Name: ヒトの血流を模倣したフローループモデルにおける血液接触インプラントのヘモ適合性試験 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: 学ぶ 血液接触インプラントのヘモ適合性評価法。ヒトの生理的条件を模倣したフローループモデルを用いて、レーザーカット神経血管インプラントの安全性を評価する。バイオマテリアル研究や前臨床試験に有用です。

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走査型電子顕微鏡の性能については、大学病院テュービンゲンの医学材料科学技術部門のエルンスト・シュヴァイツァーに感謝します。研究は、国家持続可能性プログラムII(プロジェクトBIOCEV-FAR LQ1604)内のCRの教育・青少年・スポーツ省とチェコ科学財団プロジェクト第18-01163Sによって支援されました。

血液採取手順は、火ビンゲン大学の医学部の倫理委員会によって承認されました (プロジェクト識別コード: 270/2010BO1).すべての被験者は、参加前に包含のための書面によるインフォームド・コンセントを提供しました。
1. ヘパリンを積んだモノベットの準備
<ol><li>希釈されていないヘパリン(5,000 IU/mL)と塩化ナトリウム(NaCl、0.9%)を混ぜる15 IU/mLのヘパリンの結果濃度の溶液を調製した。</li>
	<li>各中性モノベット(9 mL)に希釈ヘパリン溶液900μLを加えて、血液サンプリング後に1.5 IU/mLの最終ヘパリン濃度を得る。ドナー1人につき3個のモノベットと3枚のリザーブモノベットを用意し、ヘパリンを積んだモノベットを4°Cで血液サンプリングまで保存します。</li>
</ol>2. 血液サンプリング
<ol><li>血液サンプリングの30分前に冷蔵庫からヘパリンを積んだモノベットを取り出します。</li>
	<li>フローループの静脈穿刺により、各健常ドナー(n=5)から27mLの血液サンプルを採取する。血小板と血液凝固カスケードの早期活性化を避けるために滑らかな止血帯のみを適用します。</li>
	<li>ヘパリン溶液(1.5 IU/mL)900 μLを含む3つのモノベットで血液サンプルを採取し、3つのモノベットをすべて1つのプラスチック容器にプールして、すべての成分が均等に分配されるようにします。</li>
	<li>プールされたヘパリン化された血液を、EDTA(1.2 mL)、クエン酸(1.4mL)、クエン酸、テオフィリン、アデノシン、ジピリダモレ(CTAD、2.7 mL)のいずれかを含む3つの異なるモノベットに直接移し、ベースライン値を収集する。セクション 5-8 で説明されているように、サンプルを続行します。 注:影響を受けていない凝固行動を保証するために、ドナーは、過去14日以内に止止め薬(例えば、アセチルサリチル酸、ナプロキセン、カルベニシリン)の摂取、経口避妊薬および喫煙を避けるべきである。</li>
</ol>3. フローループの準備
<ol><li>ヘパリンコーティングポリ塩化ビニルチューブを3本カットし、長さ75cm、内径3.2mmで、フィブリンヘパリンコーティングの有無にかかわらず、神経血管レーザーカットインプラントでチューブをロードします。1 つの浴槽をコントロールとしてアンロードしたままにすることを忘れないでください。</li>
	<li>チューブの一方の端を0.9%NaClで満たされた貯水池に置き、チューブをポンプヘッドに接続し、もう一方の端を測定シリンダーに挿入します。</li>
	<li>測定シリンダーの充填レベルを確認しながらタイマーを使用して、150 mL/minの流量を達成するために蠕動ポンプの設定を調整します。</li>
</ol>4. ヘモ互換性テストの性能
<ol><li>血液でチューブを充填するために12 mLの注射器を使用してください。6 mLの血流をサンプルまたはアンロードされたコントロールを含む各チューブにスムーズに流れ込ませます。</li>
	<li>回路を形成し、シリコン接続チューブの長さ0.5cmを使用してチューブをしっかりと閉じます。37°Cの水浴にチューブを入れ、60分間の灌流を開始します。</li>
</ol>5. 全血数分析
<ol><li>サンプリング後(ベースライン)またはEDTAを含むモノベットに灌流した後に1.2mLの血液を入れ、チューブ5xを慎重に反転させます。</li>
	<li>モノベットを血液分析装置に挿入し、すべてのサンプルの血球数分析を行います。次に、セクション7に記載されているように、さらに分析するために、血数測定後15〜60分間氷上のモノベットをインキュベートします。</li>
</ol>6. クエン酸プラズマの収集
<ol><li>クエン酸を含むモノベットを1.4mLの血液(新鮮な血液または循環後)で満たし、慎重に5倍を反転させます。</li>
