Name: 3次元スフェロイド培養からの幹様細胞の分離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: 学ぶスフェロイドベースのラベル保持アッセイを用いた前立腺がん幹細胞の分離法。CFSEまたはFar Red標識とFACSを組み合わせ、生きた静止期幹細胞を前駆細胞から分離し、治療抵抗性のメカニズム解明と新規治療標的の同定に貢献します。

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この研究は、国立がん研究所R01-CA172220(GSP、WYH)、R01-ES02207(GSP、WYH)からの助成金によって支持されました。私たちは、細胞選別の支援をイリノイ大学シカゴ校のフローサイトメトリーコアに感謝します。

すべての細胞処理および媒体調製物は、クラスIIの生物学的安全キャビネット(BSC)の無菌技術で行われるべきである。
1. 2DにおけるHPrEC細胞の培養と維持
<ol><li>2.5 μg/cm 2フィブロネクチン溶液の2mLを室温(RT)で一晩コートします。溶液を吸引し、培養皿をBSCで45分間空気乾燥させ、フィブロネクチンコーティングされた培養料理を4〜4週間保存することができます。</li>
	<li>前立腺上皮細胞増殖培地(例えばPrEGM)の9mLをフィブロネクチンコーティングされた100mm培養皿に加え、37°CのCO2インキュベーターで温かく保ちます。</li>
	<li>37°Cの水浴で凍結したHPrEC細胞(2 x 105/mL)のバイアルを1つ解凍し、10mLの温かい培地で細胞を再中断します。</li>
	<li>RT.アスパイアで5分間500 x gで細胞懸濁液を遠心分離し、上清を廃棄する。</li>
	<li>温かい培養培地の1mLで細胞を十分に再中断する。1mLの細胞懸濁液を、前温培地の9mLを含むフィブロネクチン被覆100mm培養皿に直接ピペットすることにより種子細胞を用いる(培地及び細胞の総体積は10mLである)。培養料理を37°CのCO2インキュベーターに戻します。</li>
	<li>2日ごとに培地を補充します。これを行うには、慎重にすべてのメディアを吸引し、新鮮な暖かい媒体の10 mLを追加します。</li>
	<li>約5日間で、培養物が約70~80%のコンフルエントであることを確認します。3mLの3mLの細胞を37°Cで5分間インキュベートして酵素消化を行います。</li>
	<li>10%FBSを含む3mLの暖かいPBSを加えて消化を停止する。</li>
	<li>細胞を50mL遠心管に集め、500 x gで500 x gで5分間、RT.アスパイアで上清を廃棄します。</li>
	<li>30 mLの温かい媒体で細胞ペレットを再スペンドし、次の通路のために3つの新しいフィブロネクチンコーティングされた100ミリメートル培養皿に均等に分配します。 注:原発性HPrEC細胞は、基底上皮細胞特性を変えることなく〜3〜5倍の通路が可能です。上皮表現型は、細胞化化学/免疫蛍光(ICC/IF)アッセイを用いて、基底上皮細胞マーカーサイトケラチン5およびp63の式によって試験される。</li>
</ol>2. BrdU、CFSE、またはファーレッドプロ染料によるHPrECのラベリング
注: セルは、ステップ 2.1 またはステップ 2.2 に進み、ステップ 3.1 で説明したように 3D プロスタスフィア培養への転送を続けることができます。
<ol><li>
BrdUを用いた細胞の単一標識
	<ol>
<li>培養2 x 105 HPrEC細胞をフィブロネクチン被覆100mm培養皿に、1μMのBrdUを含む温かい培地を用いた10mLの培養物。前立腺幹および前駆細胞を含むすべての細胞の標識を確実にするために、細胞を10日間(2箇所以上)培養する。</li>
		<li>10日後、BrdUを含むPrEGM培地を慎重に吸引し、5mLの温かいPBSで細胞を洗浄する。1x を繰り返します。</li>
		<li>手順 1.7 ~ 1.8 の説明に従って、0.05% トリプシン/EDTA を使用して酵素消化を実行します。細胞をRTで5分間500×gで遠心分離し、上清を廃棄します。</li>
		<li>BrDU標識ペレット化細胞(5 x 104)を500μLの氷冷(1:1)基底膜マトリックス/培地に再中断し、3Dプロスタスフィア培養(ステップ3.1で説明)に移し、スフェロイド形成中にBrdUウォッシュアウトを許可する(~6細胞サイクル)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
BrdUおよびCFSEまたはファーレッドプロ染料を用いた細胞の二重標識
	<ol>
<li>生細胞の共同標識が必要な場合は、ステップ2.1から10日間BrdUでインキュベートされた事前標識された細胞を取り、5 μM CFSEまたはファーレッドライブ細胞蛍光プロ染料を30分間共同標識します。</li>
		<li>BrdUとCFSEまたはファーレッドプロ染料を含む媒体を慎重に吸引する。5 mL の暖かい PBS で細胞を洗浄します。洗浄1xを繰り返します。</li>
		<li>手順 1.7 ~ 1.8 の説明に従って、0.05% トリプシン/EDTA を使用して酵素消化を実行します。細胞を500 x gで5分間RTで遠心分離し、上清を取り除き、廃棄します。</li>
		<li>共標識細胞(5 x 104)を500°Lの氷冷(1:1)基底膜マトリックス/培地に再び中断し、3Dプロスタスフィア培養(セクション3.1に記載)に5日間移し、スフェロイド形成中にBrdUおよびCFSEまたは極赤色のウォッシュアウトを許可します(〜6細胞サイクル)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ステップ4.1、4.2、4.3、または5の説明に従って、球(5日目のプロスタスフィア)の標識保持セルの検出を実行します。 注:カルボキシフルオレセインジアセテートコハクニミジルエステル(CFSE)とファーレッドは、長持ちする蛍光プロ染料であり、標識された細胞内でよく保持されています。生細胞中の細胞内エステラーゼは、現在膜不浸透となっている緑色または赤色の蛍光分子を活性化する酢酸基を切断する。</li>
</ol>3. 3D基底膜培養システムにおけるプロスタスフィア形成
<ol><li>
3D基底膜マトリックスシステムにおけるプロスタスフィア培養
	<ol>
