Name: 新しいキナーゼタンパク質の堅牢な生化学的アプローチを用いて分子レベルでの特性解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 23 s
Description: 学ぶ新規キナーゼタンパク質の特性解析法。免疫沈降と共沈降実験によりタンパク質相互作用を探索し、γ[32P]ATP標識でキナーゼ活性を測定する。疾患メカニズム解明と創薬標的発見に有用な生化学的手法を習得できる。

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この研究は、ラ・リーグ・コントル・ル・ガン、ラ・アソシエーション・ニューロフィブロマトース、レックリングハウゼン、ラ・レジオン・センター・ヴァル・ド・ロワールによって支援されました。フローサイトメトリーデータのためのオーレリー・コッソンとデボラ・カサス、そして原稿の徹底的な校正のためのキーロン・ヒックマン・ルイスに感謝します。

1. トランスフェクションのための細胞製剤
注意:細胞培養のすべてのステップは、専用の実験室で行う必要があり、細胞はクラス2の微生物学的キャビネット内で操作されます。
<ol><li>種子HEK-293(ヒト胚性腎臓)細胞を10mLのDMEM(ダルベッコの改変イーグルス培地)で10cmプレートに入れ、10%の胎児子牛血清を補充した。5%CO2の下で3〜5日間培養し、37°Cで、細胞が約90%の合流に達するまで。</li>
	<li>コラーゲンRでØ 10 cmプレートを処理し、プラスチックプレートへの細胞接着性を高める。<ol>
<li>コラーゲンRの溶液の5 mLを加え、10cmプレートにリン酸生理食塩分バッファー(PBS)で200倍希釈した。プレートの表面全体に液体をオーバーレイします。</li>
		<li>バイオセーフティキャビネット内で少なくとも1時間室温でインキュベートします。</li>
		<li>コラーゲン溶液を取り出し、捨てます。PBSの5 mLを追加し、プレートの表面全体に広げ、それを削除し、廃棄します。この洗浄を1回繰り返します。</li>
		<li>10%の胎児の子牛の血清を補充したDMEMの8 mLを加える。準備されたプレートは、バイオセーフティキャビネット内に保管してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>バイオセーフティキャビネット内のステップ1.1からHEK-293プレートを取ります。プレートから媒体を取り出し、専用の漂白剤のゴミ箱に捨てます。添加したDMEMの2 mLを追加し、1 mLマイクロピペットの流れを使用してそれらを取り外すために細胞をフラッシュし、泡を作ることを避けるために注意してください。</li>
	<li>15 mLチューブで細胞を収集し、補足DMEMの4 mLを追加します。10mLのピペットで均質化し、上下に3回ピペットを打ち込みます。</li>
	<li>この細胞溶液の2 mLを取り、ステップ1.2.4から補充されたDMEMを含むコラーゲン処理プレートに追加します。</li>
	<li>5%CO2および37°Cでインキュベーターで24時間成長する。細胞はトランスフェクション時に50〜80%のコンフルエントでなければなりません。</li>
</ol>2. 一時的なトランスフェクション
<ol><li>プレートから培地を取り出し、専用の漂白剤ゴミ箱に捨て、新鮮なサプリメントDMEMを10mL加えます。トランスフェクション混合物を調製しながら、37°Cでプレートをインキュベーターに戻します。</li>
	<li>15 mLチューブに、10mMトリス-HCl pH 7.5/1 mM EDTA(トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、エチレンジニトリロテトラセチン酸用EDTA溶液の450 μL、2.5M CaCl2溶液の50μLを添加します。反転によって混合します。</li>
	<li>専用プラスミドで形質転換した細菌の液体培養にミディ製剤から調製したプラスミド系DNA(デオキシリボ核酸)を10μg添加する。反転によって混合します。</li>
	<li>渦上の滑らかな攪拌の下で、BESバッファド生理食塩水2x濃縮物の500 μLを加える(組成:BES、10.7 g/L、NaCl、16.0 g/L、Na2HPO 4、0.27 g/L;BESはN,N-ビス(2-ヒドロキセチル)-2-アミノエタンスルホン酸、N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)タウリンをゆっくりと低下させます。</li>
	<li>バイオセーフティキャビネット内の室温で少なくとも15分間(最大45分)インキュベートします。渦を混ぜないで!DNAとリン酸カルシウムの複雑な形成を妨げないように、チューブを非常に慎重に動かします。</li>
	<li>ステップ2.1から安全キャビネットにプレートを取ります。DNA複合体を非常に慎重に追加し、プレートの表面全体の細胞にドロップしてドロップします。</li>
	<li>インキュベーターで24~72時間インキュベートを37°Cでインキュベートします。通常、最大タンパク質発現は48時間以内に到達する。</li>
</ol>3. リシス
注:氷の上で、そしてタンパク質の劣化を防ぐためにコールドバッファーで作業します。
