細菌における抗生物質の持続性を研究するためのマイクロ流体タイムラプス顕微鏡

蛍光標識DNA結合融合タンパク質を発現する指数関数的に成長する細菌細胞から始めて、核様体を視覚化します。

事前に準備されたマイクロ流体プレートの細胞入口に細胞を追加します。

次に、抗生物質含有培地と抗生物質を含まない培地を別々の溶液入口に導入します。

プレートを密封し、顕微鏡ステージに取り付け、タイムラプスイメージングを開始します。

まず、細胞を培養チャンバーにロードします。

次に、抗生物質を含まない培地をチャンバーに灌流して、指数関数的な細胞増殖をサポートします。

最後に、抗生物質含有培地を導入します。

抗生物質は二本鎖DNA切断を誘導し、感受性細胞を殺します。これらの細胞は、安定した蛍光を持つ圧縮された非複製核様体を示します。

回復を促進するために、抗生物質を含まない培地に戻します。

持続性細胞(抗生物質治療を生き延びる小さな亜集団)は、DNA複製を再開し、伸長し、分裂します。

この回復により、持続性細胞の蛍光が増加し、感受性細胞と視覚的に区別できるようになります。

マイクロ流体プレートのすべてのウェルから保存液を取り出し、新鮮な培地と交換します。マイクロ流体プレートをマニホールドシステムでシールするには、シールボタンをクリックするか、マイクロ流体ソフトウェアを使用します。

次に、マイクロ流体ソフトウェアインターフェイスで、[液体プライミングシーケンスの実行]をクリックして、最初のプライミングシーケンスを実行します。顕微鏡イメージングを開始する前に、サーモスタット制御された顕微鏡のキャビネット内で摂氏37度で最低2時間インキュベートします。次に、実験を開始する前に、2 番目の液体プライミング シーケンスの実行を開始します。

マイクロ流体ソフトウェアインターフェイスの[プレートの封を解除]をクリックして、マイクロ流体プレートをシールします。ウェル内の培地を、200マイクロリットルの新鮮培地、抗生物質を含む新鮮培地、および新鮮培地中の0.01OD希釈培養サンプルと交換します。前に示したようにマイクロ流体プレートを密封した後、プレートを顕微鏡キャビネット内の顕微鏡対物レンズに置きます。

マイクロ流体ソフトウェアで、セルローディングシーケンスの実行をクリックして、マイクロ流体プレートへのセルのロードを可能にします。透過光モードを使用して最適な焦点を設定し、フィールドあたり最大300セルの適切なセル数を観察できるいくつかの関心領域を選択します。マイクロ流体ソフトウェアで、カスタムシーケンスの実行を編集して、ウェル1と2に6.9キロパスカルの新鮮な培地を6時間注入し、続いて抗生物質を含む培地をウェル3に6時間注入し、最後にウェル4と5に6.9キロパスカルの新鮮培地を24時間注入するようにプログラムします。

透過光と蛍光レポーターの励起光源を使用して、15分に1フレームのタイムラプスモードで顕微鏡イメージングを実行し、マイクロ流体プログラムを開始します。コンピューターでImageJまたはFijiソフトウェアを開き、ハイパースタックタイムラプス顕微鏡画像をFijiローディングバーにドラッグします。[イメージ](Image)、カラー(Color)、合成(Make Composite)の順に使用して、ハイパースタックのさまざまなチャネルを融合します。

[画像]、[カラー]、[チャンネルの配置]の順に使用し、チャンネルが目的の色に対応していない場合は、チャンネルを配置します。MicrobeJプラグインを開き、手動編集インターフェースを使用して細菌細胞を検出します。自動的に検出されたセルを削除し、対象のパーシスタントセルをフレームごとに手動でアウトライン化します。

検出後、MicrobeJ手動編集インターフェイスの[結果]アイコンを使用して、ResultJテーブルを生成します。ResultJテーブルを使用して、単一細胞解析の対象となるさまざまなパラメーターに関する洞察を取得し、ResultJファイルを保存します。