<li>一晩で4°Cで基底膜マトリックスを解凍し、使用前に氷の上に保ちます。</li>
		<li>氷冷基底膜マトリックスを1mLを氷冷培養培地の等量に加えます。気泡を避けて上下にピペットでゆっくりと混ぜます。 注:この溶液の100°Lで12ウェル培養プレートウェルの底部を事前にコーティングします。これにより、マトリックスを通過するセルの数が最小限に抑え、単層として成長します。</li>
		<li>5 x 104 HPrEC細胞を氷冷(1:1)基底膜マトリックス/培養培地で500μLの総体積で混合して再サスペンドします。</li>
		<li>各ウェルの底縁の周りにこのセル溶液のピペット500°L。</li>
		<li>プレートを旋回して、井戸の縁の周りに混合物を均等に分配します。プレートをCO2インキュベーターに37°Cで30分間入れ、マトリックスを固めます。</li>
		<li>マトリックスが固化したら、ウェルあたり1mLの温培養培地で覆う。基底膜マトリックスリングを乱さないでください。慎重にピペットの先端を目指し、井戸の中心に培養培地を分配します。 注:培養培地は、固化した基底膜マトリックスに添加する際に37°Cに温める必要があります。基底膜マトリックスは、その完全性を失い、冷たい/クールな媒体にさらされると溶解します。</li>
		<li>2日ごとに培地を補充します。使用した培地の〜500μLを慎重に吸引し、新鮮な温培養培地の500°Lを追加します。</li>
		<li>反転顕微鏡を使用して、プロスタスフィアの形成と成長を5~7日間監視します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
プロスタスフィアの通過
	<ol>
<li>可能な限り多くのメディアを慎重に吸引することにより、マトリックスからプロスタスフィアを収穫します。固化したマトリックスの浮遊部分を乱したり拾ったりすることは避けてください。</li>
		<li>1 mL のディスパーゼ溶液 (基底膜マトリックス:1:2 の比率でディスパーゼ) を追加します。何度か上下にピペットを組んで十分に混ぜます。</li>
		<li>培養プレートをCO2インキュベーターで37°Cで30分間インキュベートします。</li>
		<li>球数カウントとサイズ測定のための培養皿の底にあるプロスタスフィアの画像を撮ります。</li>
		<li>球体混合物を15 mLチューブに集めます。RTで5分間500 x gで懸濁液を遠心分離し、球体をペレットにします。吸気して上清を捨てる。</li>
		<li>500°Lの温かいトリプシン/EDTAで消化し、懸濁液を1.5mLマイクロ遠心管に移すことによって、球体を単一細胞に分散させます。</li>
		<li>37°CのCO2インキュベーターでマイクロ遠心チューブを5分間インキュベートします。</li>
		<li>10%FBSを含む500 μLの暖かいPBSでトリプシン作用を停止します。26 G針5xの1mLシリンジを通して消化球懸濁液を通過し、球体を単一の細胞に解離します。</li>
		<li>5分間500xgで懸濁液を遠心分離し、RTで細胞をペレット化し、上清を吸引して廃棄する。</li>
		<li>温かい培養培地の1mLで細胞ペレットを再サーデさせ、40μmの細孔サイズのナイロンセルストレーナーを通して濾過します。</li>
		<li>5分間500xgで細胞懸濁液を遠心分離し、RT.アスパイアで細胞をペレット化し、上清を廃棄する。</li>
		<li>細胞ペレットを1mLの氷冷(1:1)基底膜マトリックス/培養培地で再サージし、プロスタスフィアの第2通路の3D基底膜マトリックスにサブカルチャーを行う。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 免疫蛍光染色によるBrdU保持前立腺幹細胞の同定
<ol><li>付着したプロスタスフィアをアウトグローし、続いて前立腺幹細胞2Dイメージング用の免疫蛍光(IF)染色を行う。
	<ol>
<li>ステップ3.2.1-3.2.3で説明されているように、消化をディスパスすることによってプロスタスフィアを収穫する。5分間500 x gで1.5 mLマイクロ遠心管内の球を遠心分離します。</li>
		<li>温かい培養培地の1 mLで球体を再サスペンドする。</li>
		<li>球体の付着と伸びを可能にするために、37°Cのインキュベーターで200°Lの培養培地で8ウェルチャンバースライドでウェルあたり〜50プロスタスフィアをインキュベートします。</li>
		<li>2日目に、吸引し、培養培地を廃棄する。成長した球体を200μLのPBSで5分間洗います。</li>
		<li>氷冷メタノールの200μL/ウェルの球を-20°Cで20分間固定します。</li>
		<li>200 μL/ウェルのPBSで球を5分間洗います。</li>
		<li>RTで30分間2N HClの200 μL/ウェルを備えた酸洗浄球。</li>
		<li>200 μL/ウェルのPBSで球を5分間洗います。</li>
		<li>PBST(0.25%トリトンX-100のPBS)に5%の正常ヤギ血清を含むブロッキング溶液を100μL加え、RTで30分間インキュベートします。</li>
		<li>ブロッキング溶液を吸引し、2%の正常ヤギ血清と一次マウス抗ヒトBrdU抗体(1:200)を含むPBSTの100μLを各ウェルに加え、一晩4°Cで加湿箱にインキュベートします。 注:マウスIgG抗体は陰性対照として用いられる。</li>
		<li>吸引し、一次抗体溶液を除去します。200 μLのPBSで球を5分間洗います。</li>
		<li>2%の正常ヤギ血清と二次ヤギ抗マウスAlexa Fluor 488抗体(1:500)を含むPBSTの100μLを各ウェルに加え、暗闇の中で2時間RTでインキュベートします。</li>
		<li>二次抗体溶液を吸引し、除去する。200 μL の PBS で球を 5 分間洗います。</li>
		<li>DAPIを含む水性取り付け媒体の~25~40°Lでスライドを取り付けます。</li>
		<li>蛍光顕微鏡とカラーデジタルカメラで染色された球体/細胞の画像を取得します。</li>
	</ol></li>
	<li>前立腺幹細胞3Dイメージングのためのプロスタスフィアの全マウントIF染色 注:全体のマウントIF染色のために、プロスタスフィアは1.5 mLマイクロ遠心管を使用して処理されます。<ol>