	<li>室温(RT)で1,800 x gで18分間チューブを遠心分離します。アリコート 3 つのプラズマ分率の 250 μL サンプルを 1.5 mL 反応チューブに入れ、プラズマサンプルを液体窒素で凍結します。分析まで-20°Cで保管してください。</li>
</ol>7. EDTAプラズマの収集
<ol><li>血数測定後15~60分間、氷上のモノベットをインキュベートします。次いで、チューブを2,500xg及び4°Cで20分間遠心する。</li>
	<li>遠心分離後の1.5 mL反応管にプラズマ分率の3つの250 μLサンプルをアリコートし、液体窒素中のチューブを凍結します。分析まで-80°Cで保管してください。</li>
</ol>8. CTADプラズマの収集
<ol><li>CTAD混合物を含むモノベットを2.7mLの血液(新たにまたはインキュベーション後)で満たし、慎重に5倍を反転させます。その後、氷上のモノベットを15~60分間インキュベートします。次いで、チューブを2,500xg及び4°Cで20分間遠心する。</li>
	<li>中血漿分率700μLを1.5mL反応管に移し、充填された反応管を2,500 x gおよび4°Cで20分間遠心分離します。</li>
	<li>遠心分離後の1.5 mL反応管に中画の2つの100 μLサンプルをアリコートし、液体窒素でチューブを凍結します。分析まで-20°Cで保管してください。 注:EDTAプラズマとCTADプラズマの収集は、動作条件が同じであるため、一緒に行うことができます。</li>
</ol>9. クエン酸プラズマからのヒトTATの測定
<ol><li>37°Cの水浴でクエン酸プラズマを解凍します。</li>
	<li>メーカーの指示に従って、TAT酵素結合免疫吸着測定(ELISA)キットをご使用ください。血漿規格を再構築し、洗浄液、抗ヒトTATペルオキシダーゼ(POD)共役抗体、およびクロモゲン溶液を希釈して、洗浄液を制御します。テストを開始する前に、すべての試薬とマイクロタイタープレートをRT(15-25°C)に30分間放置してください。</li>
	<li>サンプルバッファーの 50 μL をマイクロタイタープレートの各ウェルにパイプし、サンプルバッファー (ブランク)、プラズマ標準、プラズマ制御、および希釈されていないプラズマサンプルをウェルプレートに 50 μL 追加します。プレートを密封し、37°Cで15分間、穏やかな揺れでインキュベートします。その後、300μLの洗浄液でプレート3xを洗浄する。</li>
	<li>POD結合抗ヒトTAT抗体を100μLずつ添加します。プレートを密封し、37°Cで15分間、穏やかな揺れでインキュベートします。その後、300μLの洗浄液でプレート3xを洗浄する。</li>
	<li>作りたてのクロモージェン溶液を100μLずつ加えます。プレートを密封し、RTで30分間インキュベートします。</li>
	<li>シールフィルムを取り外し、各ウェルに100 μLのストップ溶液を追加します。光密度(OD)を490-500 nmのフォトメーターで読み込みます。標準曲線データをトレンドラインとして適合させ、サンプルの濃度を計算します。</li>
</ol>10. クエン酸プラズマからのPMN-エラスターゼの測定
<ol><li>水浴中のクエン酸プラズマを37°Cで解凍します。</li>
	<li>メーカーの指示に従って多形核(PMN)-エラスターゼELISAキットを使用してください:PMN-エラスターゼコントロールとPMNエラスターゼ標準を再構築し、キットの希釈バッファーを使用して標準曲線を作成します。</li>
	<li>メーカーの説明に従って洗浄液を希釈します。テストを開始する前に、すべての試薬とマイクロタイタープレートをRTに30分間放置してください。クエン酸プラズマサンプルを希釈バッファーで 1:100 に希釈します。</li>
	<li>サンプルバッファー(ブランク)、PMN-エラスターゼ標準曲線(15.6-1,000 ng/mL)、PMN-エラスターゼコントロール(高濃度および低濃度)、希釈された血漿サンプルをウェルプレートに加えます。プレートを密封し、RTで60分間穏やかな揺れでインキュベートします。その後、300 μLの洗浄液でプレート4xを洗浄します。</li>
	<li>酵素共役抗体を各ウェルに150 μL添加します。プレートを密封し、RTで60分間穏やかな揺れでインキュベートします。その後、300 μLの洗浄液でプレート4xを洗浄します。</li>
	<li>3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(TMB)基板溶液を各ウェルに200 μL添加します。プレートを密封し、暗闇の中で20分間RTでインキュベートします。次にシールフィルムを取り外し、各ウェルに50μLの停止溶液を加えます。</li>
