%3A+New+Clinical+Syndromes+and+Its+Emergence+in+the+Western+Hemisphere%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Zika Virus: New Clinical Syndromes and Its Emergence in the Western Hemisphere.</a> Journal of Virology. 90 (10), 4864-4875 (2016).</li>
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<li>Rodhain, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arbovirus+infections+and+viral+haemorrhagic+fevers+in+Uganda%3A+a+serological+survey+in+Karamoja+district%2C+1984%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+Royal+Society+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Arbovirus infections and viral haemorrhagic fevers in Uganda: a serological survey in Karamoja district, 1984.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 83 (6), 851-854 (1984).</li>
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<li>Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Hirsch, A., Wiley, C. A., Nikolich-Zugich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Key+role+of+T+cell+defects+in+age-related+vulnerability+to+West+Nile+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Key role of T cell defects in age-related vulnerability to West Nile virus.</a> Journal of Experimental Medicine. 206 (12), 2735-2745 (2009).</li>
<li>Brien, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotype-specific+neutralization+and+protection+by+antibodies+against+dengue+virus+type+3%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3.</a> Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).</li>
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<li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+temporal+role+of+type+I+interferon+signaling+in+CD8%2B+T+cell+maturation+during+acute+West+Nile+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">A temporal role of type I interferon signaling in CD8+ T cell maturation during acute West Nile virus infection.</a> PLoS Pathogens. 7 (12), e1002407(2011).</li>
<li>Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation%2C+quantification%2C+detection%2C+and+storage+of+West+Nile+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus.</a> Current Protocols in Microbiology. 31, 11-15 (2013).</li>
<li>Brien, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+by+immunoglobulin+dual-affinity+retargeting+antibodies+against+dengue+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Protection by immunoglobulin dual-affinity retargeting antibodies against dengue virus.</a> Journal of Virology. 87 (13), 7747-7753 (2013).</li>
<li>Messaoudi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chikungunya+virus+infection+results+in+higher+and+persistent+viral+replication+in+aged+rhesus+macaques+due+to+defects+in+anti-viral+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Chikungunya virus infection results in higher and persistent viral replication in aged rhesus macaques due to defects in anti-viral immunity.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (7), e2343(2013).</li>
<li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hydrogen+peroxide-inactivated+virus+vaccine+elicits+humoral+and+cellular+immunity+and+protects+against+lethal+West+Nile+virus+infection+in+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">A hydrogen peroxide-inactivated virus vaccine elicits humoral and cellular immunity and protects against lethal West Nile virus infection in aged mice.</a> Journal of Virology. 87 (4), 1926-1936 (2013).</li>
<li>Sukupolvi-Petty, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+antibodies+against+dengue+virus+type+4+reveals+strain-dependent+epitope+exposure+that+impacts+neutralization+and+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of antibodies against dengue virus type 4 reveals strain-dependent epitope exposure that impacts neutralization and protection.</a> Journal of Virology. 87 (16), 8826-8842 (2013).</li>
<li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficient+IFN+signaling+by+myeloid+cells+leads+to+MAVS-dependent+virus-induced+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis.</a> PLoS Pathogens. 10 (4), e1004086(2014).</li>
<li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+New+Therapeutics+Using+a+More+Immunocompetent+Mouse+Model+of+Antibody-Enhanced+Dengue+Virus+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Defining New Therapeutics Using a More Immunocompetent Mouse Model of Antibody-Enhanced Dengue Virus Infection.</a> MBio. 6 (5), (2015).</li>
<li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+and+Murine+IFIT1+Proteins+Do+Not+Restrict+Infection+of+Negative-Sense+RNA+Viruses+of+the+Orthomyxoviridae%2C+Bunyaviridae%2C+and+Filoviridae+Families%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Human and Murine IFIT1 Proteins Do Not Restrict Infection of Negative-Sense RNA Viruses of the Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, and Filoviridae Families.</a> Journal of Virology. 89 (18), 9465-9476 (2015).</li>
<li>Hassert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2BT+cells+mediate+protection+against+Zika+associated+severe+disease+in+a+mouse+model+of+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection.</a> PLoS Pathog. 14 (9), e1007237(2018).</li>
<li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficient+IFN+signaling+by+myeloid+cells+leads+to+MAVS-dependent+virus-induced+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis.</a> PLoS Pathog. 10 (4), e1004086(2014).</li>
<li>Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation%2C+quantification%2C+detection%2C+and+storage+of+West+Nile+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus.</a> Curr Protoc Microbiol. 31, (2013).</li>
<li>Hassert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2BT+cells+mediate+protection+against+Zika+associated+severe+disease+in+a+mouse+model+of+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection.</a> PLoS Pathogens. 14 (9), e1007237(2018).</li>
<li>Fuchs, A., Pinto, A. K., Schwaeble, W. J., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lectin+pathway+of+complement+activation+contributes+to+protection+from+West+Nile+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The lectin pathway of complement activation contributes to protection from West Nile virus infection.</a> Virology. 412 (1), 101-109 (2011).</li>
<li>Lazear, H. M., Pinto, A. K., Vogt, M. R., Gale, M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta+interferon+controls+West+Nile+virus+infection+and+pathogenesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Beta interferon controls West Nile virus infection and pathogenesis in mice.</a> Journal of Virology. 85 (14), 7186-7194 (2011).</li>
</ol>

