Name: mRNAエレクトロポレーションを用いて鳥類胚における複数のタンパク質の迅速かつ効率的な発現 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: 学ぶmRNAエレクトロポレーション法を用いた鳥類胚における複数タンパク質の迅速発現。蛍光標識とタイムラプス顕微鏡による細胞動態追跡が可能になり、発生生物学研究に革新的な可視化ツールを提供します。

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この作品に役立つ洞察をデビッド・ハスに感謝します。この研究は、ローズヒルズ財団サマーリサーチフェローシップ(2016-2018)とUSCプロボストのM.T.、サバン研究所内壁画研修前博士賞、および大学の一部で支援されました。南カリフォルニア学部研究員プログラム賞

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著者は、宣言する利益相反を持っていません。

このプロトコルでは、ウズラ胚をガストレーションする細胞にmRNAを正確にマイクロインジェクトして電気ポレートする方法について段階的に説明しました。インビトロ合成mRNAエレクトロポレーションにより、ウズラ胚のガストレーションにおける蛍光タンパク質(GP)の迅速かつ効率的な発現が可能であることを実証した(図2および3)。電気起電mRNAから翻訳されたH2B-シトリンタンパク質からの蛍光は、約20分以内に共焦点顕微鏡検査によって検出され、FP蛍光で1時間増加した(図3、補足ムービー1)。これは驚くほど速く、シトリン32、33の推定成熟時間に近い。DNAベクターから発現した胎児は、2〜3時間後に検出された(図3、補足。ムービー 1) は、以前<sup...

エレクトロポレーションは、電気パルスを使用してプラズマ膜内に一時的な細孔を作り出し、核酸や化学物質などの物質がサイトソールに入り込むことを可能にする物理的なトランスフェクション方法です。エレクトロポレーションは、細菌、酵母、植物、および哺乳動物細胞1、2、3にDNAを提供するために広く使用されています。これは、発達中の鳥胚内の標的細胞および組織に遺伝的ペイロードを導入するために日常的に使用され、細胞4、5、6、細胞の集団の遺伝子制御または標識移動の遺伝子制御を研究する。 7.しかし、DNAエレクトロポレーション8にはいくつかの実験的な制限も存在する。例えば、DNAエレクトロポレーションは、多くの場合、細胞あたりの発現ベクターの非常に可変数を導入し、その後、それらがコードするmRNAとタンパク質を導入します。この変動性は、画像解析とデータ解釈9、10の両方を複雑にするかなりの細胞細胞の不均一性につながる可能性があります。さらに、DNAエレクトロポレーションからのタンパク質は、エレクトロポレーション後3時間しか発現し始め、12時間まで細胞数と蛍光強度の最大効率に達せず、核への転移に要する時間が原因で完了する可能性が高い。生体内11の転写と翻訳の両方.
対照的に、mRNAトランスフェクションは、マイクロインジェクション12、13によるキセノプス・レービス卵母細胞、mRNAリポフェクタミントランスフェクション14によるヒト幹細胞の再プログラミングを含む様々なモデルシステムで効果的に使用されている。、成体マウス15における再石灰性神経幹細胞を電気的にする。我々は、異なる蛍光タンパク質(GP)をコードするインビトロ合成mRNAを用いて、初期の鳥類胚発生時に細胞を効率的に標識するmRNAエレクトロポレーションの能力を試験した。我々の研究では、キセノプスおよびゼブラフィッシュ胚のタンパク質を発現するために一般的に使用される多目的発現ベクターであるpCS2+ベクターを用いて使用した。pCS2+におけるSP6およびT7 RNAポリメラーゼプロモーターは、インビトロ転写/翻訳システムで使用した場合、任意のクローン遺伝子からのmRNAおよびタンパク質の合成を可能にします。
ここでは、mRNAエレクトロポレーションにより、ウズラ胚のガストレーションにおける蛍光タンパク質(GP)の迅速かつ効率的な発現が可能であることを実証する。我々は、これらの研究で使用される発現ベクターの多くを設計し、生成した。例えば、LifeAct-eGFP遺伝子16をpCS2+ベクター17にサブクローニングし、CMVプロモーターおよびSP6プロモーターから発現した。挿入された遺伝子は、SP6プロモーターの下流にあり、SV40ポリ(A)テール18の上流にある。mRNAとDNAと共にエレクトロポレートされた胚では、インビトロ転写されたmRNAからコードされた胎児は、最初にエレクトロポレーションの20分以内に検出されたが、DNA発現ベクターからのGPは、核、ゴルジ、および核をコードする複数のmRNAの3時間後にのみ検出された。膜タンパク質は同時に胚にエレクトロポレートされ、個々の細胞内の複数のタンパク質の迅速かつ効率的な発現をもたらす。最後に、光漂白(FRAP)アッセイ後の生体内蛍光回収を用いて、電ポレートされたmRNAの大部分が2時間以内に崩壊することを示す。したがって、限られた新しいタンパク質翻訳と組み合わせた高速初期タンパク質産生は、発現の時間的制御が必要な場合にmRNAエレクトロポレーションを貴重な技術にする。

