血管医療機器の血球適合性と宿主細胞活性化を調べるインビトロ血球ループモデル

ここで示されているのは、標準化された体外血球ループモデルのプロトコルです。このモデルは、輸血チューブまたは血管ステントのヘモ適合性を試験することを可能にする ISO (国際標準化機構) 標準 10993-4 に準拠する。

この血行性ループモデルにより、研究者は灌流管やステントなどの血管デバイスの体外ヘモ適合性をテストすることができます。標準化された条件下で。したがって、この技術は機械的な力によって血液に影響を及ぼさないので、それによって血液成分の本質的な活性化によって誤解を招く結果を避ける。

実験を試みる前に、適切な機械部品アセンブリ、完璧なループ閉鎖システムの構築、ループへの血液のローディングの遅さを実践する必要があります。ループアセンブリを準備するには、チューブカッターを使用して、平らな表面に長さ250センチメートル、5ミリメートルの内径のチューブをカットします。そして、チューブの開いた結末を、調査チューブの外径に合ったシリコンチューブの短い部分に差し込んでループ形状を生成します。

テンションバンドコネクタのロックネジを慎重に締め、2つの曲げ間に隙間が残るように閉じる力を調整します。ロックねじが完全に締め付けられており、ポリカーボネートバンドの張力が低すぎて2つの曲げ間のギャップを閉じないように見える場合は、ロックシステムを開き、テンションバンドの数ミリメートルをカットします。ステントループアセンブリを準備するには、ループの2つを開き、テンションバンドシステムからチューブを取り出します。

次に、メーカーの指示に従って、ステントをチューブの中央に挿入します。実験用のループの適切な数が生成されると、37度の水浴の外側に、回転ユニットのループクレードルにループを固定し、水浴内の回転ユニットにループクレードルを取り付けます。次に、150マイクロリットルまたは調製したヘパリンストック溶液で採取される血液の2つのループごとに1つの10ミリリットルの注射器を充填し、21ゲージの蝶を使用して注射器に血液を穏やかに収集し、過度の真空によるホモリシスまたは細胞活性化を避けるように注意してください。

すべての血液が採取されると、血液をガラスビーカーに移し、5ミリリットルの血清ピペットを使用して、血液とヘパリンを穏やかに混合する。管に十分に挿入されていないピペット先端で均質な溶液が得られた場合は、慎重に、5ミリリットルの血液で各ループを充填する。ループが満杯になった後、各ループを閉じ、ループ、テンションバンド、ラックが適切に固定されていることを確認します。

次に、ループを毎分30回転で3時間回転させます。回転の終わりに、ループが慎重にコネクタを開き、個々の10ミリリットルガラスビーカーに重複から血液を引っ張る前に、ループがループ底部に蓄積するように2分間ラックに立たせます。すべての血液が採取されると、各チューブを10ミリリットルのPBSですすいで、メスを使って各チューブの端から1センチメートルのサンプルを慎重に切断します。

サンプルを摂氏4度で2%グルタルアルデヒドで一晩インキュベートし、続いて室温で15分間のインキュベーションと1%オスミウム四酸化された。四酸化オスミウムインキュベーションの終わりに、1濃度あたり20分間上昇エタノール系列でサンプルを脱水し、その後100%エタノールで30分間脱水した。100%エタノールインキュベーションの終わりに、X線マイクロCTスキャナーを使用して、5キロボルトの加速電圧で電子顕微鏡を走査してサンプルを画像化する前に、サンプルを室温で一晩乾燥させます。

血液サンプルのフローサイトメトリック解析のため。各サンプルから100マイクロリットルの血液を9つの5ミリリットルのFACSチューブのそれぞれに移し、光から保護された室温で15分間、チューブあたり4%パワーホルムアルデヒドの100マイクロリットルを加えてサンプルを固定します。洗浄後、各ペレットを1本の赤血球ライシスバッファーに1ミリリットルで再懸濁し、室温で5分間インキュベーションし、光から保護する。

インキュベーションの終わりに、チューブあたりPBSの1ミリリットルで遠心分離によってサンプルを洗浄し、氷の上に上澄みなしでサンプルを置きます。単一の染色補償ビーズを調製するには、FACSバッファーの個々の1ミリリットルの体積に4滴の正と4滴の負のビーズを加え、渦液溶液を均質なビーズ懸濁液を得る。示されたラベルが付いた4つまたは5つのミリリットルのFACSチューブのそれぞれに各溶液の100マイクロリットルを加え、チューブあたり1ミリリットルのFACSバッファでビーズを洗います。

次に、適切な渦性抗体カクテルの100マイクロリットルを各実験および蛍光から穏やかな混合で1チューブを加えます。光から保護された室温で30分間のインキュベーションを行う。インキュベーションの最後に、サンプルあたり1ミリリットルの新鮮なFACSバッファーでサンプルを洗浄し、チューブあたり250マイクロリットルのFACSバッファーでペレットを再懸濁します。

標準的なプロトコルに従ってフローサイトメトリーによって細胞サンプル上のビーズを分析する前に。血球分布は、マイクロCTと走査型電子顕微鏡イメージングによってスプライスされた2つのブループの表面全体にわたって視覚化することができ、隙間のない閉じたループでは血栓は観察されません。全血球数の分析は、試験された条件のいずれとも赤血球数の有意差を示さないが、しかしながら、ラテックスループ群において大幅に減少し、遊離ヘモグロビン数が劇的に増加し、ラテックスの生体適合性が非常に低いことが示される。

試験された血管装置のすべては、凝固システムおよび賛辞成分の増加活性化を誘発しながら。ヘパリンコーティングされたPVCループは、ポリマーコーティング、PVCループと比較して、両方のタイプの活性化の減少レベルの傾向を示しています。ラテックスループは、TNF IL-6およびPMNエラスターゼの最高レベルを示し、ラテックスによる白血球の強力な活性化を強調する。

ラテックスチューブから回収されたCD41陽性血小板は、CD62Pに対して非常に高い中央値蛍光強度を示し、一方で顆粒球およびリンパ球で一体化発現が大幅に減少する。興味深いのは、ラテックスチューブからの単球において積分レベルが高く、単球活性化血小板相互作用を示唆している。単球血小板凝集体の染色は、ラテックスおよびステントループにおける凝集の増加傾向を明らかにする。

ラテックスループ内の単球の頻度が減少したにもかかわらず。固有の血液成分の活性化を避けるために、適切なループ閉鎖を確保し、注意して血液を処理することが重要です。従ってこの手順に従って、炎症または薬学的研究に使用される同種異系タンパク質またはTRUCKsと血液成分との相互作用を分析することができる。