蛍光寿命イメージング顕微鏡を用いた組織切片のアミロイド構造の解析

異常なタンパク質沈着を表すアミロイド凝集体を含む組織切片を取ります。

組織は、アミロイド原線維のベータシート構造に特異的に結合する蛍光色素ヘプタマーホルミルチオフェン酢酸またはhFTAAで染色されます。

色素分子の蛍光寿命を測定する蛍光寿命イメージング顕微鏡ユニットを備えた共焦点顕微鏡を使用してスライドを画像化します。

色素分子を効果的に励起するために顕微鏡設定を最適化します。

レーザー光が組織を照らすと、hFTAAが励起して蛍光を発します。

コンパクトな構造での色素結合が強いと寿命が長くなり、コンパクトでない構造で色素結合が弱いと

寿命が短くなります。

その後、ソフトウェアは集合体の色分けされた画像を生成します。

赤や黄色などの色が周辺に現れ、蛍光寿命が短く、コンパクトで不安定なアミロイド構造を反映していることを示しています。

コアの青や緑などの色は蛍光寿命が長く、よりコンパクトで安定したアミロイド構造を反映しています。

染色当日、切片を99%エタノール、70%エタノール、dH_2O、PBSの連続浴に毎回10分間浸漬し、組織切片を常温条件下で乾燥させます。組織が乾燥している間に、ストックをPBSで1〜10,000に希釈することにより、HFTAAの作業溶液を調製します。組織が乾いたら、HFTAA作業溶液の液滴を各組織切片に追加して覆います。室温で30分間インキュベートします。

染色液を500マイクロリットルのPBSで洗い流し、スライドをPBS浴に10分間浸します。常温下で乾燥させた後、蛍光封入剤を用いて取付します。封入媒体を一晩沈殿させます。

アミロイド検出は、装着後すぐに、または装着せずに行うことができます。ただし、実験の目的が高品質のスペクトル情報を収集することである場合は、一晩のインキュベーションが好ましいです。

顕微鏡をFLIMモードに切り替え、ピンホールを20、励起波長を490ナノメートル、レーザー強度を0.5%に設定します。40メガヘルツのパルスレーザーを使用します。FLIMソフトウェアで、550ナノメートル以上のフォトンカウントを設定します。[パラメータの表示]ウィンドウで、最大カウントが約 4,000 フォトン カウントになるまでフォトン カウントに従います。ファイルを保存し、SPCイメージとしてエクスポートします。