<table><tbody><tr><td>BamHI-HF</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>R3136L</td><td></td></tr><tr><td>BglII</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>R0144S</td><td></td></tr><tr><td>BsrG1-HF</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>R3575S</td><td></td></tr><tr><td>NotI-HF</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>R3189L</td><td></td></tr><tr><td>SalI-HF</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>R3138L</td><td></td></tr><tr><td>フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール</td><td>サーモフィッシャー</td><td></td><td></td>15593031</tr><tr><td>SP6 mMessage Machine in vitro転写キット</td><td>サーモフィッシャー</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7252</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>93443</td><td>4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, ポリエチレングリコール tert-octylphenyl ether</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>D9542</td><td>2-(4-アミジノフェニル)-6-インドールカルバミジン二塩酸塩、4&prime;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール二塩酸塩、DAPI二塩酸塩</td></tr><tr><td>ワットマンNo.1濾紙</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>WHA1001125</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>G9012</td><td></td></tr>尿<tr><td>素</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>51457</td><td></td></tr><tr><td>pmTurquoise2-ゴルジ</td><td>Addgene</td><td>36205</td><td>pmTurquoise2-ゴルジは、ドルスガデラ(Addgeneプラスミド#36205;http://n2t.net/addgene:36205 ;RRID:Addgene_36205)</td></tr><tr><td>pmEGFP-N1-LifeAct</td><td></td><td></td><td>Nat. Methods 2008;5:605-7.PubMed ID: 18536722</td></tr><tr><td>pCS2.Lifeact-mGFP</td><td>Addgene</td><td></td><td>この論文</td></tr><tr><td>pCS.H2B-citrine</td><td>Addgene</td><td>53752</td><td>pCS-H2B-citrine は、Sean Megason (Addgene plasmid # 53752 ; http://n2t.net/addgene:53752 ;RRID:Addgene_53752)</td></tr><tr><td>pCS.memb-mCherry</td><td>Addgene</td><td>#53750</td><td>pCS-memb-mCherryはSean Megasonからの贈り物でした(Addgene plasmid # 53750 ; http://n2t.net/addgene:53750 ;RRID:Addgene_53750)</td></tr><tr><td>ツァイス LSM-780 倒立顕微鏡</td><td>カール・ツァイス顕微鏡GmbH</td><td></td><td>LSM-780は、バイタルイメージング作業に必要な感度を提供する共焦点・多光子顕微鏡です。電動ステージ、オートフォーカスデバイス、フルステージトップブラックアウトインキュベーターを装備した780は、ハイエンドの生細胞/胚イメージングに最適な顕微鏡です。高感度の32チャンネルクエーサー検出器により、スペクトルイメージング、リニアアンミキシング、高色数(>4)の画像取得が可能です。励起は、6ラインの単一光子レーザー(405、458、488、514、564、633 nm)、カメレオン(コヒーレント)2光子レーザー(690nm〜1000nmの範囲)で実行でき、ZEN 2011 SP7(Black)システムソフトウェアで実行できます。</td></tr><tr><td>CUY-21 EDIT in vivoエレクトロポレーター</td><td>ベックス(株)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>白金平角電極 一辺長5mm</td><td>ベックス(株)</td><td></td><td></td>LF701P5E</tr><tr><td>オリンパス MVX10 FL 実体顕微鏡</td><td>オリンパス ライフサイエンス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XM10 モノクロカメラ</td><td>オリンパス ライフサイエンス</td><td></td><td></td></tr><tr><td><ストロング>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) HCR (10倍、pH 7.4) </強></td><td></td><td></td>1 <td>L を調製するには、NaCl 80 g (Sigma-Aldrich S3014)、KCl 2 g (Sigma-Aldrich P9541)、Na2HPO4 (無水;Sigma-Aldrich S3264)、および 2.7 g の KH2PO4 (無水;Sigma-Aldrich P9791)。HClでpHを7.4に調整し、超高純度H2Oで最終容量を1Lにします。HCRのPBSでCaCl2およびMgCl2を使用することは避けてください。HCR用のPBSは、RNaseフリー溶液として調製することが重要です(例:ジエチルピロカーボネート[DEPC]処理)。</td></tr><tr><td>1.37 M NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>27 mM KCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>80 mM Na2HPO4 20 mM KH2PO4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS/Triton1</td><td></td><td></td> <td>mL 1 mL の Triton X-100 (Sigma Aldrich 93443) と 100 mL の 10&times を加えます。PBSを890mLの超高純度蒸留H2O.溶液を0.2μでろ過します。mフィルターをかけて4 ?使用までC。</td></tr><tr><td>1倍;リン酸緩衝生理食塩水(PBS)(DEPC処理;pH 7.4)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.1% Triton X-100</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mrnaエレクトロポレーションを用いて鳥類胚における複数のタンパク質の迅速かつ効率的な発現