<ol><li>準備リシスバッファー: 50 mM トリス-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% トリトン X-100, 50 mM NaF, 10 mM ピロリン酸ナトリウム, 1 mM Na3VO4,20 mM p-ニトロフェニルリン酸, 20 mM β-グリセロリン酸, 10 μg/mL アプロチン, 0.0μg/mL、1 μg/mLルペプチン、および1 mM PMSF(フェニルメチルスルホニルフッ化物)。トランスフェクトされたプレートごとに約4mLのリシスバッファーが必要です。</li>
	<li>インキュベーターからトランスフェクトされた細胞を持つプレートを取り出します。氷の上に置いて 注:このステップから、「通常の」ベンチで作業することが可能です。</li>
	<li>メディアを取り外し、専用の漂白剤のゴミ箱に捨てます。</li>
	<li>冷たいPBSの3 mLで2回洗浄する:トランスフェクトされた細胞を取り外すことを避けるために、プレートドロップの側面にPBSの3 mLを追加し、プレートの表面全体に広げ、PBSを除去し、それを廃棄します。この手順をもう一度繰り返します。最後に、次のステップのためのリシスバッファー希釈を防ぐためにプレートを傾けることによって、PBSの残りの部分を慎重に取り除きます。</li>
	<li>トランスフェクト洗浄細胞に500 μLの冷たいリシスバッファーを追加します。プレートの表面全体に広げます。</li>
	<li>氷の上で10分間インキュベートします。時々(少なくとも2回)、プレートの表面全体にバッファを再び広げます。</li>
	<li>細胞をスクラップし、マイクロ遠心管でそれらを収集します。</li>
	<li>4°Cで10,000 x gで10分間遠心分離機。</li>
	<li>新しいマイクロ遠心管で上清を収集します。この画分は、ライサート(全細胞抽出物)に相当する。細胞膜破片に相当するペレットを捨てる。</li>
	<li>この分画のアリコートを新しいマイクロ遠心管(約50μL)に集めます。この画分は、「総画分」または「細胞リサート」または「全細胞抽出物」に対応し、トランスフェクトされたタンパク質がウェスタンブロットによって発現されるかどうかの分析を可能にする。 注: この時点で、サンプルはウェスタン ブロット解析に直接使用できます。Laemmliバッファをサンプルに加え、95°Cで5分間加熱し、10,000 x gで5分間遠心分離し、適切なSDS-PAGEにロードする必要があります。試料は-80°Cで保存することもできる。</li>
</ol>4. 免疫沈殿
<ol><li>適切な抗体と相まってアガロースビーズを穏やかに再中断:HA(ヒトインフルエンザヘマグルチニン)、フラグ、またはGFP(緑色蛍光タンパク質)を滑らかな反転によって再び再び中断する。</li>
	<li>マイクロピペットから200μLの先端の端を切り取り、ビーズが先端に入るようにします。ビーズを上下に数回ピペットし、ビーズの正しいボリュームを取るために先端を飽和させる。</li>
	<li>マイクロ遠心管に40μLのビーズを取ります。</li>
	<li>TENET (30 mM トリス-HCl pH 7.5、120 mM NaCl、5 mM EDTA、1% トリトン X-100) バッファーを追加します。反転によって混合します。4 °Cで1,000 x gで2分間遠心分離機。慎重に上清を取り除き、廃棄します。TENET の 500 μL を追加します。回転ホイール上の4°Cで少なくとも1時間インキュベートします。 注:TENETのこのインキュベーション前のステップは、非特異的相互作用を減らし、バックグラウンド信号を減少させる。</li>
	<li>500 μL のリシスバッファーでビーズを 2 回洗います。<ol>
<li>4°Cで1,000 x gで遠心2分。</li>
		<li>慎重に上清バッファーを取り外し、廃棄します。 注:これらの洗浄手順中にビーズを吸引しないように注意してください。</li>
		<li>500 μL のリシスバッファーを追加します。チューブを反転して均質化します。</li>
		<li>手順 4.5.1 ~ 4.5.3 を繰り返します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>4°Cで1,000 x gで2分間遠心分離機。上清バッファーを慎重に取り外し、廃棄します。</li>
	<li>回転ホイールで4°Cで2~4時間、ステップ3.9からリザートでビーズをインキュベートします。</li>
	<li>免疫沈殿ビーズを洗浄します。 注:この時点で、免疫沈殿ビーズは、ライシスバッファーで5回洗浄し、次にLaemmliバッファーでelemmliを放熱してもよい。溶出物は、ウェスタンブロット分析に使用したり、-80°Cで保存したりしてもよい。あるいは、ビーズは、ライシスバッファーで2回洗浄し、次にキナーゼバッファーで3回洗浄し、γ[32P]ATP標識を行う。</li>
</ol>5. コイノチノシプチ化解析
<ol><li>工程4.7から免疫沈殿ビーズをリシスバッファーで洗浄します。<ol>
<li>4°Cの冷蔵遠心分離機で1,000 x gで2分間遠心分離機。</li>
		<li>上清を慎重に取り除き、捨てます。</li>
		<li>500 μL のリシスバッファーを追加します。チューブを反転して均質化します。</li>
		<li>手順 5.1.1-5.1.3 を 4 回繰り返します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>溶出<ol>
<li>4°Cの冷蔵遠心分離機で1,000 x gで2分間遠心分離機。</li>
