プパル期のショウジョウバエ上皮の組織オリエンテーションと成長ダイナミクスのイメージングと解析
June 2nd, 2020
このプロトコルは、ショウジョウバエが変態を受ける中、ショウジョウバエ腹部上皮の細胞配向および組織成長のダイナミクスのイメージングと分析のために設計されています。ここで説明する方法論は、ショウジョウバエまたは他のモデル生物における異なる発達段階、組織、および細胞下構造の研究に適用することができる。
多細胞生物の中では、組織は空間配向でさらに高い度数を表示します。細胞は、形態形成の過程で大きな距離よりも優先順位の範囲を整列し、表示します。開発中に上皮の平面的な配置がどのように到達するかを理解するには、生体内で高い容量時間忠実度を持つ細胞の向きと成長ダイナミクスを追跡することが重要です。
記載されたプロトコルは、ショウジョウバエプパル表皮のグローバルおよび局所レベルで細胞の挙動を画像化し、分析するように設計されています。この方法論は、研究、細胞生物学、形態形成、平面極性の異なる理論に関する洞察を提供し、他の組織、構造、およびモデルの分析に適用することができる。すべてのステップは、いくつかの練習の後に簡単に実行することができます。
彼らは精度を要求します。このプロトコルの可視化は、より短い時間で最適な結果を達成するのに役立ちます。パパル解離は複雑です。
まず、湿らせた絵筆を使用して、段階的な白いプレパエを新鮮なプラスチックバイアルに移し、必要な限り摂氏25度でそこに保管してください。次に、鉗子の助けを借りてバイアルの壁から各子犬を取り除きます。両面付き粘着テープで覆われたガラススライドに、各子犬の腹側を接着します。
頭の尖塔と子犬の後ろ面を鉗子の先端で静かにタップして、パパルケースのテープへの接着を保証します。鉗子で子犬からオペルキュラムを静かに取り除くことによって、ステレオ顕微鏡の下で解剖を開始します。口の開き口を通して、パパルケースと子犬の表面の間の浅い部分に鉗子の1つの先端を挿入する。
1つ以上のスイングで頭から尾までケースを引き裂き、子犬をつまむのを避けます。後端に進み続ける際に、ひび割れたプパルケースを側面に折り返します。慎重に動物の下に鉗子を挿入し、穏やかに引き上げて、開いたプパルケースから子犬を取り除きます。
子犬は鉗子の先端にくっつきます。腹側で子犬をそっと持ち、ガス透過性ハロカーボンオイルの小さな滴の上にガラス底の皿に子犬を移します。皿の端に濡れたティッシュペーパーを転がし、湿気を維持するために皿を覆う。
ドメインと評価されるプロセスに応じて、ガラス底の皿の油滴の上に子犬を向けます。長期のライブ撮像のために、後ろ座の巣の早期拡張のために、後方は、横方向の子犬。彼らの後期膨張および組織の改造をイメージするために、ふけり状に子犬を向ける。
取り付けられた子犬を含むガラス底皿を顕微鏡ステージに移し、透過光を使用して腹部の表面に焦点を合わせます。腹部上皮に遺伝的モザイクを誘導するために有糸組換えを採用するために、熱ショック誘導性フリパーゼを運ぶ処女女性、特定のゲノム位置のFRT部位、およびFRT部位に遠位する認識可能な細胞マーカーを調製する。FRT部位を同じゲノム位置に運ぶ変異体雄を準備する。
25°Cのプラスチックバイアルで3~1の割合で、いくつかの女性と男性を4〜5日間交差させます。体細胞のクローンをヒストラストで生成するには、動物を含むプラスチックバイアルを水浴中に45分~1時間水浴に浸すことによって、十字架の前立腺の第3のインスター幼虫段階で熱ショック処理を行う。イメージJソフトウェアでは、最大強度投影関数を使用して、2Dで共焦点顕微鏡で取得したZスタックスライスを保護します。
巣は、平面座標系の前から左に向き、最上部に後ろ向きに配置する特徴的な形状を持っています。この解析で最適な結果を得るには、入力画像を高解像度で取得する必要があります。ローカルセルのエッジで定性的な方向の値を取得するには、プラグインメニューをクリックし、方向 J 分布オプションを選択します。
ガウス窓のシグマを 1 ピクセルに、3 次スプラインを勾配に、最小コヘレンシーを 20% に設定し、最小エネルギーを 1% に設定します。プラグインのカラー調査オプションを使用します。色相を向き、彩度を一貫性に、明るさを入力画像に設定します。
この色は、設定された平面座標系に対するセルエッジの方向を符号化します。次に、プラグインメニューの配向 J メジャーオプションを使用して、セルラーの向きを数値化し、セル間の方向をセルに合わせます。ヒストブラストが占める領域内で20マイクロメートルの周りに20マイクロメートルの周りの均一な重量の関心の小さな、隣接しない非重なり領域を生成します。
押し付けメジャーは、ROI から優勢なローカル方向と一貫性を計算します。本研究では、使用される方法論は、著しい写真の漂白または光毒性なしに最大48時間の発達中の子犬の高解像度映画を生成することができる。ここでは、puparium形成後26時間にRFP NLSとその双子のスポットが存在しない場合に特徴付けられた野生型クローンの例を示す。
クローンは、セグメントの境界に沿って細長く表示されます。双クローンは並列または並行して配置される。26時間および47時間後の野生型クローンの形態は、両方の段階で複雑な境界形態を示す。
子犬の形成後26時間47時間の幾何学的パラメータの箱とひげ図は、この時間枠で有意に増加した平均面積と周囲を示しています。クローンのオリエンテーションは、拡張と改造の間に維持されました。26時間および47時間後の形成パラメータは、野生型クローンでほとんど変化しない粗さ、丸みおよび円形を示す。
子犬を損傷しないようにしてください、そうでなければ、それはライブイメージングに影響を与え、数時間以内に死ぬでしょう。このプロトコルは、サルタス試薬や器具を使用する必要はありません。解剖時に自分をつまむのは避けてください。
これらの方法論を応用することで、異なる想像技術を用いて長期間の高解像度ムービーを生成することが可能である。フォトンまたは回転するディスクへの焦点。ランダムセルはクロストークや細胞通信機構の同定を容易にするため、クロラル分析を用い、非自律応答を探索することができます。
これらの方法は、変態中の表皮、筋肉、および神経発達の調整を含む形態遺伝学的現象の全範囲を研究するために容易に適応することができる。
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概要
このプロトコルは、果実蠅が変態を経験する際のショウジョウバエの腹部上皮における細胞配向と組織成長のダイナミクスのイメージングと分析のために設計されています。ここで説明される方法論は、ショウジョウバエや他のモデル生物における異なる発生段階、組織、および細胞小器官の研究に適用できます。
主要な研究要素
科学の分野
- 細胞生物学
- 形態形成
- 平面極性
背景
- 組織は多細胞生物内で高度な空間配向を示します。
- 細胞は形態形成の際に長距離で整列し、優先順位を示します。
- 細胞の配向と成長ダイナミクスを追跡することは上皮配列の理解に不可欠です。
- この研究はショウジョウバエの蛹の表皮に焦点を当てています。
研究の目的
- グローバルおよびローカルレベルでの細胞挙動のイメージングと分析。
- 細胞生物学と形態形成理論への洞察を提供。
- この方法論を様々な組織とモデル生物に適用。
使用される方法
- 細胞配向追跡のためのイメージング技術。
- 組織成長ダイナミクスの分析。
- ショウジョウバエの発生の生体内観察。
- プロトコルの異なる発生段階への適用。
主要な結果
- 細胞挙動追跡における高い空間-時間的忠実度。
- 変態中の細胞配向ダイナミクスへの洞察。
- 他の組織とモデル生物への応用の可能性。
- 練習後、この方法論は容易に利用可能。
結論
- このプロトコルは上皮形態形成の理解を深めます。
- 細胞生物学の様々な研究応用に適応可能です。
- 将来の研究はこの方法論をより広範な洞察のために活用できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Understanding tissue-level organization and growth dynamics is critical for de-risking target validation in complex disease models. This protocol enables high-fidelity tracking of cellular alignment and morphogenetic processes, supporting mechanistic insights into epithelial patterning. Such quantitative spatial-temporal data enhances predictive confidence in preclinical models by linking cellular behaviors to tissue-scale outcomes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of tissue-scale organization to validate hypotheses about planar polarity and cellular coordination in morphogenesis.