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

我々は、mRNAエレクトロポレーションにより、生きているウズラ胚の細胞にDNAエレクトロポレーションよりも迅速かつ広範に標識する蛍光タンパク質を可能にすることを報告する。高いトランスフェクション効率は、少なくとも4つの異なるmRNAを~87%の効率で共生することを可能にします。電化mRNAのほとんどは、最初の2時間のエレクトロポレーションの間に分解され、発達中の胚で時間に敏感な実験を行うことを可能にする。最後に、様々な細胞内標的蛍光タンパク質をコードするmRNAでエレクトロポレートされた生きた胚を動的に画像化する方法について述べた。

mRNAエレクトロポレーションはDNAエレクトロポレーションよりも効率的
私たちはpCS2+を使用しました。H2B-シトリンは、mRNAをインビトロで調製する。DNAエレクトロポレーションは通常1-2 μg/μLで行われるため、mRNAエレクトロポレーションにはmRNAの等化濃度(H2B-シトリンの場合は約0.25-0.5 μg/μL)を用いました。まず、pCS2+のエレクトロポレーション効率をテストしました。H2B-シトリンmRNAと比較したH2B-シトリンDNA(pCS2+のSP6プロモーターから転写したインビトロ。H2B-シトリン)は、DNAまたはmRNAをHH5ウズラ胚に別々に電気ポレートし、12時間後のエレクトロポレーションでエレクトロポレーション効率を調べることによって。DNAエレクトロポレーションは一部のエレクトロポレーション細胞において明るい蛍光を引き起こしますが、DNAエレクトロポレーションの効率は、...

