新しいキナーゼタンパク質の堅牢な生化学的アプローチを用いて分子レベルでの特性解析

免疫沈降は、標的タンパク質を単離して精製する非常に強力な技術です。平滑な条件では、タンパク質、調節剤、または基質が共免疫沈降され得る。その後、新しいインタラクションネットワークが検出される可能性があります。

免疫沈降タンパク質の活性も評価され得る。特に、キナーゼの活性は、P32-ATP標識によって異なる基質上で試験され得る。それにもかかわらず、疾患に関与するキナーゼを標的とする阻害剤の活性は評価され得る。

彼らは新薬を開発する鉛化合物を構成する可能性があります。.この方法は、哺乳類から酵母または細菌に拡張することができます。このテクニックは難しいものではありません。

キーポイントへ:検出された相互作用が特異的であることを確認するために否定的なコントロールを持っていることを確認し、相互作用と活動を維持するために慎重にlysis条件を選択します。このテクニックの成功を確実にするためには、細部やジェスチャーが重要であり、記事の資料や方法では決して記述されていない。手順を実証することは、私たちの研究室の技術者であるファビエンヌ・ゴディンです。

細胞がバイオセーフティキャビネット内の細胞培養室で調製された後、10ミリリットルのピペットを使用してプレートから培地を取り出し、漂白剤付きの専用の廃棄物ボトルに捨てます。その後、新鮮な補充DMEMの10ミリリットルを追加し、37°Cでインキュベーターに戻します。トランスフェクション混合物を調製するために、15ミリリットルチューブに、pH 7.5で10ミリモルトリス塩酸塩溶液の450マイクロリットルを加え、1ミリモルEDTAと2.5モル塩化カルシウム溶液の50マイクロリットルを補った。

反転によって混ぜる。チューブに、10マイクログラムの血漿DNAに相当する体積を加え、DNAミディプレップキットで増幅し、このキットの溶出バッファーで希釈し、その濃度が決定された。チューブを反転して混ぜます。

次に、ボルテックスミキサーでの滑らかな撹拌で、500マイクロリットルのBES緩衝生理食塩水2X濃縮物をゆっくりと加え、チューブに滴下する。DNAとリン酸カルシウムの間の複雑な形成を妨げないように、非常に慎重に移動します。室温で少なくとも15分間、または最大45分間インキュベートする。

次に、プレートをインキュベーターから安全キャビネットにトランスフェクトに移します。調製したDNA複合体をプレートの表面全体の細胞に滴下して追加します。37°Cでインキュベーターで24〜72時間インキュベート。

タンパク質の分解を防ぐために、各トランスフェクトプレートに4ミリリットルのリシスバッファーを考慮して、氷上のリシスバッファーを調製します。インキュベーターからトランスフェクションされた細胞でプレートを取ります.メディアを取り出し、専用の漂白剤廃棄物ボトルに捨てます。

細胞を洗浄するには、プレートの側面に3ミリリットルの冷たいPBSを滴下して添加し、トランスフェクトされた細胞を剥離することを避ける。そして、緩衝液を表面全体に広げるためにプレートをそっと旋回させます。プレートを傾けてPBSを取り除き、廃棄物ボトルに捨てます。

もう一度洗い方を繰り返します。プレートを氷の上に置きます。最後に、PBS の残りの部分を慎重に削除します。

次に、500マイクロリットルの冷たいライシスバッファーを、トランスフェクトされた洗浄された細胞に加える。プレートの表面全体に広げます。氷の上で10分間インキュベートします。

時々、再びプレートの表面全体にバッファーを広げます。その後、セルスパチュラを使用して細胞を表面から削り取り、マイクロ遠心チューブに集めます。10,000倍Gと摂氏4度で10分間遠心分離機。

上清のライセートを新しいマイクロ遠心チューブに集め、この分画の50マイクロリットルのアリコートを別の新しいマイクロ遠心管に集めます。このアリコートは、トランスフェクトされたタンパク質が十分に発現しているかどうかを確認するために使用されます。ゴミ箱にペレットを捨てます。