	<li>630 nmで参照読み取り値を持つ450 nmのフォトメーターでODを読み取ります。標準曲線データをトレンドラインとして適合させ、サンプルの濃度を計算します。</li>
</ol>11. EDTAプラズマからの端子補体複合体(TCC)の測定
<ol><li>37°Cの水浴中のEDTAプラズマを解凍し、解凍後に氷の上に保管します。</li>
	<li>補数カスケード SC5b-9 ELISA キットをメーカーの指示に従って使用します: メーカーのプロトコルに記載されているように洗浄液を希釈します。テストを開始する前に、すべての試薬とマイクロタイタープレートをRTに30分間放置してください。EDTAプラズマサンプルを、キットの希釈バッファーで1:10まで希釈します。</li>
	<li>300 μLの洗浄液を各ウェルに加えて、2分後に表面を水分補給し、吸引します。</li>
	<li>プレートを密封し、RTで60分間インキュベートします。次に、300 μLの洗浄液でプレート5倍洗います。</li>
	<li>酵素共役抗体を各ウェルに50μL加えます。プレートを密封し、RTで30分間インキュベートします。その後、プレート5xを300μLの洗浄液で洗浄する。</li>
	<li>TMB基板ソリューションの100 μLを各ウェルに追加します。プレートを密封し、暗闇の中で15分間RTでインキュベートします。</li>
	<li>シールフィルムを取り外し、各ウェルに100 μLの停止溶液を追加します。450 nmで光度計でODを読み取ります。標準曲線データをトレンドラインとして適合させ、サンプルの濃度を計算します。</li>
</ol>12. CTADプラズマからのβ-トロンボグロブリンの測定
<ol><li>CTADプラズマを水浴中で37°Cで解凍します。</li>
	<li>メーカーの指示に従ってβ-トロンボグロブリン(β-TG)ELISAキットを使用してください:β-TGコントロールとβ-TG標準を再構築し、蒸留されたH2Oを使用して洗浄液を希釈し、提供されたリン酸バッファーを使用してPOD共役抗体を再構築します。テストを開始する前に、すべての試薬とマイクロタイタープレートをRTに30分間放置してください。</li>
	<li>標準曲線と制御は、提供されたリン酸バッファーを使用してメーカーの指示に従って準備します。CTADプラズマサンプルを1:21に希釈します。</li>
	<li>200 μL のリン酸バッファー(ブランク)、β-TG 標準、β-TG コントロール(高濃度および低濃度)、希釈された血漿サンプルをウェルプレートに重複させます。プレートを密封し、RTで60分間インキュベートし、その後、300 μLの洗浄液でプレートを5倍洗います。</li>
	<li>各ウェルに酵素共役抗体を200μL加えます。プレートを密封し、RTで60分間インキュベートし、その後、300 μLの洗浄液でプレートを5倍洗います。</li>
	<li>TMB基板ソリューションの200 μLを各ウェルに追加します。プレートを密封し、暗闇の中で5分間RTでインキュベートします。シールフィルムを取り外し、各ウェルに1M硫酸(H2SO4)の50μLを加えて反応を停止します。</li>
	<li>プレートを15~60分間放置し、450 nmのフォトメーターでODを読み取ります。標準曲線データをトレンドラインとして適合させ、サンプルの濃度を計算します。</li>
</ol>13. 走査型電子顕微鏡のサンプル調製
<ol><li>鉗子を使用してチューブからインプラントを取り出し、インプラントを0.9%NaCl溶液3xに浸して短時間すすいで下さい。</li>
	<li>グルタルアルデヒド溶液(リン酸緩衝生理食塩水中2%グルタルアルデヒド[CA2+/Mg2+なしのPBS緩衝液]を4°Cで一晩保存する。</li>
	<li>次に、10分間PBSバッファーにインプラントをインキュベートし、それぞれ10分間の濃度を上げるとエタノール中でインキュベートしてサンプルを脱水します:40%、50%、60%、70%、80%、90%、96%、および100%。脱水サンプルを100%エタノールに保存して、さらに分析します。</li>
	<li>走査型電子顕微鏡(SEM)の直前に乾燥装置または文献10の指示に従って臨界点乾燥を行う。</li>
</ol>14. 走査型電子顕微鏡
<ol><li>乾燥したインプラントを走査顕微鏡用のサンプルキャリアに取り付け、サンプルを金色のパラジウムでスパッタします。</li>
	<li>スパッタリングされたインプラントをサンプルチャンバーに導入します。代表的な表面と細胞接着を持つ領域の100、500-、1,000倍、2,500倍の倍率で写真を撮ります。</li>
</ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