<li>ステップ3.2.1~3.2.3に記載されているように、消化を分別してプロスタスフィアを収穫する。5分間500 x gで1.5 mLマイクロ遠心チューブ内の球を遠心分離し、上清を吸引し、廃棄します。</li>
		<li>RTで4%パラホルムアルデヒドの1 mLで球を再サスペンドして固定し、5分間500 x gで球を遠心分離し、上清を吸引して廃棄します。</li>
		<li>PBSのペレットを1 mLで再サスペンドして球体を洗います。5分間500 x gで球を遠心分離します。1x を繰り返します。</li>
		<li>酸は、2N HClの1 mLでペレットを30分間再サスペンドして球体を洗浄する。</li>
		<li>1 mLのPBSで球を5分間洗い、500 x gで5分間遠心分離機を洗い、上清を吸引して廃棄します。3x を繰り返します。</li>
		<li>PBST(0.25%トリトンX-100のPBS)で5%の正常ヤギ血清を含むブロッキング溶液の100°Lで〜15〜30球を再サスペンドし、RTで30分間インキュベートします。</li>
		<li>ブロッキング溶液を除去するには、5分間500 x gで球を遠心分離し、吸引し、上清を廃棄します。</li>
		<li>2%の正常ヤギ血清および一次マウス抗ヒトBrdU抗体(1:200)を含むPBSTの球体を100μLで再サスペンドし、4°Cで一晩インキュベートする。</li>
		<li>PBSのペレットを1 mLで再サスペンドして球体を洗います。5分間500 x gで球を遠心分離します。1x を繰り返します。</li>
		<li>2%の正常ヤギ血清と二次ヤギ抗マウスAlexa Fluor 488抗体(1:1,000)を含むPBSTの球体を100μLで再サスペンドし、RTで2時間インキュベートします。</li>
		<li>PBSのペレットを1 mLで再サスペンドして球体を洗います。5分間500 x gで球を遠心分離します。1x を繰り返します。</li>
		<li>DAPIを含む水性取り付け媒体の30~50°Lで球を再サスペンドします。球体の平坦化を防ぐために、カバーガラス底の35mm未塗装の培養皿から作られた井戸にそれらを分配します。その後、井戸をカバーし、培養皿にカバースリップを追加します。</li>
		<li>透過光反転蛍光共焦点顕微鏡を用いて球全体のZスタック画像を取得します。フリーフォーム描画機能を備えたイメージングソフトウェアを使用して、これらのZスタックイメージを3Dイメージに変換します。 注:マウスIgG抗体は陰性対照として用いられる。</li>
	</ol></li>
	<li>対細胞解析(4日間プロトコル)
	<ol>
<li>BrdU ラベルの球を 5 日目に培養します。</li>
		<li>1日目:1mLのディスパス消化で基底膜マトリックスから球を収穫する。ステップ3.2.1~3.2.11に記載されているように、1.5 mLマイクロ遠心管内の500°Lの温かい0.05%トリプシン/EDTAによって単一細胞に分散します。</li>
		<li>細胞を1mLの温培養培地で再中断する。</li>
		<li>分散した単一細胞(ウェルあたり〜300〜500)を8ウェルチャンバースライドにプレートし、200μL/ウェル培養培地で一晩培養し、取り付けを可能にします。</li>
		<li>2日目:培養培地中の200μLのサイトチャラシンDを用いて培養培地を変更し、37°Cで一晩インキュベートして、メタフェーズ後期に一時停止する1つの細胞分裂をアナフェイズに許可する。</li>
		<li>3–4日目:吸引し、媒体を廃棄します。200 μL/ウェルの氷冷メタノールを-20°Cで20分間固定します。</li>
		<li>蛍光顕微鏡でペアリングされた細胞の画像を撮ります。2つの核間の距離が30μm未満であることを確認します。 注:BrdU標識保持前立腺幹細胞は対称分裂を起こして同量のBrdUを保持する2つの娘幹細胞を生じるのに対し、非対称分裂を起こす幹細胞は、すべてのBrdUとBrdUラベルを失った他の娘前駆細胞。</li>
	</ol></li>
</ol>5. FACS選別によるCFSE標識保持前立腺幹細胞の単離
<ol><li>5日目:培地を2mLのディスパーゼ(基底膜マトリックス:1:2比でディスパス)に置き換えて、3D培養中の6ウェルカルチャープレートで成長するCFSE標識5日目プロスタスフィアを収穫する。ピペットを数回上下に切り、徹底的に混ぜます。</li>
	<li>37°CのCO2インキュベーターでプレートを30分間インキュベートし、マトリックスを消化します。</li>
	<li>球体混合物を15 mL遠心管に集めます。RTで5分間500 x gで球を遠心分離します。</li>
	<li>温かい0.05%トリプシン/EDTAの500°Lで球ペレットを再サスペンドし、1.5 mLマイクロ遠心管に移します。</li>
	<li>CO2インキュベーター内の球を37°Cで5分間インキュベートします。</li>
	<li>26 G 針 5x で 1 mL シリンジを通して球を通過し、球を完全に単一のセルに解離します。</li>
	<li>細胞をRTで5分間500×gで遠心分離し、上清を廃棄します。</li>
	<li>1μg/mLプロピジウムヨウ化物(PI)を含む温培養培地の細胞を1mLで再ステントし、死んだ細胞を染色する。RTで1分間インキュベートします。</li>
	<li>細胞をRTで5分間500×gで遠心分離し、上清を廃棄します。</li>
	<li>細胞を1mLの温培養培地で再中断する。細胞をRTで5分間500×gで遠心分離し、上清を廃棄します。</li>
	<li>500°Lの温かい培養培地で細胞を再サスペンドし、35μmの細孔サイズの細胞ストレーナースナップキャップを通して濾過することにより、5 mLポリスチレン丸底管に細胞を収集します。</li>
	<li>トリプシン分散型CFSE標識プロスタスフィア細胞の解析をシングルチャネルFACSアナライザで行います。</li>
	<li>分数 CFSEHi、CFSEMed、および CFSELoセルのサブ母集団をゲートします。ゲーティングには負のコントロールと正のコントロールを使用します。 注:FACSソートされたCFSE標識保持前立腺幹細胞(Hu et al.13を参照)の存在は、緑色蛍光顕微鏡法および非保持細胞と比較してその大きな細胞サイズによって確認することができる。この大きな細胞サイズは、前駆細胞集団に対する前立腺幹細胞の性質である。これは、他の組織タイプと異なる場合があります。</li>
</ol>