まず、アガロースビーズのストック溶液を適切な抗体と結合して緩やかに再懸濁する。200マイクロリットルの先端を切って1~2ミリメートルの開口部を作ります。チップをマイクロピペットに取り付け、溶液を40マイクロリットルに引き出し、ビーズが先端に入るようにします。

ビーズを数回上下にピペットして、チップを飽和させ、ビーズの正しい量を確保し、ビーズをマイクロ遠心チューブに移します。TNETバッファーの500マイクロリットルを追加し、反転によって混合し、遠心分離機は1,000倍Gと摂氏4度で2分間。上清を慎重に取り出し、500マイクロリットルのTNETバッファーを追加します。

回転ホイールで摂氏4度で少なくとも1時間インキュベートします。その後、チューブを1,000倍Gと摂氏4度で2分間遠心し、反転と遠心分離により500マイクロリットルのリシスバッファーでビーズを2回洗浄します。洗浄後、以前に採取した総分率のライセートをチューブに移し、摂氏4度の回転ホイールで2〜4時間インキュベートします。

さて、免疫沈降ビーズを含むチューブを1,000倍Gおよび摂氏4度で2分間遠心分離する。ビーズを500マイクロリットルのリシスバッファーで5回洗浄し、反転と遠心分離を行います。ビーズを洗うときは、上清を取り除きながらビーズから近づきすぎないように注意してください。

さもなければ、ビーズは吸引され、実験の終わりにビーズはもう残らない。溶出のために、最初の遠心分離機は1,000倍Gと摂氏4度で2分間。上清を慎重に取り除くために1ミリリットルのマイクロピペットを使用してください。

その後、セメント針を装備したハミルトン注射器で、ビーズの吸引を避けるために上清の最後の滴を取り除きます。次に、4Xレムリバッファーの40マイクロリットルを加えます。管を軽く叩いて均質化します。

室温で5分間インキュベートします。その後、遠心分離機をGの10,000倍と室温で5分間行う。ハミルトンシリンジで、上清溶出物を新しいマイクロ遠心チューブに移します。

マイナス80度で保管してください。HEK-293細胞は、タグなしLIMK 2-1またはLIMK 2のHAタグ付きアイソフォームの1つをトランスフェクトした。LIMK 2-1は、異なる条件でよく表現されます。

抗LIMK 2-1抗体は、LIMK 2aおよびLIMK 2bアイソフォームを認識せず、細胞がLIMK2にトランスフェクトされるとシグナルが減少し、小さな干渉RNAを制御するのと比較して特異的である。様々なヒト細胞株において、LIMK 2-1はHEK-293およびHeLaで発現しているように見えたが、C6では発現していない。LIMK2-1と上流キナーゼROCKとの相互作用を評価するために、コイムノ沈降実験を用いた。トランスフェクトされたベクターによってコードされる異なるタンパク質のそれぞれは、よく発現していた。

LIMK2の3つのアイソフォームは、larp6と同様に、効率的に免疫沈降した。溶出物では、ROCKが検出され、LIMK2の3つのアイソフォームで共免疫沈降したが、larp6では検出されなかった。検出された相互作用は、特定の操作です。

コイムノ沈降LIMK 2-1は、ガンマP32 ATP標識を介してキナーゼ活性について試験した。LIMK 2-1はコフィリンをリン酸化しなかったのに対し、ミエリン塩基性タンパク質、またはMBPをリン酸化した。LIMK 2-1は、この試験で効率よく免疫沈降します。

免疫沈降を行いながら陰性制御を行い、相互作用が特異的であることを確認することが重要です。ライシスバッファーの組成は、相互作用と活動を維持するために慎重に設定する必要があります。免疫沈降の際、キナーゼ活性は異なる基質をカウントするように評価され得る。

突然変異は容易に導入され、特定の残基の役割を解明し得る。機能研究はまた、新たに強調された相互作用の生理学的役割を理解するために行われてもよい。細胞は、バイオセーフティキャビネット内の専用培養室で培養する必要があります。

P32 ATP は、特定の注意を払って処理する必要があります。放射線から保護するためのシールド、ガイガーカウンター、特定の廃棄物の収集、個人の胸と指のバッジは、放射能暴露とフィルターの先端を検出します。