提示された議定書は人間の血流を模倣するせん断流モデルのISO 10993-4に従って血通しのインプラントのヘモ適合性テストのための包括的で信頼できる方法を記述する。この研究は、レーザーカット神経血管インプラントのテストに基づいていますが、様々なサンプルで行うことができます。この方法により、血球数、いくつかの血性適合マーカーの有病率、および血球接触後のデバイス表面の顕微鏡的可視化などの様々なパラメータの広範な分析が可能であることを実証した。このプロトコルを使用すると、異なるデバイスのヘモ互換性に関する潜在的な違いを検出できます。
in vitroヘモ適合性評価の代替は、生体内動物実験の選択肢であり、組織損傷の圧倒的な短期的効果によるデバイス関連の影響の変動性および歪みが高いなど、いくつかの欠点に関連する6。
インビトロ血体適合性試験では、(1)静的血液インキュベーションモデル、(2)撹拌血液インキュベーションモデル、(3)せん断流モデルの3種類のモデルが利用可能です。静的モデルは、...

ヒトの血液と相互作用するインプラントや生体材料の生体内応用には、止血システムの様々なマーカーの調査に焦点を当てた強力な前臨床試験が必要です。国際標準化機構10993-4(ISO 10993-4)は、血液接触装置(すなわち、ステントおよび血管移植片)の評価の中心原則を規定し、デバイス設計、臨床有用性、および必要な材料を考慮する。
ヒト血液は、白血球(白血球[BPC])、赤血球(赤血球[RBC])、血小板など、さまざまな形質タンパク質や細胞を含む流体であり、人体2において複雑な機能を行う。血液との異物の直接接触は、炎症または血栓性合併症および移植後の深刻な問題を引き起こす可能性がある免疫または凝固系の活性化などの副作用を引き起こす可能性があります3,4,5.したがって、in vitroのヘモ適合性検証は、移植前に、異物表面6との血液の接触時に誘発される可能性のある血液学的合併症を検出および排除する機会を提供する。
提示されたフローループモデルは、脳の流れ条件と動脈径を模倣するためにチューブ(直径3.2mmの直径)に150 mL/minの流量を適用することによって神経血管ステントおよび類似の装置の血溶性を評価するために確立された2,7。最適なin vitroモデルの必要性に加えて、血液源は生体材料のヘモ適合性を分析する際に信頼性の高い、不変の結果を得るための重要な要因である8。採取した血液は、長期保存によって生じる変化を防ぐために、サンプリング直後に使用する必要があります。一般に、血液の採取中に血小板および凝固カスケードの事前活性化を最小限に抑えるために、21G針を使用して、スタシスのない血液の穏やかな収集を行う必要があります。さらに、ドナー排除基準には、喫煙、妊娠、健康状態が悪い、または過去14日間に経口避妊薬または鎮痛剤を服用した人が含まれる。
本研究では、フロー条件下でのステントインプラントの広範なヘモ適合性試験のためのインビトロモデルについて説明する。非コーティングとフィブリンヘパリンコーティングステントを比較した場合、包括的なヘモ適合性試験の結果は、フィブリンヘパリンコーティングステント9のヘモ適合性の改善を反映している。対照的に、コーティングされていないステントは、凝固カスケードの活性化を誘導し、トンビンアンチトロンビンIII(TAT)濃度の増加およびステント表面への血小板数の接着による血小板数の損失によって示される。全体的に、この血友適合モデルを前臨床試験として統合することは、装置によって引き起こされる止血システムに対するあらゆる悪影響を検出するために推奨される。