		<li>上清を慎重に取り除き、捨てます。ビーズの吸引を避けるためにハミルトン注射器で上清の最後の滴を取り除き、上清を廃棄します。</li>
		<li>4xレームリバッファーの40 μLを加える(200 mMトリス/HCl pH 6.8、4%SDS、40%グリセロール、0.5M β-メルカプトエタノール、0.02%ブロムフェノールブルー)。チューブを軽く叩いて均質化します。</li>
		<li>室温で5分間インキュベートします。</li>
		<li>室温で10,000 x gで5分間遠心分離機。</li>
		<li>ハミルトン注射器で上清を取り出し、新しいマイクロ遠心管に集めます。この画分は、-80°Cで保存するか、またはウェスタンブロットによって直接分析されてもよい「溶出」に対応する。</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. キナーゼアッセイ
<ol><li>キナーゼバッファーを準備する:50 mM HEPES-NaOH pH 7.5(HEPESは4-(2-ヒドロキセチル)-1-ピペラジネエタンスルホン酸を表す)、150 mMNaCl、5mM MgCl 2、5mM MnCl 2、5mM NaF、1mM Na3 VO4、20mmルペプチン、および 1 mM PMSF。各免疫沈殿条件には約2mLのキナーゼバッファーが必要である。</li>
	<li>500 μL のリシスバッファーで、ステップ 4.7 から免疫沈殿ビーズを 2 回洗浄します。<ol>
<li>4°Cの冷蔵遠心分離機で1,000 x gで2分間遠心分離機。</li>
		<li>上清を慎重に取り除き、捨てます。500 μL のリシスバッファーを追加します。反転によって均質化します。</li>
		<li>手順 6.2.1 と 6.2.2 を繰り返します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>500 μL のキナーゼバッファーで免疫沈殿ビーズを 3 回洗浄します。<ol>
<li>4°Cの冷蔵遠心分離機で1,000 x gで2分間遠心分離機。</li>
		<li>上清を慎重に取り除き、捨てます。キナーゼバッファーを500μL追加します。反転によって均質化します。</li>
		<li>手順 6.3.1 と 6.3.2 を 2 回繰り返します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>4°Cの冷蔵遠心分離機で1,000 x gで2分間遠心分離機。</li>
	<li>上清を慎重に取り除き、捨てます。ビーズの吸引を避けるためにハミルトン注射器で上清の最後の滴を取り除き、上清を廃棄します。</li>
	<li>免疫沈殿ビーズに40μLのキナーゼバッファーを添加します。チューブを軽くたたいてビーズを再び吊り下げます。</li>
	<li>γ[32P]ATP標識(最終容積は22.5μL、キナーゼバッファーを完備)のミックスを安全なロックチューブに用意します。<ol>
<li>22.5 μL の最終体積に達するために、キナーゼバッファの必要な体積を追加します。</li>
		<li>マイクロピペットの20 μL先端の端を切る。ステップ6.6から免疫沈殿ビーズを数回上下にピペッティングして再中断する。これらのビーズの10 μLを安全ロックチューブに集めます。</li>
		<li>10 μM ストック溶液から ATP を追加し、フィナーレ濃度の 50 mM に達します。処理されたサンプルの数に応じて、キナーゼバッファー内のATPのストック溶液の希釈は、体積が正しいことを確認するためにピペット1~2μLを可能にすることを示唆している。</li>
		<li>基板の2.5 μgを加える(コフィリンまたはミエリン塩基タンパク質、本研究例ではMBP)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>γ[32P]ATP(3,000 Ci/mmol)の5 μCiを加えて反応を開始します。ゆっくりと上下にピペッティングして混ぜます。 注意:この時点から、作業は、慎重な予防措置、専用の保護と適切な制御(放射性シールド、ガイガーカウンター、特定の廃棄物収集、個人の胸とと適切な制御と放射能操作専用の安全場所で行う必要があります。放射性暴露を検出するための指バッジ、フィルターチップ)。</li>
	<li>30°Cで20分間インキュベートします。</li>
	<li>5x Laemmliバッファーの6 μLで反応を停止します。</li>
	<li>95°Cで5分間熱します。</li>
	<li>室温で5分間10,000 x gの遠心分離機。</li>
	<li>SDS-PAGE にロードします。移行に進みます。 注:フリーγ[32 P]ATPの最前線が移行タンクの汚染を避けるためにゲルから出ないことに注意してください。</li>
	<li>ゲルを室温で染めます。<ol>
<li>ガラス板からゲルを取り出します。</li>
		<li>室温で3つの水浴を進めます。</li>
		<li>室温でクマシーブルーで一晩ゲルを染めます。</li>
		<li>温度で水でいくつかの洗浄浴でゲルを汚します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ゲルをラップで包みます。</li>
	<li>蛍光体の画面上で1泊以上露出します。</li>
	<li>リンメージャーの画面を読み取り、ラベル付きバンドを検出します。</li>
</ol>

