遺伝子発現プロファイリングのための修飾法による穀物種子からの高品質なトランスクリプトームデータの取得

このマイクロアレイハイブリダイゼーション法は、生物由来の多数のサンプルを既知のゲノムと比較するのに有用である。高スループットシーケンシングアプローチと比較すると、この方法で生成されるデータの量は処理が非常に簡単であり、さらに、より費用対効果の高い方法で分析することができます。この手順を実証するのは、ゲータースレーベンのIPKでロシスの研究グループで働く博士研究員です。

遺伝子発現ハイブリダイゼーションキットを用いてマイクロアレイハイブリダイゼーションを行う前に、メーカーの仕様に従って10Xブロッキング剤を調製し、得られたブロッキング剤を200マイクロリットルの体積でアリコートします。次に、使用するまで、ブロッキング剤をマイナス20°Cで保存します。マイクロアレイハイブリダイゼーションの日に、氷上の10Xブロッキング剤の1つの200マイクロリットルアリコートを解凍し、ハイブリダイゼーションオーブンを摂氏65度に、ヒートブロックを摂氏60度に予熱します。

メーカーの説明に従って、各サンプルの断片化ミックスを準備し、渦の上にそっとサンプルを混ぜます。渦を巻いた後、サンプルをマイクロ遠心分離機で短時間回転させ、60°Cのヒートブロックで正確に30分間インキュベートします。インキュベーションの終わりに、2X遺伝子発現ハイブリダイゼーションバッファーの25マイクロリットルで断片化を停止する前に、氷上の各チューブを1分間すぐに冷却し、1回のチューブ当たり1分間の高回転を行う。

穏やかなピペットと混ぜ、気泡を導入しないように細心の注意を払い、周囲の室温でチューブを遠心分離します。スピンの終わりにすぐに氷の上にすべてのチューブを置き、できるだけ早くマイクロアレイスライドに各サンプルをロードします。次に、各ハイブリダイゼーションミックスの44マイクロリットルを各ガスケットウェルの中央にゆっくりと分配し、気泡を導入しないように注意し、44マイクロリットルのハイブリダイゼーションバッファーを未使用のウェルに加えます。

マイクロアレイスライドをガスケットスライドの上に正しい方向に直ちに配置し、液体をこぼさないで注意し、ハイブリダイゼーションアセンブリをしっかりと閉じます。アセンブリを回転させて、固定式の気泡の欠如を確認し、ハイブリダイゼーションチャンバーアセンブリをハイブリダイゼーションオーブン回転器に配置します。回転速度を毎分10回転に設定し、正確に17時間摂氏65度でハイブリダイゼーションを開始します。

サンプルがハイブリダイジングされている間、表に示されているように、適切な洗浄バッファーに3つの洗浄皿アセンブリを準備します。ちょうど17時間のハイブリダイゼーションの後、糸くずのない紙が並ぶラボベンチで1つのハイブリダイゼーションチャンバーを分解し、マイクロアレイバーコードが斜めの位置に向いている洗浄バッファーを含む皿に1つのマイクロアレイサンドイッチを転送します。鉗子を使用して、2つのガラススライドを分離し、ガスケットスライドがマイクロアレイスライドにしっかりと握りしながら、皿の底にそっと落とします。

マイクロアレイスライドを横にゆっくりと持ち上げて、空気への露出を最小限に抑えて皿2のマイクロアレイラックに即座に移動します。8枚のスライドがすべてラックに沿って均等に配置されたら、ラックホルダーを取り付け、皿全体を2つのセットアップを磁気スターラーに移します。セットアップを 1 分間ゆっくりかき混ぜます。

サンプルが攪拌されている間に、37°Cインキュベーターから2番目の磁気スターラーに皿3を移す。その後、泡を形成することなく、3皿に37度摂氏洗浄バッファー2を静かに追加します。攪拌インキュベーションの最後に、スライドラックを3皿にゆっくりとゆっくりと移し、ラックホルダーを取り外します。

ちょうど1分間かき混ぜた後、ゆっくりとそっと皿からスライドラックを取り出し、糸くずフリーペーパーを使用して各スライドの両側を慎重に乾燥させ、各スライドをスライドボックスに入れて乾燥させます。スライドを15分間乾燥させた後、各マイクロアレイスライドをバーコードを上向きにスライドホルダーに移し、組み立てたスライドホルダーをバーコード番号に従ってスキャンカルーセルとシーケンスにロードします。次に、スライドをすぐにスキャンします。

この図では、RNA抽出の品質を試験するためのランからの代表的な結果が示されている。大麦葉のような低デンプン含有量サンプルの典型的な分析では、葉芽細胞からの追加のリボソームRNAバンドが明らかである。大麦種子などの高デンプン含量サンプルは、18および28SリボソームRNAを示す。

葉緑体のサンプルのような、葉緑の植物組織に対して、葉緑のリボソームRNAによる自動RNA完全性値を計算できないということに注意してください。本代表分析では、カスタマイズされた大麦マイクロアレイチップへのRNA調製およびハイブリダイゼーションを実証したとおりに行った。グリッドは、キャリブレーションに使用される読み出しドットの背景とスパイクを含む、チップの各コーナーからの誘導信号の例を示しています。

ヒストグラムは、検出可能なドットの偏差とそれぞれの信号強度を示します。観察されたように、ハイブリダイゼーションが成功すると、わずかな外れ値のみで広いガウス状の曲線が得られます。検出された信号の品質管理レポートを次に示します。

ハイブリダイズされたスライドの値は 2 列目に示され、許容値の範囲は 4 桁目に示されます。この方法は、ゲノムに関する実質的な情報が利用可能な任意の生物に対して設定された実験的なアドレス指定に使用することができます。この技術をラボで使用して、成長応力誘導後に発生する米と大麦の転写変化を比較して分析することができました。