著者は開示するものが何もない

ZIKV感染は神経疾患を引き起こす可能性があるため、現在の動物モデルは、ワクチンおよび抗ウイルス剤の病因、免疫応答および保護有効性を研究するために、CNS内のウイルス制御に焦点を当てる必要がある。CNS疾患に焦点を当てる上での課題の一つは、多くの場合、末梢感染症の研究を犠牲にして来るということです。ここで提案される臓器分離方法は、CNS媒介性ZIKV関連疾患を評価し、抗ウイルス薬、治療および前臨床試験のためのモデルを確立するために、周辺およびCNSの両方でZIKV感染を迅速に評価する必要性に焦点を当てています。ワクチン。この技術の付加的な利点はまた、ZIKVに対する免疫学的応答の組み合わせ研究や感染の組織学的分析を含む、高い柔軟性を可能にすることです。この技術は、ZIKVだけに限定されるものではなく、デングウイルス21などのフラビウイルス、サルポックスおよびエトロメリアのようなオルソポックスウイルスを含む宿主病原体相互作用の範囲を研究するために普遍的に適用することができる。この収穫技術の考慮事項と欠点は、主に実験者の能力に焦点を当てる。ZIKVは室温で長期間安定していないため、灌流後の臓器...

ジカウイルス(ZIKV)は、フラボリダ科に属するアルボウイルスであり、ポワッサンウイルス(POWV)、日本脳炎ウイルス(JEV)、および西ナイルウイルス(WNV)1などの重要な神経侵襲性ヒト病原体を含む。その隔離と同定に続いて、アフリカとアジア2、3、4、5、および中南米内の流行のヒトZIKV感染の定期的な報告があった(参照6)しかし、ZIKVが重篤な疾患7を引き起こすと考えられていたのは最近になってからでした。現在、ZIKV感染に関連する神経疾患および出生時欠損の症例が数千例ある。ZIKVの急速な出現は、疾患の重症度の増加がある理由、ZIKV感染に対する免疫学的反応とは何か、神経学的増加に関連するウイルスおよび/または免疫媒介病理があるか、に関連する多くの疑問を引き起こしている。症状と出生時欠損。現在、ZIKVに関連する中枢神経系(CNS)関連疾患と、ZIKVに対する抗ウイルスおよびワクチンの有効性を迅速にテストする必要性を理解するラッシュがあります。このような背景から、ZIKV特異的フォーカス成形アッセイ(FFA)を用いた周辺およびCNSの両方におけるZIKV力中剤の迅速な分析方法を開発したのです。
小動物モデルは、疾患の進行を理解し、ワクチン、治療薬、抗ウイルス剤の早期評価のために重要です。我々は、ウイルス病原体8、9、10、11に対するヒト感染と保護をモデル化するために様々なマウス株を使用して、アルボウイルス病の研究のための小動物モデルを確立しました。 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21、22。この経験を活かして、WNVおよびデングウイルス、CNS21、23の両方の末梢器官におけるZIKV力価の評価のための関連フラビウイルスの評価に用いられる技術を改変し始めました。24.他のアッセイに対するこれらの方法の利点: 1) 彼らは分析のための末梢とCNS臓器の両方を収穫する能力を組み合わせること;2)方法は、同じ器官内の同じ動物上のウイルス力と一緒に、自然および適応免疫応答の測定のために、フローサイトメトリーに適応可能である。3)収穫技術は組織学的分析に適応可能である。4)ZIKV FFAは、ウイルス力板分析のための急速な高スループット法です。5)これらの方法は、ほとんどの病原体25に感染した動物の器官におけるウイルス力学者の評価に適用することができる。

