遺伝子発現プロファイリングのための修飾法による穀物種子からの高品質なトランスクリプトームデータの取得
2020年5月21日
穀物の転写物プロファイリングの方法を提示する。マイクロアレイベースの遺伝子発現プロファイリングは、高品質の全RNAを穀物から分離することから始まり、cDNAの生成を続けています。cRNAラベリングとマイクロアレイのハイブリダイゼーションの後、シグナル検出と品質管理のための推奨事項が与えられます。
このマイクロアレイハイブリダイゼーション法は、生物由来の多数のサンプルを既知のゲノムと比較するのに有用である。高スループットシーケンシングアプローチと比較すると、この方法で生成されるデータの量は処理が非常に簡単であり、さらに、より費用対効果の高い方法で分析することができます。この手順を実証するのは、ゲータースレーベンのIPKでロシスの研究グループで働く博士研究員です。
遺伝子発現ハイブリダイゼーションキットを用いてマイクロアレイハイブリダイゼーションを行う前に、メーカーの仕様に従って10Xブロッキング剤を調製し、得られたブロッキング剤を200マイクロリットルの体積でアリコートします。次に、使用するまで、ブロッキング剤をマイナス20°Cで保存します。マイクロアレイハイブリダイゼーションの日に、氷上の10Xブロッキング剤の1つの200マイクロリットルアリコートを解凍し、ハイブリダイゼーションオーブンを摂氏65度に、ヒートブロックを摂氏60度に予熱します。
メーカーの説明に従って、各サンプルの断片化ミックスを準備し、渦の上にそっとサンプルを混ぜます。渦を巻いた後、サンプルをマイクロ遠心分離機で短時間回転させ、60°Cのヒートブロックで正確に30分間インキュベートします。インキュベーションの終わりに、2X遺伝子発現ハイブリダイゼーションバッファーの25マイクロリットルで断片化を停止する前に、氷上の各チューブを1分間すぐに冷却し、1回のチューブ当たり1分間の高回転を行う。
穏やかなピペットと混ぜ、気泡を導入しないように細心の注意を払い、周囲の室温でチューブを遠心分離します。スピンの終わりにすぐに氷の上にすべてのチューブを置き、できるだけ早くマイクロアレイスライドに各サンプルをロードします。次に、各ハイブリダイゼーションミックスの44マイクロリットルを各ガスケットウェルの中央にゆっくりと分配し、気泡を導入しないように注意し、44マイクロリットルのハイブリダイゼーションバッファーを未使用のウェルに加えます。
マイクロアレイスライドをガスケットスライドの上に正しい方向に直ちに配置し、液体をこぼさないで注意し、ハイブリダイゼーションアセンブリをしっかりと閉じます。アセンブリを回転させて、固定式の気泡の欠如を確認し、ハイブリダイゼーションチャンバーアセンブリをハイブリダイゼーションオーブン回転器に配置します。回転速度を毎分10回転に設定し、正確に17時間摂氏65度でハイブリダイゼーションを開始します。
サンプルがハイブリダイジングされている間、表に示されているように、適切な洗浄バッファーに3つの洗浄皿アセンブリを準備します。ちょうど17時間のハイブリダイゼーションの後、糸くずのない紙が並ぶラボベンチで1つのハイブリダイゼーションチャンバーを分解し、マイクロアレイバーコードが斜めの位置に向いている洗浄バッファーを含む皿に1つのマイクロアレイサンドイッチを転送します。鉗子を使用して、2つのガラススライドを分離し、ガスケットスライドがマイクロアレイスライドにしっかりと握りしながら、皿の底にそっと落とします。
マイクロアレイスライドを横にゆっくりと持ち上げて、空気への露出を最小限に抑えて皿2のマイクロアレイラックに即座に移動します。8枚のスライドがすべてラックに沿って均等に配置されたら、ラックホルダーを取り付け、皿全体を2つのセットアップを磁気スターラーに移します。セットアップを 1 分間ゆっくりかき混ぜます。
サンプルが攪拌されている間に、37°Cインキュベーターから2番目の磁気スターラーに皿3を移す。その後、泡を形成することなく、3皿に37度摂氏洗浄バッファー2を静かに追加します。攪拌インキュベーションの最後に、スライドラックを3皿にゆっくりとゆっくりと移し、ラックホルダーを取り外します。
ちょうど1分間かき混ぜた後、ゆっくりとそっと皿からスライドラックを取り出し、糸くずフリーペーパーを使用して各スライドの両側を慎重に乾燥させ、各スライドをスライドボックスに入れて乾燥させます。スライドを15分間乾燥させた後、各マイクロアレイスライドをバーコードを上向きにスライドホルダーに移し、組み立てたスライドホルダーをバーコード番号に従ってスキャンカルーセルとシーケンスにロードします。次に、スライドをすぐにスキャンします。
この図では、RNA抽出の品質を試験するためのランからの代表的な結果が示されている。大麦葉のような低デンプン含有量サンプルの典型的な分析では、葉芽細胞からの追加のリボソームRNAバンドが明らかである。大麦種子などの高デンプン含量サンプルは、18および28SリボソームRNAを示す。
葉緑体のサンプルのような、葉緑の植物組織に対して、葉緑のリボソームRNAによる自動RNA完全性値を計算できないということに注意してください。本代表分析では、カスタマイズされた大麦マイクロアレイチップへのRNA調製およびハイブリダイゼーションを実証したとおりに行った。グリッドは、キャリブレーションに使用される読み出しドットの背景とスパイクを含む、チップの各コーナーからの誘導信号の例を示しています。
ヒストグラムは、検出可能なドットの偏差とそれぞれの信号強度を示します。観察されたように、ハイブリダイゼーションが成功すると、わずかな外れ値のみで広いガウス状の曲線が得られます。検出された信号の品質管理レポートを次に示します。
ハイブリダイズされたスライドの値は 2 列目に示され、許容値の範囲は 4 桁目に示されます。この方法は、ゲノムに関する実質的な情報が利用可能な任意の生物に対して設定された実験的なアドレス指定に使用することができます。この技術をラボで使用して、成長応力誘導後に発生する米と大麦の転写変化を比較して分析することができました。
概要
この記事では、麦類のトランスクリプトームプロファイリングのためのマイクロアレイベースの方法を提示し、高品質なRNAの分離とその後のcDNA生成に焦点を当てています。この手順には、マイクロアレイハイブリダイゼーション中の信号検出と品質管理に関する詳細な推奨事項が含まれています。
主要な研究要素
科学分野
- 神経科学
- 植物生物学
- 遺伝子発現解析
背景
- マイクロアレイハイブリダイゼーションは、既知のゲノムを持つ生物の複数のサンプルを比較することができます。
- この方法は、ハイスループットシーケンシングと比較して、より管理しやすく、コスト効率が高いです。
- ライスや大麦のような麦類の転写体変化を分析するのに特に有用です。
- 信頼できる結果を確保するための品質管理措置は重要です。
研究目的
- 麦粒のトランスクリプトームプロファイリングのための堅牢な方法を開発すること。
- RNA分離とマイクロアレイハイブリダイゼーションのための詳細なプロトコルを提供すること。
- 様々な成長条件下での遺伝子発現変化の分析を容易にすること。
使用された方法
- 麦粒からの全RNAの分離。
- cDNA生成とcRNAラベリング。
- サンプル準備のための特定のプロトコルによるマイクロアレイハイブリダイゼーション。
- ハイブリダイゼーション中および後の品質管理評価。
主要な結果
- 成功したハイブリダイゼーションは、信号強度の広いガウス形の曲線を生成します。
- 品質管理レポートは、ハイブリダイゼーションされたスライドの許容可能な信号範囲を示します。
- 代表的な結果は、RNA抽出の品質とハイブリダイゼーションの効果を示します。
- この方法は、ストレスへの反応による転写体変化の比較分析を可能にします。
結論
- このマイクロアレイ方法は、麦類のトランスクリプトームプロファイリングに効果的です。
- これは、様々な条件下での遺伝子発現を分析するための信頼できるアプローチを提供します。