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</ol>

著者は何も開示していない。

本明細物では、我々は、その配列およびそのホモログ、LIMK2aおよびLIMK2b20に基づいてキナーゼであると考えられる新しいタンパク質LIMK2-1を分子レベルで特徴付けるために堅牢な生化学的ツールを使用した。
まず、特定の抗体を用いたウエスタンブロット分析を用いてタンパク質レベルでLIMK2-1の存在を実証した。その後、LIMK2aとLIMK2bを調節することが知られている上流のキナーゼROCK1との相互作用を評価した。最後に、特定のホスホ抗体を用いて、インビトロγ[32P]ATP標識およびウエスタンブロットによるセルロ中のLIMK2-1の潜在的なキナーゼ活性を評価した。
リシスバッファー組成 ウエスタンブロットでタンパク質を分析するためにタンパク質を研究する場合、リシスバッファー組成に関しては特に注意が必要です。いくつかのパラメータを考慮する必要があります:(i)洗剤タイプおよび濃度21、</...

何十年もの間、多数のシグナル伝達経路が解明され、細胞分裂、分化、運動性、プログラムされた細胞死、免疫および神経生物学などの重要な細胞プロセスへの関与が示されている。キナーゼは、多くの場合、活性化または不活性化を細かく調節し、外部刺激1、2、3に応答する一過性汎用性の高い複合体の一部であるとして、これらのシグナル伝達経路において重要な役割を果たす。キナーゼの突然変異および調節不変は、しばしばヒトの疾患を引き起こすため、過去40年間で最も重要な薬物標的の一つとなっている4.
この文脈では、上流のレギュレータや下流の基板とのキナーゼ相互作用を検出し、新しいパートナーを特定できることが重要です。アフィニティ精製および免疫沈殿は、タンパク質複合体5の単離のための非常に強力な技術である。餌タンパク質またはキナーゼは、ペプチドを標的とする抗体と共有結合した市販ビーズの使用を可能にする特定のペプチド配列でタグ付けされてもよい。この材料は実験6、7、8の高い再現性を可能にする。内因性タンパク質は、餌タンパク質を直接標的とする抗体を用いて免疫沈殿することもできる。抗体は、タンパク質Aまたはタンパク質Gアガロースビーズに架橋されるか、または単にリサートを添加する前にこれらのビーズでインキュベートされてもよい。溶解バッファーは、相互作用を失うことなくタンパク質可溶化を可能にし、タンパク質の劣化を避けるために最適化する必要があります。このアプローチの主な欠点は、相互作用が細胞リシス時に検出されるということです。したがって、一時的または弱い相互作用は、細胞内のコンテキストを必要とする相互作用と共に見逃される可能性があります。その他の技術は、近接リゲーションアッセイ(PLA)9、生体内架橋支援親和性精製(XAP)10、生物発光共鳴エネルギー伝達(BRET)またはフェルスター共鳴エネルギーなどの細胞で直接働くために使用することができる。転送 (FRET)11,12.さらに、免疫沈殿は、表面プラズモン共鳴、イソテル微量カロリーム、マイクロスケール熱泳動などの物理的な技術が必要とされる結合の熱力学的定数を決定することは適切ではありません。13、14.
キナーゼ活性は、複数の技術を用いて評価されてもよい。本明細損では、ホスホ特異的抗体およびインビトロγ[32P]ATP(アデノシン三リン酸)標識に焦点を当てた。リン特異的抗体は、タンパク質内の特定の残留物のリン酸修飾を標的とする。それらは、細胞リシス後のウェスタンブロットまたはELISA(酵素結合免疫ソルベントアッセイ)、免疫組織化学、およびフローサイトメトリーまたは免疫蛍光を用いた無傷の細胞に使用することができる。彼らの欠点は、標的タンパク質の変異バージョンを使用して評価することができ、特異性の欠如を含むことができ、およびそれらのすべてのタンパク質に市販されていない。インビトロγ[32P]ATP標識は、非常に堅牢で、確立された、高感度な方法15である。免疫沈殿タンパク質または組換えタンパク質を使用して、異なる基質を試験してもよい。薬物の効果は、この方法が定量的であるとしても評価されてもよい。その主な欠点は、アプローチに関連する放射能は慎重に処理する必要がある点です。蛍光または発光ペプチド基質の測定に基づいて、リン酸化時に変化した蛍光/発光特性を利用する代替方法も可能です。このような方法はまた、高いスループットを可能にし、これは、例えば、標的キナーゼの潜在的な阻害剤でありうって可能な分子のスクリーニングにおいて必要とされる。実際、キナーゼは製薬会社16が追求する最大級の薬剤標的の1つである。
本研究では、LIMK2-1タンパク質(LIMK2-1はLin11、アイル1、Mec3キナーゼアイソフォーム2-1を表す)に着目した。LIMK2キナーゼタンパク質は、1995年17月に最初に記載された。LIMK2の3つのアイソフォームは、LIMK2a、LIMK2bおよびLIMK2-1の代替スプライシングによって生成される。現時点では、LIMK2-1は単一の研究18においてmRNAレベルでのみ記載されている。本明細物では、堅牢な生化学的アプローチを用いて、この潜在的な新しいキナーゼタンパク質を分子レベルで特徴付ける。まず、LIMK2-1が実際に合成されたことを示す。LIMK2aおよびLIMK2bの2つの対応するのと同様に、上流のキナーゼROCK(Rho関連タンパク質キナーゼ)と相互作用する。LIMK2-1はミエリン基本タンパク質(MBP)にキナーゼ活性を有するが、LIMキナーゼの正規基質であるコフィリンには活性を示す。