- Operational Value: Provides reproducible imaging and analysis workflows for assessing cellular alignment and directional growth in epithelial systems.
- Predictive Value: Supports target confidence by linking molecular perturbations to measurable changes in tissue orientation and clonally resolved growth dynamics.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative orientation and coherency metrics from defined regions of interest, enabling objective comparison of cellular behaviors across conditions.
- Operational Value: Standardizes live imaging protocols using gas-permeable halocarbon oil and mounted pupae for long-term, high-resolution time-lapse acquisition.
- Assay Readiness: Facilitates screening-ready readouts such as clone elongation, border morphology, and area/perimeter changes over time for phenotypic assessment.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-stage observations of histoblast clone dynamics to broader tissue remodeling processes relevant to wound healing and regeneration models.
- Mechanistic De-risking: Enables evaluation of non-autonomous responses via clonal analysis and genetic mosaics to dissect cell communication mechanisms in developing epithelia.
- Predictive Confidence: Sustained orientation and stable shape parameters during expansion provide baseline benchmarks for assessing aberrant morphogenesis in disease-relevant perturbations.
Pipeline & Workflow Integration
The method supports discovery biology through hypothesis testing of planar cell polarity and extends to lead identification by enabling quantitative assessment of cellular responses to genetic or pharmacological perturbations.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of cellular alignment and tissue orientation during morphogenetic events such as histoblast nest expansion and remodeling.
- Screening: Enables assay readiness through standardized live imaging and orientation analysis of epithelial sheets over 48-hour periods with minimal photo toxicity.
- Analytics: Generates dominant local orientation and coherency measurements from 20x20 micrometer regions of interest using OrientationJ plugins for objective, quantitative comparison.
- Translational Research: Connects clonal dynamics and border morphology changes to preclinical continuity in tissue repair and regeneration models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis platform adaptable to other tissues, developmental stages, and model organisms beyond Drosophila pupal epidermis.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in epithelial morphogenesis and planar polarity pathways.
- Operational Value: Ensures standardization, reproducibility, and scalability of live imaging and quantitative orientation analysis across laboratories and model systems.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of aberrant tissue organization, reducing late-stage biological risk in preclinical programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through quantifiable, morphology-based readouts that correlate with functional tissue states.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila handling, pupal dissection, and live imaging under stereo and confocal microscopy.
- Dependent on gas-permeable halocarbon oil, glass-bottomed dishes, and stable humidity maintenance for long-term imaging.
- Necessitates standardized image acquisition protocols and plugin-based analysis (OrientationJ) for consistent orientation and coherency quantification.
- Requires adaptation of mounting orientation (dorsal vs. dorsal-lateral) based on the specific biological process being imaged (early expansion vs. late remodeling).
- Practical limitations include sensitivity to dissection-induced damage, which can compromise pupal viability and live imaging quality if not performed with precision.