<table><tbody><tr><td>aqua ad iniectabilia</td><td>Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany</td><td>1088813</td><td></td></tr><tr><td>beta-TG ELISA</td><td>Diagnostica Stago, Duesseldorf, Germany</td><td>00950</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Rotana 460 R</td><td>Andreas Hettich, Tuttlingen,</td> <td>Germany-Citrat</td><td></td></tr> <tr><td>monovettes (1.4 mL)</td><td>Sarstedt, N&uuml;mbrecht, Germany</td><td>6,16,68,001</td><td></td></tr><tr><td>CTAD monovettes (2.7 mL)</td><td>BD Biosciences, Heidelberg, Germany</td><td>367562</td><td></td></tr><tr><td>EDTA monovettes (1.2 mL)</td><td>Sarstedt, N&uuml;mbrecht, ドイツ</td><td>6,16,62,001</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol p.A. (1000 mL)</td><td>AppliChem, Darmstadt, Germany</td><td>1,31,08,61,611</td><td></td></tr><tr><td>グルタルアルデヒド (25 % in water)</td><td>SERVA Electrophoresis, Heidelberg, Germany</td><td>23114.01</td><td></td></tr><tr><td>ヘパリンコーティング チューブ用</td><td>Ension, Pittsburgh, USA-Heparin-Natrium</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>(25.000 IE/ 5 mL)</td><td>LEO Pharma, Neu-Isenburg, Germany</td><td>PZN 15261203</td><td></td></tr><tr><td>マルチプレートリーダー Mithras LB 940</td><td>Berthold, Bad Wildbad,</td> <td>Germany-NaCl</td><td></td></tr> <tr><td>0,9%</td><td>Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany</td><td>1312813</td><td></td></tr><tr><td>Neutral monovettes (9 mL)</td><td>Sarstedt, N&uuml;mbrecht, Germany</td><td>2,10,63,001</td><td></td></tr><tr><td>PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>蠕動ポンプ ISM444B</td><td>Cole Parmer, Wertheim, Germany</td><td>3475</td><td></td></tr><tr><td>Pipette (100 &micro;L)</td><td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td><td>3124000075</td><td></td></tr><tr><td>ピペット (1000 &micro;L)</td><td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>プラスチック容器 (100 mL)</td><td>Sarstedt, N&uuml;mbrecht, ドイツ</td><td>7,55,62,300</td><td></td></tr><tr><td>PMN-Elastase ELISA</td><td>Demeditec Diagnostics, Kiel Germany</td><td>DEH3311</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinyl chloride tube</td><td>Saint-Gobain Performance Plastics Inc., Courbevoie</td> <td>France-Reaction</td><td></td></tr> <tr><td>Tubes (1.5 mL)</td><td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany</td><td>30123328</td><td></td></tr><tr><td>神経血管レーザーカットインプラント</td><td>Acandis GmbH,Pforzheim</td><td>01-0011x</td><td></td></tr><tr><td>SC5b-9 ELISA</td><td>TECOmedical, Buende, Germany</td><td>A029</td><td></td></tr><tr><td>走査型電子顕微鏡</td><td>Cambridge Instruments, Cambridge, UK</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>シーリングテープ (96 ウェルプレート)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany</td><td>15036</td><td></td></tr><tr><td>Syringe 10/12 mL Norm-Ject</td><td>Henke-Sass-Wolf, Tuttlingen, Germany</td><td>10080010</td><td></td></tr><tr><td>TATマイクロキット</td><td>Siemens Healthcare, Marburg, Germany</td><td>OWMG15</td><td></td></tr><tr><td>Waterbath Type 1083</td><td>Gesellschaft f&uuml;r Labortechnik、ブルクヴェーデル、ドイツ</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