<table><tbody><tr><td>ウェスタンブロット用</td><td>抗体抗アクチン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1978</td></tr><tr>ウェ<td>スタンブロット</td><td>用抗体抗c-Myc</td><td>Invitrogen</td><td>MA1-21316</td> ウェスタンブロット</tr><tr><td>用抗体抗コフィリン</td><td>細胞シグナル技術</td><td>3312/5175</td><td>ウェスタンブロット</td></tr>用<tr><td>抗GFP</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-9996</td><td>ウェスタンブロット</td></tr><tr><td>用抗体 抗HA</td><td>ロシュウェ</td><td>スタンブロット</td>抗体の応用科学<td>11687423001</td></tr><tr><td>抗リン酸化コフィリン</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>3313</td><td>ウェスタンブロット</td></tr><tr><td>抗体 抗PP1i</td><td>Eurogentec</td><td>この研究のために設計されました</td><td>ウエスタンブロット</td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Euromedex</td><td>A-162B</td><td>溶解バッファー用</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Invitrogen</td><td>PV3227</td><td>for &#947;[32P]ラベリング</td></tr><tr><td>&#947;[32P] ATP</td><td>パーキン・エルマー</td><td>NEG502A</td><td>for &#947;[32P]ラベリング</td></tr><tr><td>BES緩衝生理食塩水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14280</td><td>のトランスフェクション</td></tr><tr><td>用&#946;-グリセロリン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9422</td>の<td>溶解およびキナーゼ緩衝液</td></tr><tr><td>用&#946;-メルカプトエタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td>のLaemmli</td></tr><tr><td>BSA</td><td>用Sigma-Aldrich</td><td>A3059</td>ブロッキング<td>バッファー</td></tr><tr><td></td><td></td><td>Laemmli</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td> トランス<td>フェクション用</td></tr><tr><td>ブロ</td><td></td>モフェノールブルー <td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr> B0126 コラーゲン <tr><td>R</td><td>Pan Biotech</td><td>P06-20166</td><td>トランスフェクション</td></tr><tr><td>用 Control siRNA</td><td>Ambion</td><td>AM4611</td><td>PP1i 抗体特異性</td></tr><tr><td>Coomassie PageBlue タンパク質染色液</td><td>Thermo-Fisher</td><td>24620</td><td>ゲル染色用</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3690</td><td>溶解バッファー用</td></tr><tr><td>電気泳動ユニット</td><td>Biorad</td><td>Mini-Protean</td><td>ウェスタンブロット用</td></tr><tr><td>EZview Red 抗HAアフィニティーゲル</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6779</td><td>免疫沈降用</td></tr><tr><td>GeneSysソフトウェア</td><td>Ozyme</td><td></td><td>ウェスタンブロット取得用</td></tr><tr><td>GeneTollsソフトウェア</td><td>Ozyme</td><td></td><td>ウェスタンブロット定量用</td></tr><tr><td>GFPトラップビーズ</td><td>Chromtek</td><td></td><td>免疫沈降用</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Euromedex</td><td>26-128-6405</td><td>転写バッファー用</td></tr><tr><td>GST-cofilin</td><td>Upstate Cell signaling</td><td>12-556</td><td>for &#947;[32P] ラベリング</td></tr><tr><td>ハミルトンシリンジ 100 mL</td><td>ハミルトン</td><td>710</td> ビーズ<td>の上清を吸引せずに慎重に除去</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>H3375</td><td>キナーゼバッファー用</td></tr><tr><td>ImageQuant TL ソフトウェア</td><td>GE ヘルスケア</td><td></td><td>放射能取得・定量用</td></tr><tr><td>LIMK2 siRNA</td><td>アンビオン</td><td>s8191</td><td>PP1i抗体特異性</td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SP-04-2217</td><td>溶解およびキナーゼバッファー</td></tr><tr><td>MBP</td><td>Upstate Cell signaling</td><td>13-173</td><td>for &#947;[32P] 標識</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td> キ<td>ナーゼバッファー</td></tr><tr>用<td>MnCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244589</td> キ<td>ナーゼバッファー</td></tr>用 <tr><td>NaCl</td><td>Euromedex</td><td>1112</td><td>溶解用 NaF</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-1504</td> 溶解<td>およびキナーゼバッファー</td>用</tr><tr><td>Okaidic酸</td><td>Euromedex</td><td>0-2220</td><td>溶解バッファー用</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>78830</td><td>溶解およびキナーゼバッファー用</td></tr><tr><td>p-ニトロフェニルリン酸</td><td>Euromedex</td><td>1026</td><td>溶解バッファー用</td></tr><tr><td>PVDF 膜 Immobillon-P</td><td>メルク-ミリポア</td><td>IPVH00010孔径 0.45 mm</td><td>ウェスタンブロット用</td></tr><tr><td>回転ホイール</td><td>ラビンコ</td><td></td> ビーズ<td>インキュベーション用</td></tr><tr><td>安全ロック エッペンドルフ</td><td>エッペンドルフ</td><td>0030120.086</td><td>キナーゼアッセイ用</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5030</td><td>Laemmli および移行バッファー用</td></tr><tr><td>オルトバナジン酸ナトリウム</td><td>LC ラボラトリーズ</td><td>S8507</td><td>溶解およびキナーゼバッファー用</td></tr><tr><td>ピロリン酸ナトリウム</td><td>Fluka</td><td>71501</td><td>溶解バッファー用</td></tr><tr><td>スーパーシグナル ウェストデュラ</td><td>タンパク質生物学</td>ウェ<td>スタンブロット</td>用<td>34075</td></tr><tr><td>Syngene Pxi</td><td>Ozyme</td><td></td><td>(ウェスタンブロット</td></tr><tr><td>用) Tissue抽出物 &nbsp;</td><td>Biochain &nbsp;</td><td>P1234035 脳 P12345152 肺 P1234149 肝臓 P1234188 膵臓 P1234260 ウェ</td><td>スタンブロット解析用精巣 &nbsp;</td></tr><tr><td>トランスファーユニット</td><td>Biorad</td><td>Mini-Trans-Blot</td><td>for Western Blot</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Euromedex</td><td>26-128-3094 B</td><td>溶解バッファー用</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949</td><td>ブロッキングバッファー</td></tr><tr><td>用 台風 FLA9500</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>オートラジオグラフィーを読み取る</td></tr><tr><td>Typhoon Trio</td><td>Amersham Bioscience</td><td></td><td>オートラジオグラフィーを読み取る</td></tr><tr><td>ウェスタンブロット用</td><td>Whatman</td><td>ペーパーGEヘルスケア</td><td>3030-672</td></tr></tbody></table>