<table><tbody><tr><td>1-ブロモ-3-クロロプロパン (BCP)</td><td>MRC 遺伝子</td><td>BP151</td><td></td></tr><tr><td>10 cc シリンジ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>BD 309642</td><td></td></tr><tr><td>18 G ニードル</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>22-557-145</td><td></td></tr><tr><td>1 cc TB シリンジ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-823-16H</td><td></td></tr><tr><td>20 cc シリンジ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>05-561-66</td><td></td></tr><tr><td>24チューブビーズミル</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15 340 163</td><td></td></tr><tr><td>3.2 mmステンレス鋼ビーズ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>NC9084634</td><td></td></tr><tr><td>37 >C 組織培養インキュベーター</td><td>Nuair</td><td>5800</td><td></td></tr><tr><td>4G2 抗体</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96ウェル平底プレート</td><td>Midsci</td><td>TP92696</td><td></td></tr><tr><td>96ウェル丸底プレート</td><td>Midsci</td><td>TP92697</td><td></td></tr><tr><td>Basix 1.5 mL エッペンドルフチューブ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>02-682-002</td><td></td></tr><tr><td>濃縮殺菌漂白剤</td><td>ステープル</td><td>30966CT</td><td></td></tr><tr><td>CTL S6アナライザー</td><td>CTL</td><td>CTL S6 ユニバーサルアナライザー</td><td></td></tr><tr><td>湾曲カッティングハサミファイン</td><td>サイエンスツール</td><td>14061-11</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco 'のモディファイドイーグル」s 中 - 高グルコース 4,500 mg/L グルコース</td><td>MilliporeSigma</td><td>D5671</td><td></td></tr><tr><td>エタノール (分子生物学グレード)</td> <td>MilliporeSigma</td><td>e7023</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>MilliporeSigma</td><td>F0926-500ML</td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11036-20</td><td></td></tr><tr><td>氷酢酸</td><td>MilliporeSigma</td><td>537020</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスHRP標識抗体</td><td>ミリポアシグマ</td><td>8924</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>ミリポアシグマ</td><td>H3537-100ML</td><td></td></tr><tr><td>イソプロパノール(分子生物学グレード)</td><td>ミリポアシグマ</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>ケタミン/キシラジンカクテル</td><td>比較医学</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>ミリポアシグマ</td><td>g7513</td><td></td></tr><tr><td>マグマックス RNA精製キット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AM1830</td><td></td></tr><tr><td>メチルセルロース</td><td>ミリポアシグマ</td><td>M0512</td><td></td></tr><tr><td>微量遠心機</td><td>エペンドルフ</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>MiniCollect 0.5 mL EDTA チューブ</td><td>バイオワン</td><td>450480</td><td></td></tr><tr><td>O リングチューブ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>21-403-195</td><td></td></tr><tr><td>ワンステップ q RT-PCR ミックス</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>4392938</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>EMS- 15713-S</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>ミリポアシグマ</td><td>d8537-500ml</td><td></td></tr><tr><td>プロリン マルチチャンネルピペット</td><td>ザルトリウス</td><td>72230/72240</td><td></td></tr><tr><td>プロリン シングルチャンネルピペット</td><td>ザルトリウス</td><td>728230</td><td></td></tr><tr><td>RNAse フリーウォーター</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10-977-023</td><td></td></tr><tr><td>RNAzol BD</td><td>MRC 遺伝子</td><td>RB192</td><td></td></tr><tr><td>ロッキングプラットフォーム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11-676-333</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>フィッシャー</td><td>MT10040CV</td><td></td></tr><tr><td>サポニン</td><td>ミリポアシグマ</td><td>s7900</td><td></td></tr><tr><td>スプーン/スパチュラ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>10090-17</td><td></td></tr><tr><td>ストレートカッティングハサミ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14060-11</td><td></td></tr><tr><td>トリトン X-100</td><td>ミリポアシグマ</td><td>t8787</td><td></td></tr><tr><td>トゥルーブルー基板</td><td>VWR</td><td>95059-168</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>ミリポアシグマ</td><td>t3924-100ML</td><td></td></tr></tbody></table>