- 将来の応用は、利用可能なゲノム情報を持つ他の生物にまで拡張される可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Obtaining high-quality transcriptome data from cereal seeds is critical for target validation in agricultural biotechnology, where starch and sugar content often compromise RNA integrity. This method enables reliable gene expression profiling under varying developmental and stress conditions, supporting mechanistic de-risking of trait-associated targets. By delivering quantitative, reproducible transcriptomic measurements, it strengthens predictive confidence in early discovery workflows for crop improvement programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional hypotheses in cereal models with known genomes, clarifying pathway involvement in stress response.
- Operational Value: Provides standardized RNA extraction and hybridization workflows that reduce variability in target engagement studies.
- Predictive Value: Supports identification of differentially expressed genes (DEGs) and gene regulatory networks, improving confidence in target prioritization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates transcriptome-wide data suitable for biomarker discovery and phenotypic screening in grain development models.
- Operational Value: Delivers consistent signal intensity profiles with quality control metrics, enabling assay reproducibility across laboratories.
- Scalability: Compatible with microarray platforms allowing parallel processing of multiple seed genotypes or treatment conditions.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects molecular phenotypes in developing seeds to field-relevant traits through transcriptome-wide association study (TWAS) readiness.
- Mechanistic De-risking: Clarifies gene expression dynamics during germination and abiotic stress, reducing uncertainty in target mechanism.
- Predictive Confidence: Enables cross-condition comparison of transcriptomic changes, supporting go/no-go decisions in trait validation pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, particularly in crop trait validation where genomic resources exist.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via DEG analysis and gene network characterization in cereal models under stress or developmental cues.
- Screening: Enables assay-ready transcriptome profiling with quality-controlled cRNA labeling and hybridization outputs suitable for comparative screening.
- Analytics: Produces signal intensity data with Gaussian distribution and spike-in controls, allowing statistical comparison of expression levels across samples.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and TWAS applications by providing high-quality transcriptome data from germinating, developing, and mature seeds.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for transcriptome profiling across cereal species with available genome sequences, reducing redundant method development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing noise from low-quality RNA in high-starch tissues.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized blocking agent use, fragmentation timing, and wash buffer protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling cost-effective transcriptome analysis compared to sequencing, especially for large sample sets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by providing reliable expression data for prioritizing targets in abiotic stress tolerance or yield improvement programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA handling and microarray techniques to prevent degradation and ensure proper fragmentation.
- Dependent on access to hybridization ovens, magnetic stirrers, slide scanners, and microarray-compatible consumables.
- Necessitates cross-team standardization of RNA quality metrics and hybridization timing for multi-site reproducibility.
- Adaptation to non-cereal models may require validation of RNA extraction efficacy due to varying starch, sugar, or secondary metabolite content.
- Practical limitation: Manual slide handling increases risk of bubble introduction or cross-contamination during hybridization assembly.