新しいキナーゼタンパク質の堅牢な生化学的アプローチを用いて分子レベルでの特性解析

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

広範な全ゲノムシーケンシングは、多くの潜在的なタンパク質を提供する多くのオープンリーディングフレーム(ORF)を同定しました。これらのタンパク質は、細胞に重要な役割を持ち、新しい細胞プロセスを解明する可能性があります。タンパク質の中でも、キナーゼは細胞シグナル伝達経路に属し、細胞の成長、分裂、分化、運動性、死など、細胞の運命に不可欠な多くのプロセスをオンまたはオフにする能力を持つ主要なアクターです。
本研究では、新しい潜在的なキナーゼタンパク質LIMK2-1に着目した。我々は、特定の抗体を用いてウェスタンブロットがその存在を実証した。我々は、共免疫沈殿実験を用いて上流調節タンパク質との相互作用を評価した。共免疫沈殿は、2つの標的タンパク質間の相互作用を検出できる非常に強力な技術です。また、餌タンパク質の新しいパートナーを検出するために使用されてもよいです。餌タンパク質は、その配列に対して設計されたタグを介して、またはそれを特異的に標的とする抗体を介して精製されてもよい。これらのタンパク質複合体は、SDS-PAGE(ナトリウムドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル)によって分離され、質量分析法を用いて同定され得る。免疫沈殿LIMK2-1はまた、γ[32P]ATP標識によってインビトロでのキナーゼ活性を試験するためにも使用された。この確立されたアッセイは、多くの異なる基板を使用し、また、餌の変異バージョンを使用して、特定の残基の役割を評価するために使用され得る。薬理学的薬剤の効果は、この技術は、非常に敏感かつ定量的であるため、評価されることもできます。それにもかかわらず、放射能処理には特に注意が必要です。キナーゼ活性はまた、修飾アミノ酸のリン群を標的とする特異的抗体で評価されてもよい。これらの種類の抗体は、すべてのリン修飾残渣について市販されているわけではない。

LIMK2-1タンパク質を合成 LIMK2-1はデータバンクで言及されているが、これまでのところ、そのmRNA18の存在を示した論文は1つしかない。LIMK2aおよびLIMK2bの2つのホモログと比較して、LIMK2-1はタンパク質ホスファターゼ1阻害ドメイン(PP1i)として同定された余分なC末端ドメインを有する。このドメインのペプチドを標的とする抗体を設計し、アミノ酸671-684(図1A)を挙げた。 ヒトタンパク質データベースに対するBLAST研究は、PHI-1(ホスファターゼホロエンザイム阻害剤1)のみが、この12アミノ酸配列と強い配列類似性を有することを示した。しかし、PHI-1は、LIMK2-1から遠く離れたSDS-PAGEゲル上の23 kDaで移行し、約75kDaの移行が予想されます(つまり、2つは干渉してはならない)。我々は、LIMK2-1、LIMK2a、またはLIMK2bのいずれかでトランスフェクトされ...

我々は、堅牢な生化学的アプローチを用いた新しいキナーゼタンパク質を特徴付けた:異なる細胞株および組織上の専用の特異的抗体を用いたウェスタンブロット分析、共免疫沈殿実験による相互作用、西洋で検出されたキナーゼ活性ホスホ特異的抗体およびγ[32P]ATP標識を用いたブロット。