マウスの複数の臓器からのジカウイルスの単離と定量

Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse

提示されている方法は、ジカウイルス感染動物からの臓器の単離およびウイルス負荷の定量化のための実験室手順を示す。この手順の目的は、感染後の異なる時点または異なる実験条件下でマウスの末梢およびCNS領域におけるウイルス力を定量化し、ジカウイルス感染を調節するウイルス学的および免疫学的要因を同定することです。実証された臓器分離手順は、ウイルス力価の焦点形成アッセイ定量と定量的PCR評価の両方を可能にする。急速な器官の隔離の技術はウイルスの間数の維持のために設計されている。フォーカス形成アッセイによるウイルスチター定量は、ジカウイルスの迅速なスループット評価を可能にする。焦点形成アッセイの利点は、感染性ウイルスの評価であり、このアッセイの限界は、検出の限界を減少する器官毒性の可能性である。ウイルス価価評価は定量的PCRと組み合わせられ、臓器内の組換えRNAコピー制御ウイルスゲノムコピー数を使用して検出の限界を低く評価する。全体的にこれらの技術は、ジカウイルス感染動物の周辺およびCNSにおけるジカウイルス力挙子の分析のための正確な迅速な高スループット法を提供し、ほとんどの感染動物の器官におけるウイルス力中剤の評価に適用することができるデングウイルスを含む病原体。

上記のIfnar1-/-マウスを用いてZIKV力電力を評価し、フットパッドへの皮下(SC)注射を介してZIKV(PRVABC59)に感染した。ここで、ZIKVの1 x 105 FFUを8〜12週齢のIfnar1-/-マウスSCに投与しても致死的ではないが、ウイルスは周辺およびCNSの両方で複製することができる。この用量および経路は、宿主病原体免疫応答および病原性を研究するために使用される。8-12週齢のIfnar1-/-マウス静脈内注射(IV)注射に対するZIKVの1 x 105 FFUの投与は80〜100%致死的であり、動物はウイルス注射後8〜14日の間に感染に屈する。この投与経路を日常的に使用して、抗ウイルス薬や治療薬の有効性、ならびに前臨床ワクチン候補試験の有効性を判断します。
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このプロトコルの目的は、感染後にマウスの複数の器官からジカウイルスを分離および定量化することによってウイルス性疾患を調査するために使用される技術を実証することです。

The methods being presented demonstrate laboratory procedures for the isolation of organs from Zika virus infected animals and the quantification of viral ...