ヒトの血流を模倣したフローループモデルにおける血液接触インプラントのヘモ適合性試験

Hemocompatibility Testing of Blood-Contacting Implants in a Flow Loop Model Mimicking Human Blood Flow

体内の循環系に残る一時的または永続的な目的のために医療機器(例えば、血管移植片、ステント、心臓カテーテル)の使用が増えている場合、これらの装置によって引き起こされる可能性のある血液学的合併症(すなわち、血液成分の活性化および破壊)を評価する信頼性の高いマルチパラメトリックアプローチが必要である。血液接触インプラントの包括的なインビトロヘモ適合性試験は、生体内での実装に成功するための第一歩です。したがって、国際標準化機構10993-4(ISO 10993-4)による広範な分析は、臨床応用前に必須です。提示されたフローループは、ステント(この場合は神経血管)の止血性能を分析し、悪影響を明らかにする敏感なモデルを記述する。新鮮な人間の全血と穏やかな血液サンプリングの使用は、血液の事前活性化を避けるために不可欠です。血液は、試験検体を含むヘパリンチューブを通して、37°Cで150 mL/minの速度で60分間の蠕動ポンプを使用して浸透する。灌流の前後、血液学的マーカー(すなわち、 血球数、ヘモグロビン、ヘマトクリット、および血漿マーカー)は、白血球(多形核[PMN]エラスターゼ)、血小板(β-トロンボグロブリン[β-TG])、凝固系(トンビンアンチトロンビンIII[TAT])、および補体カスケード(SC5b-9)の活性化を示す。結論として、我々は臨床応用前にステントおよび他の血と接触装置の広範なヘモ適合性テストのための必須で信頼できるモデルを提示する。

簡単に要約すると、ヒト全血をヘパリンを積んだモノベットで採取し、細胞数のベースラインレベルと血漿血漿血化適合マーカーを評価するために使用した。
続いて、神経血管インプラント試料を含むチューブを充填し、蠕動ポンプを用いて150mL/minで60分間、37°Cで血液を透過させた。再び、細胞数を全群で分析し、ELISA分析用に血漿サンプルを調製した(図1)。血液細胞および血液パラメータの定量は、ヘモグロビンおよびヘマトクリットなどの、全てのサンプルタイプおよび対照のためのフローループモデルに灌流した後だけでなく、採血後に直接行った。WBCの数(図2A)、RBCs(図2B)、またはヘマトクリット値(図2C)に関する変更は検出されなかった。しかし、フロール...