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著者は開示する財政的な関係を持っていません。

複数の幹細胞表面マーカーを用いたフローサイトメトリーは、特異性と選択性の両方を欠いているにもかかわらず、幹細胞研究に一般的に用いられるアプローチである。3D培養系における回転楕円体形成は、HPrECを含む一次上皮細胞からの稀な幹細胞集団を濃縮する上でもう一つの有用な方法であるが、得られる回転楕円体は依然として幹細胞と前駆細胞の異種混合物である2、3、4である。プロスタスフィアでは、急速に増殖する前駆細胞と比較して、幹細胞の比較的静止した性格を長期的な標識保持アッセイによって同定することができます。
このホワイト ペーパーで要約する方法では、BrdU、CFSE、および/またはファーレッドプロ染料<sup class...

ヒト前立腺には、分泌機能を有する明るい上皮と、その根底にある基底細胞と、異常な神経内分泌細胞成分が含まれています。上皮細胞は、この場合、生体内で比較的静止している前立腺幹細胞の稀な集団から生成され、生涯を通じて腺恒常性を維持するための修復システムとして作用する。多くの進歩にもかかわらず、前立腺幹細胞の同定および機能的単離は、この分野における主要な課題であり続ける。幹細胞バイオマーカーは、フローサイトメトリーと組み合わせた細胞表面マーカーベースの方法論を含む、幹細胞研究2、3、4に一般的に使用される。しかしながら、濃縮および単離の結果は、マーカーの組み合わせおよび抗体特異性5、6の機能として大きく異なり、単離された細胞の同一性に関する疑問を提起する。幹細胞様細胞濃縮のためのもう一つの広く用いられているアプローチは、三次元(3D)回転楕円体培養物2、3、4である。常駐幹細胞はニッチ拘束を伴う生体内で比較的静止しているが、それらは3Dマトリックス培養(対称と非対称の両方)で細胞分裂を受け、系統コミットメント7、8に向けて急速に再生する幹細胞および前駆細胞の両方を生成する。形成された回転楕円体は、初期段階および後期前駆細胞を含む系統コミットメントの様々な段階で幹細胞と前駆細胞の両方を含む異種混合物である。したがって、スフェロイド全体を用いたアッセイは幹細胞を排他的ではなく、独特の幹細胞特性の同定は決定的ではない。したがって、前立腺幹細胞を識別し、娘の前駆体から分離するアッセイを作成することが重要です。この目的に向かって、現在のプロトコルの目標は、ヒト前立腺組織からの幹細胞の効率的な同定と単離を可能にするアッセイシステムを確立し、その生物学的機能の堅牢な下流分析を行うことです。
長期5-ブロモ-2'-デオキシウリジン(BrdU)標識保持は、その長期倍増時間9、10に基づいて幹細胞のインビボおよびインビトロ系統トレースに広く使用されている。本明細書に記載される前立腺幹細胞同定および単離のための現在のアプローチは、混合上皮集団内の相対的な静止特性および標識保持特性に基づいている。さらに、不死鎖DNA仮説に基づいて、幹細胞のみが非対称細胞分裂を受けることができる。幹細胞は、古い親のDNAを含む娘細胞を表し、コミットされた娘細胞である前駆細胞は、新たに合成されたDNAを受け取ります。上記のユニークな幹細胞特性は、一次培養における親幹細胞におけるBrdU標識を行い、3Dアンカーフリー回転楕円体培養への転写時にBrdU-ウォッシュアウト後にそのラベルを追跡するために利用される。一次前立腺上皮細胞の大部分は、2D培養において基底および通過増幅表現型を保持する一方で、3Dシステム3、12への転移時に対応する培養媒体を有するスフェロイドまたは完全に分化したオルガノイドの形成によって証明されるように、多能性幹細胞の補充および維持の稀な集団もある。現在のプロトコルでは、HPrEC前立腺回転楕円体またはプロスタスフィアベースのBrdU、CFSE、またはファーレッド保持アッセイを使用し、続いて蛍光活性化細胞選別(FACS)を使用して、単一細胞レベル13でスフェロイド中の標識保持幹細胞を同定する。
重要なことに、系統へのコミットメントを有する前駆細胞と比較して、早期スフェロイド内の標識保持細胞の幹細胞特性をさらに確認した。これらには、幹細胞不斉分裂、インビトロ回転楕円体形成能および生体内組織再生能、オートファジー活性の上昇、増強リボソーム生体形成および代謝活性の低下が含まれる。続いて、RNAAseq分析を行った。標識保持スフェロイド細胞において微分発現した遺伝子は、ヒト前立腺幹細胞の新規バイオマーカーとなる可能性が認められた。この回転楕円体ベースの標識保持アプローチは、少数の癌幹細胞を同様に同定する癌検体に適用され得る。以下に提示する、ヒト原発性前立腺上皮細胞(HPrEC)を例に用いたプロスタスフィアベースの標識保持アッセイである。

<table><tbody><tr><td>0.05% トリプシン-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>1 mL ツベルクリンシリンジ</td><td>ベクチン ディキンソン</td><td>BD 309625</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 微量遠心チューブ、滅菌済み</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mm 培養皿</td><td>Corning/Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>12 ウェル培養プレート</td><td>Corning/Falcon</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 遠心分離機チューブ</td><td>コーニング/ファルコン</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>22 x 22 mm カバースリップ、スクエア</td><td>コーニング</td><td>284522</td><td>MatTek 35 mm 培養皿</td></tr>用 <tr><td>24 x 50 mm カバーガラス</td><td>コーニング</td><td>2975245</td><td></td></tr><tr><td>26G x 1.5 インチ 皮下注射針</td><td>Monoject</td><td>1188826112</td><td></td></tr><tr><td>2N HCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm カバーガラス底部付き培養皿</td><td>MatTek Corp</td><td>P35G-0-10-C</td><td>ガラス底 No. 0、コーティングなし、<img src="/files/ftp_upload/60357/60357img1.jpg"> 照射</td></tr><tr><td>40 &amp; マイクロ;m細孔ナイロン細胞ス</td><td>トレーナーCorning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>5%CO2培養インキュベーター、37°;C</td><td>Forma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL 遠心分離チューブ</td><td>Corning/Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>5mL ポリスチレン丸底チューブ ストレーナースナップキャップ付き</td><td>Corning</td><td>352235</td><td>35 &amp; micro;m ナイロンメッシュ</td></tr><tr><td>6ウェル培養プレート</td><td>コーニング</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>8ウェルチャンバースライド</td><td>ミリポアシグマ</td><td>PEZGS0816</td><td></td></tr><tr><td>DAPIを含む水性封入剤</td><td>ベクターラボラトリーズ</td><td>H-1200</td><td>A 核蛍光色素</td></tr><tr><td>生物学的安全キャビネット、レベル2認証</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BrdU(5-ブロモ-2'-デオキシウリジン)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5002</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 微量遠心チューブ用 DMSO 遠心分離</td>機に 1 mM ストック溶液 <td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL チューブに</td>溶解 <td>ベックマン・コールター</td><td></td><td>アレグラ 6</td></tr><tr><td>CFSE (カルボキシフルオレセイン・スクシンイミジルエステル)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>C34554</td> DMSO サイトカラシン D <td>に溶解した 5 mM ストック溶液</td></tr> サー<tr><td></td><td>モフィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td></td>PHZ1063</tr><tr><td>Dispase 1U/mL</td><td>StemCell Technologies</td><td>07923</td><td></td></tr><tr><td>FACS CellSorter MoFlo XDP</td><td>Beckman Coulter</td><td>s</td><td></td></tr><tr><td>Far-Red pro-dye</td><td>Thermo Fisher</td><td>C34564</td><td>5 mM Stock Solution in DMSO</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0895</td><td>コーティング用 100 mm 培養皿</td></tr><tr><td>カラーデジタルカメラ付き蛍光顕微鏡</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Axioskop 20 蛍光顕微鏡; カラーデジタル Axiocamera</td></tr><tr><td>Goat 抗マウス IgG (H+L) 高交差吸着二次抗体 Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-11029</td><td></td></tr><tr><td>HPrEC (Primary normal human prostate epithelial cells)</td><td>Lifeline Cell Technology</td><td>FC-0038</td><td>3人の若い(19-21歳)無病の臓器提供者からプールされました。1 x 105細胞/mL;液体窒素</td></tr><tr><td>アイスバケツと氷</td><td></td><td></td><td></td></tr>に保管 <tr><td>デジタルカメラ</td><td></td><td></td><td></td>付き逆マイクロソープ</tr><tr><td>マトリゲル、低成長因子、フェノールレッドフリー</td><td>コーニング</td><td>356239</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>コーニング</td><td>A452-4</td><td></td></tr><tr><td>マウス抗BrdU抗体</td><td>Cell Signaling</td><td>5292S</td><td></td></tr><tr><td>マウスIgG抗体(ネガティブコントロール)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2025</td><td></td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Vector Laboratories</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5368-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>Pipettors and tips, various sizes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PrEGM (ProstaLife Epithelial Cell Growth Medium)</td><td>Lifeline Cell Technology</td><td>LL-0041</td><td></td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム(PI)</td><td>R&amp;Dシステム</td>ズ<td>5135/10</td><td>10 μg/mL PI in PBS で 4 °C で保存;C 暗闇の中の</td></tr><tr><td>血清ピペット、さまざまなサイズ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>球数計数およびサイズ測定</td><td></td><td></td><td></td>用ソフトウェア</tr><tr><td>ソフトウェア: Imarisを使用した3D画像 フリーフォーム描画機能を備えた</td><td></td><td></td><td></td>画像ソフトウェア</tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Millipore Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス、37 &gt;</td>透過光逆性蛍光共焦点顕微鏡<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>を用いたC zスタック像</td></tr></tbody></table>