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

免疫沈降は、標的タンパク質を単離して精製する非常に強力な技術です。平滑な条件では、タンパク質、調節剤、または基質が共免疫沈降され得る。その後、新しいインタラクションネットワークが検出される可能性があります。免疫沈降タンパク質の活性も評価され得る。特に、キナーゼの活性は、P32-ATP標識によって異なる基質上で試験され得る。それにもかかわらず、疾患に関与するキナーゼを標的とする阻害剤の活性は評価され得る。彼らは新薬を開発する鉛化合物を構成する可能性があります。.この方法は、哺乳類から酵母または細菌に拡張することができます。このテクニックは難しいものではありません。キーポイントへ:検出された相互作用が特異的であることを確認するために否定的なコントロールを持っていることを確認し、相互作用と活動を維持するために慎重にlysis条件を選択します。このテクニックの成功を確実にするためには、細部やジェスチャーが重要であり、記事の資料や方法では決して記述されていない。手順を実証することは、私たちの研究室の技術者であるファビエンヌ・ゴディンです。細胞がバイオセーフティキャビネット内の細胞培養室で調製された後、10ミリリットルのピペットを使用してプレートから培地を取り出し、漂白剤付きの専用の廃棄物ボトルに捨てます。その後、新鮮な補充DMEMの10ミリリットルを追加し、37°Cでインキュベーターに戻します。トランスフェクション混合物を調製するために、15ミリリットルチューブに、pH 7.5で10ミリモルトリス塩酸塩溶液の450マイクロリットルを加え、1ミリモルEDTAと2.5モル塩化カルシウム溶液の50マイクロリットルを補った。反転によって混ぜる。チューブに、10マイクログラムの血漿DNAに相当する体積を加え、DNAミディプレップキットで増幅し、このキットの溶出バッファーで希釈し、その濃度が決定された。チューブを反転して混ぜます。次に、ボルテックスミキサーでの滑らかな撹拌で、500マイクロリットルのBES緩衝生理食塩水2X濃縮物をゆっくりと加え、チューブに滴下する。DNAとリン酸カルシウムの間の複雑な形成を妨げないように、非常に慎重に移動します。室温で少なくとも15分間、または最大45分間インキュベートする。次に、プレートをインキュベーターから安全キャビネットにトランスフェクトに移します。調製したDNA複合体をプレートの表面全体の細胞に滴下して追加します。37°Cでインキュベーターで24〜72時間インキュベート。タンパク質の分解を防ぐために、各トランスフェクトプレートに4ミリリットルのリシスバッファーを考慮して、氷上のリシスバッファーを調製します。インキュベーターからトランスフェクションされた細胞でプレートを取ります.メディアを取り出し、専用の漂白剤廃棄物ボトルに捨てます。細胞を洗浄するには、プレートの側面に3ミリリットルの冷たいPBSを滴下して添加し、トランスフェクトされた細胞を剥離することを避ける。そして、緩衝液を表面全体に広げるためにプレートをそっと旋回させます。プレートを傾けてPBSを取り除き、廃棄物ボトルに捨てます。もう一度洗い方を繰り返します。プレートを氷の上に置きます。最後に、PBS の残りの部分を慎重に削除します。次に、500マイクロリットルの冷たいライシスバッファーを、トランスフェクトされた洗浄された細胞に加える。プレートの表面全体に広げます。氷の上で10分間インキュベートします。時々、再びプレートの表面全体にバッファーを広げます。その後、セルスパチュラを使用して細胞を表面から削り取り、マイクロ遠心チューブに集めます。10,000倍Gと摂氏4度で10分間遠心分離機。上清のライセートを新しいマイクロ遠心チューブに集め、この分画の50マイクロリットルのアリコートを別の新しいマイクロ遠心管に集めます。このアリコートは、トランスフェクトされたタンパク質が十分に発現しているかどうかを確認するために使用されます。ゴミ箱にペレットを捨てます。まず、アガロースビーズのストック溶液を適切な抗体と結合して緩やかに再懸濁する。200マイクロリットルの先端を切って1~2ミリメートルの開口部を作ります。チップをマイクロピペットに取り付け、溶液を40マイクロリットルに引き出し、ビーズが先端に入るようにします。ビーズを数回上下にピペットして、チップを飽和させ、ビーズの正しい量を確保し、ビーズをマイクロ遠心チューブに移します。TNETバッファーの500マイクロリットルを追加し、反転によって混合し、遠心分離機は1,000倍Gと摂氏4度で2分間。上清を慎重に取り出し、500マイクロリットルのTNETバッファーを追加します。回転ホイールで摂氏4度で少なくとも1時間インキュベートします。その後、チューブを1,000倍Gと摂氏4度で2分間遠心し、反転と遠心分離により500マイクロリットルのリシスバッファーでビーズを2回洗浄します。洗浄後、以前に採取した総分率のライセートをチューブに移し、摂氏4度の回転ホイールで2〜4時間インキュベートします。さて、免疫沈降ビーズを含むチューブを1,000倍Gおよび摂氏4度で2分間遠心分離する。ビーズを500マイクロリットルのリシスバッファーで5回洗浄し、反転と遠心分離を行います。ビーズを洗うときは、上清を取り除きながらビーズから近づきすぎないように注意してください。さもなければ、ビーズは吸引され、実験の終わりにビーズはもう残らない。溶出のために、最初の遠心分離機は1,000倍Gと摂氏4度で2分間。上清を慎重に取り除くために1ミリリットルのマイクロピペットを使用してください。その後、セメント針を装備したハミルトン注射器で、ビーズの吸引を避けるために上清の最後の滴を取り除きます。次に、4Xレムリバッファーの40マイクロリットルを加えます。管を軽く叩いて均質化します。室温で5分間インキュベートします。その後、遠心分離機をGの10,000倍と室温で5分間行う。ハミルトンシリンジで、上清溶出物を新しいマイクロ遠心チューブに移します。マイナス80度で保管してください。HEK-293細胞は、タグなしLIMK 2-1またはLIMK 2のHAタグ付きアイソフォームの1つをトランスフェクトした。LIMK 2-1は、異なる条件でよく表現されます。抗LIMK 2-1抗体は、LIMK 2aおよびLIMK 2bアイソフォームを認識せず、細胞がLIMK2にトランスフェクトされるとシグナルが減少し、小さな干渉RNAを制御するのと比較して特異的である。様々なヒト細胞株において、LIMK 2-1はHEK-293およびHeLaで発現しているように見えたが、C6では発現していない。LIMK2-1と上流キナーゼROCKとの相互作用を評価するために、コイムノ沈降実験を用いた。トランスフェクトされたベクターによってコードされる異なるタンパク質のそれぞれは、よく発現していた。LIMK2の3つのアイソフォームは、larp6と同様に、効率的に免疫沈降した。溶出物では、ROCKが検出され、LIMK2の3つのアイソフォームで共免疫沈降したが、larp6では検出されなかった。検出された相互作用は、特定の操作です。コイムノ沈降LIMK 2-1は、ガンマP32 ATP標識を介してキナーゼ活性について試験した。LIMK 2-1はコフィリンをリン酸化しなかったのに対し、ミエリン塩基性タンパク質、またはMBPをリン酸化した。LIMK 2-1は、この試験で効率よく免疫沈降します。免疫沈降を行いながら陰性制御を行い、相互作用が特異的であることを確認することが重要です。ライシスバッファーの組成は、相互作用と活動を維持するために慎重に設定する必要があります。免疫沈降の際、キナーゼ活性は異なる基質をカウントするように評価され得る。突然変異は容易に導入され、特定の残基の役割を解明し得る。機能研究はまた、新たに強調された相互作用の生理学的役割を理解するために行われてもよい。細胞は、バイオセーフティキャビネット内の専用培養室で培養する必要があります。P32 ATP は、特定の注意を払って処理する必要があります。放射線から保護するためのシールド、ガイガーカウンター、特定の廃棄物の収集、個人の胸と指のバッジは、放射能暴露とフィルターの先端を検出します。