このビデオでは、ジカ感染のマウスモデルを使用して、ウイルス感染の影響と結果として生じる免疫学的応答を尋問するために設計された一連の手順について説明します。このプロトコルは、ウイルスが体内に広がった程度を特定し、物理的な障壁を横断し、組織にアクセスすることによって、感染と免疫の機械学的理解を開発することを可能にするので、重要です。これらの技術は、ウイルスの病態の詳細な理解を可能にし、ワクチンまたは治療薬によって提供される保護のメカニズムを解剖する能力を提供する。ここでは、マウスのジカウイルス感染を用いたこの方法を実証するが、この方法は、デング熱ウイルスやチクングニアウイルスのようなアルファウイルスのような他のフラビウイルスを含むウイルス感染の範囲に適用することができる。中枢神経系の臓器を収穫することは難しい場合があるので、小さな実験を計画し、事前に技術を練習する準備をすることが重要です。このプロトコルは、実験データを視覚化、キャプチャ、保存する能力を持つ小さな動物モデル内でのウイルス拡散の迅速な解剖を可能にする。実験者が中枢神経系の器官を収穫する方法を理解できるように、この方法を視覚的に実証することが重要です。また、細胞の合流のレベルとウイルス病巣の強度を確認することも重要です。まず、感染したマウスのペルトを取り除くために鉗子を使用してください。はさみでマウスの頭の首を切り落とし、続いて腕と脚を取り除きます。脳を収穫するには、鋸歯状のラ・グランジ・ハサミを使って頭蓋骨を頭蓋骨マグナムを切ります。鉗子で頭蓋骨を剥がし、へらで脳をすくい取ります。強い鈍いはさみを使用して、背骨を取り巻く骨を取り除き、骨盤の骨を横切って切り取り、腰椎レベルで椎骨の前部を露出させる。その後、脊柱を囲む筋肉をできるだけ多く取り除きます。慎重に、針が椎体を不法侵入するのを防ぐために過度の圧力を避け、脊椎の前部の内側に針のベベル先端を置きます。椎体と針に圧力をかけるために強く保持し、シリンジプランジャーを押してコードをシャーレに追い出します。直ちに標識チューブ内の脊髄を移し、さらに均質化するためにドライアイス浴中に入れます。均質化のために、DMEMを1ミリリットル加え、ビーズビーターでサンプルを均質化します。臓器が均質化されていることを確認した後、氷の上に遠心分離機とアリコートサンプルを保存し、必要になるまでマイナス80°Cで保存します。アッセイの日に、マイナス80°Cの冷凍庫から均質化されたサンプルを取り出し、解凍させます。氷上のサンプルで、ジカウイルスを希釈プレートの最初の井戸に10倍に希釈し、マルチチャネルピペットを使用してプレートの下に10倍の連続希釈を行い、毎回先端を変更します。20マイクロリットルのサンプルを180マイクロリットルの成長培地に加えることで、各希釈液の間にピペットチップを交換します。ビロセルを覆う準備された平らな底96ウェルプレートから培地を取り除くことによって、焦点形成プレートを準備します。単層が乾燥するのを防ぐために、ウイルス希釈液の100マイクロリットルをビロプレートの各ウェルに直ちに加える。同じチップセットを使用して、最低濃度から最高濃度に追加します。ロックプレートサイドからサイドに2~4回、5%の二酸化炭素で摂氏37度で1~2時間インキュベートする。2%メチルセルロースを室温まで温めます。次いで、成長培地中の2%メチルセルロース溶液を約2対1の割合で希釈する。インキュベーション後、96ウェルプレートの各ウェルにメチルセルロース成長培地125マイクロリットルを加えます。5%の二酸化炭素で摂氏37度で32〜40時間再びインキュベートする。ビロセルを固定するには、バイオセーフティキャビネットで、96ウェルプレートの各ウェルのメチルセルロース層の上部に5%パラホルムアルデヒドの50マイクロリットルを追加します。室温で60分間インキュベートします。または、パラフィルムでプレートを覆い、一晩摂氏4度に置きます。その後、ピペットを使用して、バイオセーフティキャビネット内の使い捨て容器に細胞からオーバーレイとメディアを取り除きます。150マイクロリットルのPBSでやさしく洗います。プレートからPBSを取り出し、バイオセーフティキャビネットからプレートを取り外します。PBS洗浄を2回繰り返し、150マイクロリットルをFFA洗浄バッファーに1回加え、室温で5〜10分間放置して固定細胞を透過させます。次に、感染を検出するために一次ジカ抗体を使用する。一次抗体4G2を、FFA染色バッファーで1ミリリットル当たり1マイクログラムの濃度で調製します。プレートからFFA洗浄バッファーをフリックし、各ウェルにFFA染色バッファーに一次抗体の50マイクロリットルを追加します。その後、パラフィルム、またはプラスチックフィルムでプレートを密封し、摂氏4度で一晩インキュベートします。二次行く抗マウスHRP標識抗体を1〜5,000の濃度でFFA染色バッファーで調製した。抗体溶液を除去した後、150マイクロリットルのFFA洗浄バッファーで細胞を3回洗浄します。洗面液を取り外し、毎回シンクにフリックします。FFA染色バッファーで二次抗体を用いた細胞を1ウェルあたり50マイクロリットルで染色し、室温で1~2時間インキュベートする。その後、細胞をFFA洗浄バッファーで3回洗浄し、再度、毎回シンクにフリックして洗浄バッファーを除去する。各ウェルにTrueBlue基板の50マイクロリットルを追加します。スポットが最小限の背景で完全に定義されるまで 2 ~ 15 分待ちます。スポットが見えた後、水を流す力から単層を保護するために手で水でやさしく洗います。ペーパータオルをタップして乾かします。その直後に、解剖スコープを使用して各井戸のスポットを手動でカウントするか、自動スポットカウンターを使用します。ImmunoCaptureソフトウェアでは、サンプルごとにウェルあたり20〜200の間で容易に識別された病巣を有する希釈を選択し、重複ウェルの平均を使用して1ミリメートルあたりの焦点形成単位の力価を計算する。この実験では、Ifnarマウスにジカウイルスを皮下に投与した後、末梢および中枢神経系組織にウイルス負担が示された。検出の限界は、臓器に基づいて、グラムあたり100〜500 FFUの間であった。フォーカス形成アッセイを行う場合、技術的なミスは最適でない結果をもたらす可能性があります。肝臓の高濃度によって駆動される器官毒性は、アッセイの感度を変化させた。器官中のウイルス力価が毒性よりも低いとき、FFAはウイルス力価を正確に記録することができなかった。腎臓細胞は高い臓器濃度の毒性を示したが、低臓器濃度でウイルス価によって克服された。激しいピペッティングや洗浄は、単層を除去することができ、失われたデータの力価の結果の不正確な報告につながる。ラボベンチ吸収性紙に存在する繊維または毛髪は、個々の井戸を汚染し、自動計数プログラムを使用する場合に重大なエラーを引き起こす可能性があります。細胞密度は、焦点形成アッセイの成功に劇的に影響を与える別の問題です。アッセイ開始時に約60%の合流度の細胞は、90%のコンフルエンシーでメッキされた細胞と比較して、焦点形成アッセイに影響を与える劇的な違いを示した。臓器収穫が効率的に完了するように実験の規模と範囲を計画することは、手順の最も重要な部分であり、続いて高品質の細胞でフォーカス形成アッセイを開始する。この手順は、複数のウイルスファミリーのウイルスを定量化するために使用されています。このプロトコルはまた、治療化合物のスクリーニングおよび中和抗体力剤の定量に適応することができる。これらの技術は、生きたウイルスを定量化するために使用され、適切な安全手順は、BMBLに定められたガイドラインに従って取られるべきである。