このプロトコルは、レーザーカット神経血管インプラントを用いた血液接触装置の包括的な血溶性評価について説明する。新鮮なヘパリン化されたヒト血液を有するフローループモデルは、血流を模倣するために適用される。灌流後、種々の血液学的マーカーを分析し、試験された装置の血相適合性評価のために採血後に直接得られた値と比較する。

The growing use of medical devices (e.g., vascular grafts, stents, and cardiac catheters) for temporary or permanent purposes that remain in the ...

このプロトコルは、国際標準化機構のガイドラインに従って、血液接触装置のヘモ適合性調査のためのモデルを提示する。このモデルは、血栓性イベントの低バックグラウンドと低濃度の抗凝固剤が血液パラメータの広範な分析を可能にするので、インプラントに対応する生理学的条件を模倣するのに理想的です。この方法は、ヘモ適合性を評価する簡単な方法を提供するので、生体材料研究に最適です。また、前臨床試験に使用できます。ヘパリンローディングの場合、最初に0.9%塩化ナトリウムと希釈されていないヘパリンの国際単位を5,000に混合し、ヘパリン濃度のミリリットル当たり15の国際単位を得る。次に、希釈したヘパリン溶液900マイクロリットルをドナーあたり3つの中性モノベットと3つの予約モノベットに加え、ヘパリンを積んだモノベットを摂氏4度で貯蔵する。血液サンプル採取の30分前に、モノベットを室温に置く。モノベットが温まったら、ドナー1人あたり3つのモノベットのそれぞれに9ミリリットルの血液を採取してから、各ドナーから27ミリリットルの血液をすべて単一のプラスチック容器にプールします。フローループを準備するには、対象の神経血管レーザーカットインプラントで条件ごとに少なくとも1つのチューブをロードし、0.9%塩化ナトリウムを充填した貯水池に各チューブの一端を置きます。アンロードされたチューブを貯留槽に入れ、すべてのチューブをポンプヘッドに接続します。次に、各チューブの反対側を測定シリンダーに挿入し、測定シリンダーの充填レベルを確認しながらタイマーを使用して毎分150ミリリットルの流量に蠕動ポンプの設定を調整します。血溶性検査では、12ミリリットルの注射器を使用して、各チューブを6ミリリットルの血液で満たします。回路を形成した後、シリコン接続チューブの長さ0.5センチメートルを使用してチューブをしっかりと閉じ、チューブを37°Cの水浴に入れます。その後、60分のチューブを開始します。全血数分析のために、非浸透血液の1.2ミリリットルまたはEDTAを含む個々のモノベットに灌流した後、各チューブから1.2ミリリットルの血液を加える。慎重にモノベットを5回反転し、各サンプルの血球数分析のために血液分析装置にバイアルをロードします。分析の最後に、モノベットを氷の上に15〜60分間置きます。クエン酸血漿採取の場合、クエン酸含有モノベットを1.4ミリリットルのノンパーフューズまたは浸透血液で満たし、各モノベットを慎重に5回反転させます。遠心分離によってプラズマを分離し、個々の1.5ミリリットル反応管に血漿分率の3つの250マイクロリットルのアリコートを移す。その後、プラズマサンプルを液体窒素で凍結し、分析までマイナス20度で保存します。EDTA血漿採取の場合、血数測定後の摂氏4度のインキュベーションの後、遠心分離によって血漿を分離し、血漿分画の3つの250マイクロリットルアリコートを個々の1.5ミリリットル反応管に移す。その後、プラズマサンプルを液体窒素で凍結し、マイナス20°Cの貯蔵を行います。CTAD血漿採取の場合、CTAD含有モノベットに2.7ミリリットルの新鮮な血液または浸透した血液を充填し、チューブを慎重に5回反転させます。