3次元スフェロイド培養からの幹様細胞の分離

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

成体幹細胞研究の進歩にもかかわらず、組織標本からの幹細胞の同定と単離は依然として大きな課題である。常駐幹細胞は成体組織のニッチ拘束を伴う比較的静止しているが、アンカーフリー三次元(3D)培養では細胞周期に入り、対称細胞分裂と非対称細胞分裂の両方を受け、幹と前駆体の両方を生み出す細胞。後者は急速に増殖し、系統コミットメントの様々な段階で主要な細胞集団であり、異種回転楕円体を形成する。原発性正常ヒト前立腺上皮細胞(HPrEC)を用いて、スフェロイドベースの標識保持アッセイを用いて、スフェロイド開始幹細胞の同定と機能的単離を単一細胞分解能で可能にする。
HPrECまたは細胞株は、自己更新幹細胞を含むすべての分裂細胞のDNAへの組み込みを可能にするために、BrdUで10日間培養された2次元(2D)である。3D培養への転移時に5日間洗い流し、その間、幹細胞は非対称分裂を介して自己更新し、回転楕円体形成を開始する。比較的静止した娘幹細胞はBrdU標識の親DNAを保持するが、娘の前駆者は急速に増殖し、BrdU標識を失う。BrdUは、FACSによる生きた幹細胞分離を可能にするCFSEまたはファーレッドのプロ染料で置き換えることができます。幹細胞の特徴は、インビトロ回転楕円体形成、生体組織再生アッセイ、およびそれらの対称/非対称細胞分裂を文書化することによって確認される。単離された標識保持幹細胞は、RNA-seq、ChIP-seq、単一細胞捕捉、代謝活性、プロテオームプロファイリング、免疫細胞化学、オルガノイド形成、および生体内組織再生を含む下流の分子および生物学的研究によって厳密に尋問することができる。重要なことに、このマーカーフリー機能性幹細胞分離アプローチは、新鮮な癌標本および癌細胞株から幹細胞細胞を複数の器官から識別し、広い適用性を示唆している。がん幹細胞様細胞バイオマーカーの同定、がん幹細胞様細胞を標的とする医薬品のスクリーニング、がんの新しい治療標的の発見に利用できます。

原発正常ヒト前立腺上皮細胞は、フィブロネクチン被覆培養皿に入れられ、細胞増殖は2D培養中に維持される(図1a)。基底膜マトリックスで3D培養に移ると、分化した上皮細胞はゆっくりと死ぬ。前立腺幹細胞だけがアンカーフリー培養で生き残ることができ、5日間で回転楕円体を形成する(図1b)。
2D培養における前立腺上皮細胞の二重標識の後に3D培養におけるスフェロイド形成が続き、同じ標識保持細胞におけるBrdU、CFSE、および極赤の共振化を示す(図2a-i)。
標識保持細胞は、5日目のスフェロイドにおける幹細胞特性を示す。二重免疫染色は、標識保持細胞がサイトケラチンタンパク質KRT14のより低いレベルを示すことを示す;減少した細胞接合タンパク質 E-カドヘリン...