isolation-quantification-zika-virus-from-multiple-organs

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

このビデオは、フォーカス形成アッセイを介して複数のマウス臓器のジカウイルスを定量する手順を示しています。このプロセスでは、哺乳類細胞の単層にウイルスに感染した組織ホモジネートを感染させ、その後、ウイルスの拡散を防ぐためにメチルセルロースを使用します。その後、免疫染色を用いて、臓器特異的な感染力の正確な定量と測定を可能にします。...

感染マウスの臓器におけるウイルス力価を定量するためのフォーカス形成アッセイ

このビデオは、成体マウスにジカウイルス懸濁液を脳内に注射して神経変性を誘発する方法を示しています。麻酔をかけたマウスを定位固定装置フレームに固定し、露出した頭蓋骨に穴を開けて注射します。ジカウイルスの懸濁液が脳組織に注入されます。ウイルス感染は炎症を引き起こし、神経変性を引き起こします。...

成体マウスにおけるジカウイルス誘発性神経変性のモデル確立

ジカウイルス(ZIKV)は、新たな病原体であり、胎児の発育異常と小頭症に関連しています。効果的な感染性細胞培養システムの確立は、ZIKVの複製研究だけでなく、ワクチンや医薬品の開発にも重要です。この研究では、ZIKVに関連するさまざまなウイルス学的アッセイが示され、議論されています。...

ジカウイルス感染細胞培養系と<em&gt;インビトロ</emインターフェロンの&gt;予防効果

このプロトコールは、2プラスミドの感染性cDNAクローンからの感染性Zikaウイルスの回収を記載している。...

新世界Zikaウイルス感染クローンからの組換えウイルスの救出とキャラクタリゼーション

脳内注入戦略を使用してジカ ウイルス性神経疾患のマウスモデルの確立: 胎生期、新生児、およびアダルト

ジカ ウイルス (ZIKV) のための Ifnar1-/-マウスのモデルの immunoprivileged 器官の抗原特異的 T 細胞応答を評価するためのプロトコルを説明します。このメソッドは、有効性評価の貴重なも ZIKV...

ジカ ウイルス特異 Immunoprivileged 臓器感染 Ifnar1-/-マウスの T 細胞応答の評価

量的なリアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応による感染症の定量化、ひと初代細胞、ひと血清を用いたデング ウイルスに対する耐性が既存のジカ...

ひと初代細胞におけるジカの抗体依存性強化の定量化

提示されたプロトコルは、封じ込めの設定で、ジカのような特定のウイルスに対する Aedes aegypti...

ジカウイルスを用いた Aedes aegypti蚊の ベクターコンピテンス分析

現在のプロトコルはVeroのアフリカの緑の猿の腎臓の細胞のジカウイルス(ZIKV)の伝播および24-wellおよび96-well(ハイスループット)フォーマットのセルベースの比色immunodetection方法を使用してZIKVの量化を記述する。...

ウイルス増殖と細胞ベースの比色定量

マウス生殖管からリンパ球を分離するための効率的な方法が記載されている。この方法では、効率的な分離を可能にするために酵素消化し、パーコール勾配分離を利用しています。この手法は、他の種で使用するためにもに適応可能である...

マウス生殖管粘膜からのリンパ球の単離

学ぶ マウス複数臓器からのジカウイルス単離・定量法。ウイルス病原性と免疫応答のメカニズム解明に有用で、他のフラビウイルスやアルファウイルス研究にも応用可能です。

マウスの複数の臓器からのジカウイルスの単離と定量

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