ウズラ胚モデル系における複数のタンパク質の迅速かつ効率的な発現を可能にする方法として、メッセンジャーRNA(mRNA)エレクトロポレーションを報告する。この方法は、蛍光的に細胞を標識し、エレクトロポレーション直後のタイムラプス顕微鏡検査によって生体内の動きを記録するために使用することができる。

mRNAエレクトロポレーションを用いて鳥類胚における複数のタンパク質の迅速かつ効率的な発現

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

mRNAエレクトロポレーションは、鳥類モデルシステム内の複数のタンパク質の迅速、効率的、および空間的および時間的に制御された発現を提供します。この方法は標準的なDNAエレクトロポレーションによって達成される標識より蛍光タンパク質のより広く、速い表現を可能にする。エレクトロポレーションは、RNAやDNAなどの遺伝的ペイロードを多数のモデル生物の細胞に移管するための導管として機能する原形質膜中の細孔の一過性の開口部を促進する。最初の実験では、エレクトロポレーションのような外部操作に対してより硬く、より耐性があるため、1日齢の胚で動作します。適切な胚発生段階で、ウズラの卵の内容物を穏やかに分解し、10センチメートルのペトリ皿に注ぎます。転送ピペットを使用して、厚いアルブミンの大部分を取り除きます。ラボ組織を使用してヨークの表面を静かに拭き取り、胚の周りの残りの厚いおとびんを取り除き、胚が紙のリングにしっかりとくっつくことを確認します。プレカット濾紙を胚の上に置き、はさみを使って胚の周囲を滑らかに切断する。パスツールピペットを使用して、穏やかな流れを使用して胚の下にPPSを重ね、組織に付着するヨークを空にします。卵子の斜めの角度でゆっくりと胚紙リングを引っ張ります。さらにクリーニングするためにPBSで満たされたペトリ皿に紙を置きます。ヨークの大部分を取り除いたら、胚腹側を寒天と卵形の半固体混合物で覆われた35ミリメートルのペトリ皿に上に置きます。黒い電極をPBSで満たし、胚を内部に置いて、エレクトロポレーションチャンバーを準備します。ガラスマイクロキャピラリーを使用して、所望の領域を覆うエピブラストとビテリン膜の間の空洞に200ナノリットルのmRNAのボーラスを注入します。そして、赤い電極を使用して胚を電気ポレートします。電気ポレートされた胚を寒天アルブミン混合物の上に戻し、所望の発達段階まで摂氏38度でインキュベートする。エレクトロポレーションコード化された蛍光タンパク質のイメージングのために、蛍光解剖ステレオスコープの下ですべての電気ポレート胚を観察し、動的イメージング実験のための最も健康的で最良のエレクトロポレート胚を選択します。他の電気メッキ胚と非電気メッキ胚を別のインキュベーターにインキュベートし続ける。選択した胚をPBSで簡単にすすいで、エレクトロポレーション中に胚の後側に形成された可能性のある気泡を除去する。洗浄された胚を、胚の後部表面に気泡を発生しないように注意して、約150マイクロリットルのアルブミン寒天の薄い層を含むイメージング皿に直接入れます。イメージング皿の内側の端に沿ってティッシュペーパーを巻き上げた小さな湿った部分を追加します。画像化およびインキュベーション中の蒸発を最小限に抑えるために、パラフィンフィルムで皿を密封します。皿を共焦点顕微鏡の前温められた段階に素早く動かし、明視野チャネルを使用して胚の色染料を見つける。イメージングソフトウェアを目的の目的、二色性ミラー、発光スペクトルに設定し、適切なレーザーをオンにします。細胞は、映画全体の画像ビジョンに残ることを注意してください。十分な高いイメージング解像度を使用し、画像処理条件が光毒性を引き起こさないことを確認してください。イメージングソフトウェアでLiveをクリックし、各顕微鏡レーザーパワーに応じて蛍光強度に適した設定にレーザーパワーを調整します。1%レーザーパワーと800ゲインを使用して胚のイメージングを開始し、飽和ピクセルが見えるまでレーザーパワーを1%ずつゆっくりと増加させます。