ヒトの血流を模倣したフローループモデルにおける血液接触インプラントのヘモ適合性試験

このプロトコルは、国際標準化機構のガイドラインに従って、血液接触装置のヘモ適合性調査のためのモデルを提示する。このモデルは、血栓性イベントの低バックグラウンドと低濃度の抗凝固剤が血液パラメータの広範な分析を可能にするので、インプラントに対応する生理学的条件を模倣するのに理想的です。この方法は、ヘモ適合性を評価する簡単な方法を提供するので、生体材料研究に最適です。

また、前臨床試験に使用できます。ヘパリンローディングの場合、最初に0.9%塩化ナトリウムと希釈されていないヘパリンの国際単位を5,000に混合し、ヘパリン濃度のミリリットル当たり15の国際単位を得る。次に、希釈したヘパリン溶液900マイクロリットルをドナーあたり3つの中性モノベットと3つの予約モノベットに加え、ヘパリンを積んだモノベットを摂氏4度で貯蔵する。

血液サンプル採取の30分前に、モノベットを室温に置く。モノベットが温まったら、ドナー1人あたり3つのモノベットのそれぞれに9ミリリットルの血液を採取してから、各ドナーから27ミリリットルの血液をすべて単一のプラスチック容器にプールします。フローループを準備するには、対象の神経血管レーザーカットインプラントで条件ごとに少なくとも1つのチューブをロードし、0.9%塩化ナトリウムを充填した貯水池に各チューブの一端を置きます。

アンロードされたチューブを貯留槽に入れ、すべてのチューブをポンプヘッドに接続します。次に、各チューブの反対側を測定シリンダーに挿入し、測定シリンダーの充填レベルを確認しながらタイマーを使用して毎分150ミリリットルの流量に蠕動ポンプの設定を調整します。血溶性検査では、12ミリリットルの注射器を使用して、各チューブを6ミリリットルの血液で満たします。

回路を形成した後、シリコン接続チューブの長さ0.5センチメートルを使用してチューブをしっかりと閉じ、チューブを37°Cの水浴に入れます。その後、60分のチューブを開始します。全血数分析のために、非浸透血液の1.2ミリリットルまたはEDTAを含む個々のモノベットに灌流した後、各チューブから1.2ミリリットルの血液を加える。

慎重にモノベットを5回反転し、各サンプルの血球数分析のために血液分析装置にバイアルをロードします。分析の最後に、モノベットを氷の上に15〜60分間置きます。クエン酸血漿採取の場合、クエン酸含有モノベットを1.4ミリリットルのノンパーフューズまたは浸透血液で満たし、各モノベットを慎重に5回反転させます。

遠心分離によってプラズマを分離し、個々の1.5ミリリットル反応管に血漿分率の3つの250マイクロリットルのアリコートを移す。その後、プラズマサンプルを液体窒素で凍結し、分析までマイナス20度で保存します。EDTA血漿採取の場合、血数測定後の摂氏4度のインキュベーションの後、遠心分離によって血漿を分離し、血漿分画の3つの250マイクロリットルアリコートを個々の1.5ミリリットル反応管に移す。

その後、プラズマサンプルを液体窒素で凍結し、マイナス20°Cの貯蔵を行います。CTAD血漿採取の場合、CTAD含有モノベットに2.7ミリリットルの新鮮な血液または浸透した血液を充填し、チューブを慎重に5回反転させます。遠心分離によってプラズマを収集する前に、15〜60分間氷の上にモノベットを置きます。

各中間プラズマ分率の700マイクロリットルを個々の1.5ミリリットル反応管に移し、再び充填された反応管を遠心分離します。その後、中間分画の2つの100マイクロリットルアリコートを個々の1.5ミリリットル反応管に移し、液体窒素中のチューブを液体窒素で凍結し、マイナス20°Cで貯蔵します。クエン酸プラズマサンプルのTATレベルを測定するには、ELISAサンプルバッファーの50マイクロリットルを96ウェルの平底プレートの各ウェルに加え、プラズマ標準、プラズマ制御、および希釈されていないプラズマサンプルをプレートの適切なウェルに複製します。

プレートを密封した後、穏やかな揺れで15分間摂氏37度でサンプルをインキュベートします。インキュベーションの終わりに、ペルオキシダーゼを共役した抗ヒトTAT抗体を各ウェルに100マイクロリットル添加する前に、ウェルあたり300マイクロリットルの洗浄液でプレートを3回洗浄します。37°Cで15分間のインキュベーションを行い、1ウェルあたり300マイクロリットルの新鮮な洗浄液で3回洗浄します。

最後の洗浄後、室温で30分間インキュベーションするために、井戸ごとに100マイクロリットルのクロモーゲン溶液を加えます。インキュベーションの最後に、各ウェルに100マイクロリットルのストップ溶液を加え、各サンプルのTAT濃度を計算するためのトレンドラインとして標準曲線データを使用して、490〜500ナノメートルの光度計の光学密度を読み取ります。走査型電子顕微鏡用のインプラントを準備するには、鉗子を使用してチューブからインプラントを取り除き、各インプラントを洗浄ごとに新鮮な0.9%塩化ナトリウムで3回簡単に洗い流します。

最後の洗浄後、2%グルタルアルデヒドの個々の容器にインプラントを保管し、カルシウムとマグネシウムを一晩摂氏4度で使用せずに保管します。翌朝、PBSの個々の容器内のインプラントを10分間インキュベートしてから、示された濃度あたり10分間エタノールの上昇濃度でインプラントを脱水する。採血と灌流の直後に、白血球や赤血球の数、またはヘマトクリット値に変化は検出されない。

しかし、フローループシステム内での灌流後にヘモグロビンレベルの低下が検出される。血小板数の減少も観察され、それは、チューブ内にコーティングされていないステントが存在する場合に増加する。特に、血液がフィブリンヘパリンコーティングステントでインキュベートされると、この損失は減少する。

TAT複合体濃度は、灌流に応答して軽度に増加する。ベアメタルステントを添加すると、TATの有意な増加が検出され、凝固系の深い活性化を示す。フィブリンヘパリンコーティングステントを使用すると、この活性化を防ぐことができます。

灌流は、コーティングされていないまたはフィブリンヘパリンコーティングされたステントの存在の影響を受けない賛辞カスケードの活性化の増加につながります。同様に、好中球顆粒球は、多形核中球エラスターゼレベルの定量化によって証明されるように活性化される。走査電子顕微鏡による可視化は、フィブリンヘパリンコーティングステントでは観察されない灌流後の未コーティングステントの表面に血液細胞とタンパク質の密なネットワークが存在することを明らかにする。

血液がサンプルを得るための包含基準を満たしていることを確認し、できるだけ速く採取した新しい血液を使用することが最も重要です。ヒトの血液は血液中のウイルスやその他の薬剤を含み、感染のリスクを伴う可能性があるため、サンプルを取り扱う際には必ず適切なPPEを着用してください。