ヒト原発性前立腺上皮細胞を用いて、スフェロイドベースの標識保持アッセイによる幹様細胞の機能的特徴付けの新規バイオマーカーフリー法を報告する。BrdU、CFSE、またはファーレッド2Dセルラベリングのステップバイステッププロトコルについて説明します。三次元回転楕円体形成;免疫細胞化学による標識保持幹細胞同定;FACS による分離。

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

幹細胞の分離は、現在の方法を使用した前駆細胞の共分離による主要な課題であり続けています。我々は、静止幹細胞を混合前駆物質から分離するための新しいバイオマーカーフリーアッセイを開発した。このスフェロイドベースのラベル保持アッセイの主な利点は、CFSEまたはファーレッド標識を使用してFACSによって娘の前駆細胞から生きた幹細胞を拡大および分離することができる。従来の治療法ではほとんどの前立腺癌細胞が根絶されますが、がん幹細胞は治療抵抗のために残り、病気の進行を促進します。幹細胞様細胞分離は、効果的な疾患寛解のために治療的に共同標的化することができる新しい遺伝子の同定を可能にする。当社のラベル保持アッセイは、様々な組織や細胞からの正常な幹細胞分離、および癌幹細胞研究に適用可能です。重要なことに、このアッセイは、乳癌および大腸癌などの他の上皮細胞癌に適用可能である。100ミリメートルの培養皿を2.5マイクログラムフィブロネクチン溶液の2ミリリットルでコーティングし、室温で一晩インキュベートします。その後、溶液を吸引し、培養皿をバイオセーフティキャビネット内で45分間空気乾燥させます。前立腺上皮細胞増殖培地をフィブロネクチンコーティング皿に9ミリリットル加え、摂氏37度の二酸化炭素インキュベーターで温かく保ちます。37°Cの水浴で凍結したヒト前立腺上皮細胞のバイアルを1バイアルで解凍し、10ミリリットルの温かい培地で細胞を再懸濁する。5分間500回gで細胞懸濁液を遠心分離する。その後、吸引し、上清を捨てます。細胞を温かい培養培地の1ミリリットルに再懸濁し、1ミリリットルの懸濁液を、あらかじめ温めた培地でフィブロネクチンコーティング皿に直接移す。その後、摂氏37度で二酸化炭素インキュベーターに皿をインキュベートします。細胞に共同標識を付ける場合は、テキスト原稿に記載されている10日間の2D培養でBrdU標識細胞を調製する。その後、5つのマイクロモルCFSEまたはファーレッドを加え、30分間細胞をインキュベートします。インキュベーション後、慎重に色素で培地を吸引し、5ミリリットルの温かいPBSで細胞を2回洗浄する。次に、原稿の指示に従って05%トリプシンEDTAで酵素消化を行う。500回gで細胞を5分間遠心し、上清を捨てます。細胞を氷冷、1対1の基体膜マトリックスおよび培養培地ミックス中に再懸濁し、3Dプロスフィア形成を行った。3D基質マトリックスシステムでプロスフィア培養を調製するには、基膜マトリックスを摂氏4度で一晩解凍し、使用前に氷の上に保管します。その後、氷冷基膜マトリックスの1ミリリットルを同量の氷冷培養培地にそっと加えます。ピペットは上下に混ざり、気泡を導入しないように注意してください。氷冷1対1基膜マトリックスと培養培地ミックス中のヒト前立腺上皮細胞の5倍を50~1/4回再懸濁し、合計体積500マイクロリットルを混合する。各ウェルの下縁に溶液をピペットし、均等に混合物を分配するためにプレートを旋回します。プレートを37°Cの二酸化炭素インキュベーターに30分間置き、マトリックスを固めます。その後、リングを乱さないように、井戸あたり1ミリリットルの温かい培養培地で覆います。CFSE標識プロスタフェアを収穫するには、2ミリリットルのディスパーゼとピペットを上下に置き換えて数回混合します。37°Cでプレートを30分間インキュベートしてマトリックスを消化し、球体混合物を15ミリリットルの遠心分離管に集めます。500回gで球を5分間遠心し、上清を捨てます。ペレットを暖かい05%トリプシンEDTAの500マイクロリットルに再懸濁し、1.5ミリリットルの遠心分離管に移します。37°Cで5分間、球をインキュベートし、10%FBSで500マイクロリットルの温かいPBSを加えます。26ゲージの針で1ミリリットルの注射器を通して、球体を完全に解体します。5分間500回gで細胞を遠心分離する。その後、吸引し、上清を捨てます。1ミリリットルの温かい培養培地で細胞を1ミリリットルに再懸濁し、ヨウ化プロピジウム1ミリグラムで死んだ細胞を染色し、室温で1分間インキュベートする。遠心分離を繰り返し、上清を捨てます。その後、1ミリリットルの温かい媒体で細胞を洗います。遠心分離を繰り返し、上清を捨てます。温かい培養培地の1ミリリットルで細胞を再懸濁し、35ミクロンの孔サイズの細胞ストレーナースナップキャップを介してそれらを濾過することによって、5ミリリットルポリスチレンラウンドボトムチューブで細胞を収集します。トリプシン分散CFSE標識プロスタ球細胞のFACS分析を行う。非標識セルを負のコントロールとして使用し、ゲートを設定するための正のコントロールとして CFSE 標識セルを使用して、サンプルを実行して、分数が設定された CFSE 高セルおよび CFSE 低セルのサブオーバジストを並べ替えて収集します。一次正常ヒト前立腺上皮細胞をフィブロネクチンコーティング培養皿に入れ、細胞増殖を2D培養で維持した。基体膜マトリックスを用いた3D培養物に移ると、分化した上皮細胞はゆっくりと消滅し、前立腺幹細胞だけが残った。2D培養における前立腺上皮細胞の二重標識は、3D培養におけるスフェロイド形成に続いて、同じ標識保持細胞におけるBrdU、CFSE、およびファーレッドの共局在化を示した。二重免疫染色は、標識保持細胞がサイトケラチンタンパク質ケラチン14の低レベルを示し、細胞結合タンパク質E-カドヘリンを減少させ、幹細胞初期マーカータンパク質Wnt10bおよびALDH1A1を増加させ、オートファジータンパク質LC3を増加させ、およびミオシンIIBを増加させることを示した。さらに、スフェロイド系のラベル保持アッセイは、前立腺癌検体における癌幹細胞様細胞の検出に成功した。CFSE標識保持幹細胞様癌細胞およびヒト前立腺癌検体由来のスフェロイドは、非標識前駆細胞に対してEカドヘリンタンパク質の減少を示した。このプロトコルを試みる際には、培地調製用の液体状のマトリックスを維持することが重要である。4度で一晩保存し、マトリックスを分配する前に氷冷PBSでピペットの先端を冷やします。スフェロイドベースのラベル保持アッセイを用いた幹細胞の単離後、単細胞RNAシーケンシングおよびプロテオーム解析を行い、幹細胞内の特定の遺伝子および新規バイオマーカーを同定することができる。スフェロイドベースの標識保持アッセイによる生きた癌幹細胞の単離は、研究者が癌幹細胞由来の腫瘍化をインビトロで成長させ、新しい抗癌薬をスクリーニングすることを可能にする。