飽和ピクセルが観測されると、飽和ピクセルが可視化されなくなるまでレーザーパワーをわずかに低下させます。イメージングセッション中に胚がアガロースベッドに沈んだ場合に備えて、3~5分ごとに胚を画像化し、エレクトロメッキ領域全体の5マイクロメートルZスタックを使用して、Zスタックの底に向かって余分なスペースを持つ個々の細胞の移動をチェックします。セルの移動速度を観察するには、最初のムービーの最初の数ポイントを確認します。セルが高速で移動している場合は、画像領域のズームを拡大するか、別の領域をイメージングすることを検討してください。胚の電気メッキ領域全体が画像化された場合、同じ胚の無電気メッキ領域における画像は、自己蛍光レベルを決定する。ステレオ顕微鏡上で目的の遺伝子のエレクトロポレーションを確認した後、トランスフェクトされたmRNAを蛍光タンパク質に翻訳できる期間を決定するには、胚を反転共焦点顕微鏡の予熱段階に置き、70%レーザーパワー、100回の反復、および4つのスキャン速度を使用して、エレクトロプレートから蛍光を4回使用します。写真の漂白後に36°Cでステージ上の胚をインキュベートし続け、健康な胚でのみ一般的に見られる光漂白領域内の積極的に分裂する細胞に注意を払い、したがってエレクトロポレーションが胚細胞に害を与えなかったことを示す。電気メッキ領域のポスト漂白剤Zスタック画像を、通常の3〜5分の時間間隔で所望の時間の長さで取得します。イメージング条件が、画像化のためのコントロールとして機能するようにフォトブリーチされていない電気メッキ胚を同時にインキュベートする胚生存に有害な影響を与えないことを保証する。mRNA崩壊後エレクトロポレーションの光漂白結果を定量化するには、ImageJを使用して、各セルのエレクトロメッキ領域の中心にある7.5マイクロメートル円の蛍光強度を測定し、3~5分間の間隔で細胞蛍光を追跡します。有糸分裂を受けておらず、完全に光漂白された光漂白領域内の全ての細胞が測定された場合、胚をフォトブリーチした各時点で経時の漂白後の蛍光強度をプロットする。DNAエレクトロポレーションは一部の電気メッキ細胞において蛍光を明るくするが、広く発現しているmRNAコード化された蛍光タンパク質に比べてDNAエレクトロポレーションの効率は目に見えて低い。同じ胚内のDNAとmRNAの共エレクトロポレーションを比較すると、蛍光タンパク質効率を発現するDNAも、蛍光タンパク質を発現するmRNAのそれと比べて効率が著しく一貫して低い。mRNA、DNA、または2つの組み合わせだけで電気メッキされたすべての胚の定量化は、mRNAが所定の領域の細胞の約75%をトランスフェクトし、DNAは細胞の約25%しかトランスフェクトしならないことを明らかにします。トランスフェクトされたmRNAは、細胞質翻訳機によってmRNAをすぐに認識できるため、トランスフェクトされたDNAに比べてタンパク質産生が速くなるはずです。複数のDNAの共エレクトロポレーションは比較的非効率的であることが以前に示されていましたが、この実験で4つのmRNAのコエレクトロポレーションを行うと、すべての電気メッキ領域内の4つのmRNAすべてについて87%のトランスフェクション効率が得られた。光漂白は、最初は約95%の細胞によって光漂白細胞の蛍光強度を減少させるが、エレクトロポレーションの直後に蛍光タンパク質を分裂し、発現する能力を回復する細胞の一部が残っている。しかし、この能力はエレクトロポレーション後5時間にわたって低下します。最適なイメージング条件を最適化し、必要に応じて調整する準備ができて映画を開始した後も、いじり続けてください。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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mRNAエレクトロポレーションを用いて鳥類胚における複数のタンパク質の迅速かつ効率的な発現

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