遠心分離によってプラズマを収集する前に、15〜60分間氷の上にモノベットを置きます。各中間プラズマ分率の700マイクロリットルを個々の1.5ミリリットル反応管に移し、再び充填された反応管を遠心分離します。その後、中間分画の2つの100マイクロリットルアリコートを個々の1.5ミリリットル反応管に移し、液体窒素中のチューブを液体窒素で凍結し、マイナス20°Cで貯蔵します。クエン酸プラズマサンプルのTATレベルを測定するには、ELISAサンプルバッファーの50マイクロリットルを96ウェルの平底プレートの各ウェルに加え、プラズマ標準、プラズマ制御、および希釈されていないプラズマサンプルをプレートの適切なウェルに複製します。プレートを密封した後、穏やかな揺れで15分間摂氏37度でサンプルをインキュベートします。インキュベーションの終わりに、ペルオキシダーゼを共役した抗ヒトTAT抗体を各ウェルに100マイクロリットル添加する前に、ウェルあたり300マイクロリットルの洗浄液でプレートを3回洗浄します。37°Cで15分間のインキュベーションを行い、1ウェルあたり300マイクロリットルの新鮮な洗浄液で3回洗浄します。最後の洗浄後、室温で30分間インキュベーションするために、井戸ごとに100マイクロリットルのクロモーゲン溶液を加えます。インキュベーションの最後に、各ウェルに100マイクロリットルのストップ溶液を加え、各サンプルのTAT濃度を計算するためのトレンドラインとして標準曲線データを使用して、490〜500ナノメートルの光度計の光学密度を読み取ります。走査型電子顕微鏡用のインプラントを準備するには、鉗子を使用してチューブからインプラントを取り除き、各インプラントを洗浄ごとに新鮮な0.9%塩化ナトリウムで3回簡単に洗い流します。最後の洗浄後、2%グルタルアルデヒドの個々の容器にインプラントを保管し、カルシウムとマグネシウムを一晩摂氏4度で使用せずに保管します。翌朝、PBSの個々の容器内のインプラントを10分間インキュベートしてから、示された濃度あたり10分間エタノールの上昇濃度でインプラントを脱水する。採血と灌流の直後に、白血球や赤血球の数、またはヘマトクリット値に変化は検出されない。しかし、フローループシステム内での灌流後にヘモグロビンレベルの低下が検出される。血小板数の減少も観察され、それは、チューブ内にコーティングされていないステントが存在する場合に増加する。特に、血液がフィブリンヘパリンコーティングステントでインキュベートされると、この損失は減少する。TAT複合体濃度は、灌流に応答して軽度に増加する。ベアメタルステントを添加すると、TATの有意な増加が検出され、凝固系の深い活性化を示す。フィブリンヘパリンコーティングステントを使用すると、この活性化を防ぐことができます。灌流は、コーティングされていないまたはフィブリンヘパリンコーティングされたステントの存在の影響を受けない賛辞カスケードの活性化の増加につながります。同様に、好中球顆粒球は、多形核中球エラスターゼレベルの定量化によって証明されるように活性化される。走査電子顕微鏡による可視化は、フィブリンヘパリンコーティングステントでは観察されない灌流後の未コーティングステントの表面に血液細胞とタンパク質の密なネットワークが存在することを明らかにする。血液がサンプルを得るための包含基準を満たしていることを確認し、できるだけ速く採取した新しい血液を使用することが最も重要です。ヒトの血液は血液中のウイルスやその他の薬剤を含み、感染のリスクを伴う可能性があるため、サンプルを取り扱う際には必ず適切なPPEを着用してください。

hemocompatibility-testing-blood-contacting-implants-flow-loop-model

Research

JoVE Journal

Medicine

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