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ロイシンリッチリピートキナーゼ2は、大規模なマルチドメインのキナーゼ、パーキンソン病の最も一般的な遺伝的原因であるの変異です。このタンパク質のキナーゼ活性の分析は、このタンパク質の生物学と機能障害を理解する上で重要なツールであることが証明されている。本論文では、...

LRRK2のキナーゼ活性を測定する in vitroで</em

ほぼ全Sを含むタンパク質マイクロアレイを用いて、 セレビシエプロテオームは、並行して、タンパク質-タンパク質相互作用の何千もの迅速公正な尋問のためにプローブされます。この方法は、タンパク質 - 小分子、翻訳後修飾、およびハイスループットの他のアッセイに利用することができます。...

タンパク質 - タンパク質相互作用を検出するために、高密度機能タンパク質マイクロアレイのプロービング

タンパク質のリン酸化は、細胞が細胞外の環境における情報を解釈し、それに対してどのように反応するかの中心的な特徴です。ここでは、哺乳類細胞から精製したキナーゼを使用して、目的の基質をリン酸化するキナーゼを迅速に同定するためのハイスループットスクリーニングプロトコルを紹介します。...

ハイスループットスクリーニングを使用したキナーゼ基質ペアの同定

プロテインキナーゼは高度に進化したシグナリング酵素であり、細胞間および細胞内シグナル伝達にとって重要な足場である。本発明者らは、細胞シグナル伝達調節の解明を助ける信頼できる方法である放射性標識アデノシン三リン酸（[γ- 32 P] ATP）の使用によるキナーゼ活性を測定するためのプロトコールを提示する。...

放射性標識ATPによるタンパク質キナーゼ活性のアッセイ

このプロトコルは、細胞分化およびアフリカツメガエル胚発生の間にマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（MAPK）活性を調節するための光発生戦略を記載する。この方法は、哺乳動物細胞培養物およびアフリカツメガエル胚のような多細胞生きている生物において、高い空間的および時間的分解能を有するMAPKシグナル伝達経路の可逆的活性化を可能にする。...

細胞分化中のマイトジェン活性化プロテインキナーゼ経路の光媒介可逆的調節<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;胚発生

サイクリン依存性キナーゼ 1 (Cdk1) 細胞周期 G2 段階で活性化し、多くの細胞経路を調節します。この重要なキナーゼの細胞内標的を確立するため Cdk1 固有のリン酸化部位の同定を可能にする Cdk1...

サイクリン依存性キナーゼ 1 の同定の in Vitroキナーゼによって特定のリン酸化のサイトの試金します。

このプロトコルの目的は、ラベル、豊かにする、および特定蛋白質キナーゼ CK2 細胞ライセートや組織ホモジネートなど複雑な生物的サンプルからの基板です。このメソッドは、この目的のため CK2...

多彩な生化学的アプローチを用いた新規 CK2 キナーゼ基板の識別

タンパク質キナーゼAの活動を可視化する手順を提示し、マウスの頭部固定、振る舞いをする。改良されたA-キナーゼ活性レポーターtAKARαは皮質ニューロンで発現され、頭蓋の窓を通してイメージングのためにアクセス可能にされる。2光子蛍光寿命イメージング顕微鏡は、強制移動中の生体内でのPKA活性を可視化するために使用されます。...

生体内での2光子蛍光寿命イメージング顕微鏡を用いて頭固定振る舞いマウスにおけるタンパク質キナーゼの活動を可視化する

本稿では、インビトロキナーゼアッセイ、RAF共活性化アッセイ、および相補的なスプリットルシフェラーゼアッセイを含む、RAFファミリーキナーゼの疾患関連変異体を特徴付けるための実用的かつ実行可能な方法のセットを提示した。...

実用的で実現可能な方法のセットを使用してRAFファミリーキナーゼの疾患関連変異体を特徴付けます

キナーゼ阻害剤のスクリーニングのための自己組み立てヒトタンパク質マイクロアレイの生成のための詳細なプロトコルが提示される。...

自己組み立てヒトタンパク質マイクロアレイにおけるキナーゼ阻害剤スクリーニング

学ぶ新規キナーゼタンパク質の特性解析法。免疫沈降と共沈降実験によりタンパク質相互作用を探索し、γ[32P]ATP標識でキナーゼ活性を測定する。疾患メカニズム解明と創薬標的発見に有用な生化学的手法を習得できる。

新しいキナーゼタンパク質の堅牢な生化学的アプローチを用いて分子レベルでの特性解析

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