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

3D楕円体の生成のための簡単​​なハンギングドロップ細胞培養プロトコル

簡単な方法は、関連付けられている上皮細胞上の組織線維芽細胞に及ぼす影響を分析するために記述されています。このメソッドは、三次元組織培養の組み合わせにより、3Dから分離後の細胞の分析を容易にすることができます。技術は、腫瘍細胞上の腫瘍関連間質の効果の系統的な研究を可能にする、悪性度を変化させるセルに適用されます。...

三次元混合細胞スフェロイド共培養から乳腺上皮細胞の分離

スフェロイドは、2D細胞培養単層モデルと比較して、細胞の環境をより正確に表現するために使用される3D細胞培養モデルの一種です。このプロトコル例では、科学者が結腸直腸がん細胞株からスフェロイドを作製し、生細胞イメージングを適用してスフェロイドの成長を追跡します。...

細胞株からのスフェロイド作製:三次元(3D)細胞培養法

この方法は、スフェロイドから周囲の3Dマトリックスへの癌細胞の浸潤を評価します。 スフェロイドはハンギングドロップ培養法で作製し、基底膜材料とI型コラーゲンからなるマトリックスに包埋します。 その後、スフェロイドからの侵入が監視されます。...

3Dの設定で侵略を評価するために、癌細胞スフェロイドアッセイ

間葉系幹細胞/間質細胞(MSC)の治療可能性は十分に文書化されていますが、患者のために細胞を準備する最善の方法は依然として議論の余地があります。ここでは、実験的および臨床的な応用のために、ゼノフリー条件下でプライミングされたMSCの治療用球状凝集体または「スフェロイド」を効率的に生成および投与するためのプロトコルを伝達します。...

異種非含有条件下での3次元培養における治療間葉系幹/間質細胞の生産と管理（MSC）スフェロイドプライム

ここでは、細胞凝集を通じて3D細胞スフェロイドを形成するための迅速で柔軟なプロトコルについて説明します。これは、複数の細胞タイプに容易に適応でき、細胞遊走、浸潤、アノイキスアッセイなどのさまざまなアプリケーションでの使用や、細胞-マトリックス相互作用のイメージングと定量化に適しています。...

3Dスフェロイド生産のための効率的で柔軟な細胞凝集法

光コヒーレンストモグラフィ...

光コヒーレンストモグラフィーを用いた三次元腫瘍回転楕円体の縦断的形態学的および生理学的監視

このプロトコルは、Caco2結腸腺癌細胞から3次元スフェロイドを生成し、増殖させる新規、堅牢、再現性培養システムを提示する。この結果は、化学療法への応答を含む癌幹細胞生物学を研究するためのこのアプローチの適切性に関する最初の概念実証を提供する。...

大腸癌幹細胞を研究するスフェロイドの3次元モデル

本プロトコルは、3Dプリントされたスタンプ様デバイスを使用して、大規模かつ費用対効果の高い方法で組織スフェロイドを作製する技術を記載している。...

3Dプリントされたスタンプ状デバイス による 組織スフェロイドの生成

再現性の高いスフェロイドを増殖させるためのプロトコルと、画像キャプチャとプロテオミクスを用いた表現型特性評価について紹介します。...

機能的3Dスフェロイド細胞培養の半自動表現型解析(英語)

この研究では、アガロース型にマイクロウェルを作製するためのスタンプベースのシステムを使用して、3D細胞構造を生成するための費用対効果が高く効率的な方法論を提示します。このシステムは、均一なスフェロイド/オルガノイドの形成を促進し、細胞相互作用を改善します。このアプローチは、実験のばらつきを減らし、薬物試験や組織工学への応用をサポートします。...

新規スタンプデバイスを用いた二次元細胞培養からの三次元スフェロイド/オルガノイドの作製

学ぶスフェロイドベースのラベル保持アッセイを用いた前立腺がん幹細胞の分離法。CFSEまたはFar Red標識とFACSを組み合わせ、生きた静止期幹細胞を前駆細胞から分離し、治療抵抗性のメカニズム解明と新規治療標的の同定に貢献します。

3次元スフェロイド培養からの幹様細胞の分離

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