高スループットコルティカル骨サンプルの採取と分析のための断面化、スコアリング、画像処理ガイド
2020年6月12日
ヒトの女性の前部からSRμCT実験用に均一な大きさの皮質骨標本を調達するために、地質学的(スコア)サンプリングプロトコルを用いた。この方法は、最小限の破壊的で効率的な結果、不規則なサンプル形状からのイメージングアーティファクトを最小限に抑え、マイクロアーキテクチャの可視化と分析を改善する円筒形の標本を生み出します。
シンクロトロンマイクロコンピュータ断層撮影のための骨標本調達に関連する利用可能なデータは、まだまばらである。私たちの包括的なチュートリアルは、簡単で、破壊を最小限に抑え、費用対効果の高い方法論を提供します。一貫した寸法と円筒形の骨試料を調達することは、結果として得られるデータセットが最高品質であり、結果が適用可能であることを保証するために重要です。
この原稿に記載されている技術は、コアリング岩石、化石、またはあらゆる硬い材料に適用できます。私たちはこれらを使用して、地球の地殻と上部マントルのレオロジーを調査するための高圧実験のために、均一なサイズの岩石のコアと単結晶を収集しました。初心者のスコアリングは、骨標本が円錐形を形成することに気付くかもしれません。
これは、骨の粉塵がドリルビットから洗い流されるのに十分な時間を確保し、コアリング速度を遅くすることで対処できます。シンクロトロンマイクロコンピューター断層撮影のための骨標本の調達を示す教育テキストやビデオが不足しており、論理的な分析です。骨の準備をステップバイステップで行うチュートリアルは、このギャップを埋めるのに役立ちます。
75 x 25 mmのガラス顕微鏡スライドを摂氏140度までのホットプレートに置き、スライドの中央に大量のサーマルエポキシ樹脂を溶かします。骨ブロックの下面を顕微鏡スライド上のサーマルエポキシ樹脂に押し込み、骨の長さをスライドに垂直にします。骨の下側をコーティングし、しっかりと接着するために、サンプルを前後に動かします。
取り付けた試料をホットプレートに約5分間置いて、サーマルエポキシが細孔や亀裂に吸い込まれるようにし、スライド上のエポキシに気泡がないことを確認します。気泡がある場合は、サンプルを前後に動かして取り除きます。鈍い鉗子を使用して、マウントされた試料の入ったスライドをホットプレートから取り外し、室温で約10分間冷却した後、カミソリの刃でスライドの端からエポキシを取り除き、チャックがスライドを適切にグリップするようにします。
サンプルを接着したスライドをスライドガラスチャックに取り付け、低速セクショニングソーのスイベルアームにチャックを取り付けて、骨の断面をその長さに対して垂直に切断できるように配置します。スイベルアームを調整して、ブレードがサンプルに接触して横断するようにします。カッティングアームの向こう側にウェイトを追加してアームの重量を打ち消し、蒸留水とカッティング液を液剤レセプタクルに追加します。
ダイヤモンドウェーハブレードをしっかりと固定し、液面がブレードの切断部分を水没させます。速度を200 RPMに設定し、サンプルをゆっくりとブレードに下げます。のこぎりが切断を開始したら、ブレードとチャックがぐらついたり跳ねたりしていないことを確認します。
その場合は、すぐにのこぎりを止めて、ブレードまたはチャックアームアセンブリを締めます。チャックが積極的に上下に動いている場合は、カウンターウェイトを追加します。最初の厚い部分は、追加の各カットに平行に明確に定義された表面を提供する廃棄物カットです。
最初の廃棄物カットの後、スイベルアームを上げ、ポジショニングダイヤルを使用してチャックをブレードに向かって5mm動かします。切片作成が完了したら、試験片を取り付けたスライドガラスをホットプレートに置き、熱エポキシを溶かします。5mmの骨切片を浅いアルミ缶の底に、前述のサーマルエポキシボンディング技術を使用して取り付けます。
ミルドリルプレスのXYマシンテーブルに錫を置き、固定クランプを手で締めます。ミルドリルチャックに内径2ミリメートルの中空シャフトジュエラーダイヤモンドチップコアドリルビットを挿入し、深さリミッターを調整して錫を介したコアリングを防ぎます。骨サンプルの中央前面をドリルビットの下に位置合わせし、骨膜と口、または高度に海綿状になった領域との密接な接触を避けます。
缶に蒸留水を入れてサンプルを完全に覆い、コアリング中の熱の蓄積、サンプルの燃焼、ドリルビットの損傷を防ぎます。ミルドリルプレスは、適切な安全対策が講じられていないと危険な場合があります。オペレーターは、安全メガネを着用し、ゆったりとした衣服を固定し、長い髪を後ろに引っ張ってスピンドルに引っかからないようにする必要があります。
コアビットと骨が接触する最初の数回の例では、骨の上面にリングを装着するために穏やかな圧力をかけます。これにより、コアリングプロセスの開始時にドリルビットがたわむのを防ぎ、ビットの正しい配置が保証されます。コアリング中は、ドリルビットの先端を水面の下に保ちながら、ドリルビットをサンプルに持ち上げたり取り出し
たりします。これを数秒ごとに行って、閉じ込められた骨のほこりを洗い流し、破片がドリルビットを塞いでいないことを確認します。コアリングが完了した後、結果として生じる骨コアが中空のステムドリルビットに引っかかる可能性があります。先端の細い鉗子または小さな六角レンチを使用して、ビットからコアを外します。
コアリングしたサンプルは、イメージングするまで、ラベル付きの微量遠心チューブに入れて涼しく乾燥した場所に保管してください。記載されているコアサンプリングの方法は、非常に効果的かつ効率的であることが証明されました。コアレドサンプルとロータリーツールで調達したサンプルの画像処理ワークフローを比較した代表的な図をこちらに示します。
一般的な回転ツールを使用して切断したサンプルは、コアリングされたサンプルと比較して、管と裂孔の数が増加し、平均管直径、管容積、および皮質の多孔性が減少しました。この表は、各サンプルの空隙率データを示しています。コアリングプロトコルは、シンクロトロンマイクロコンピューター断層撮影スキャンで観察されるアーティファクトを減少させますが、直線的な骨ブロック実験からのアーティファクトを含んだ低品質の数値は多面的な問題を表しています。
その後の画像処理により、皮質骨のマイクロアーキテクチャの視覚化を改善する技術の可能性が確認されました。例えば、石灰化の違い、骨境界の描写の改善、血管管内の軟組織の一貫した可視化が観察されました。ゆっくりと進めることが、一貫したサイズの円筒形サンプルを得るための鍵です。
速度が速すぎると、試験片が円筒形ではなく円錐形になる可能性があります。コアリング用の厚い切片を調達しながら、明視野顕微鏡や共焦点顕微鏡用にさらに厚い切片を収集することができます。これにより、小管網の可視化が可能になります。
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概要
この研究は、シンクロトロンマイクロコンピュータ断層撮影（SRµCT）実験に使用する均一なサイズの人間大腿骨皮質骨標本を調達するための最小限破壊的手法を提示します。説明されたコーリング技術は、不規則なサンプル形状に関連する撮像アーチファクトを減少させ、マイクロアーキテクチャの可視化を向上させます。
主要な研究構成
研究分野
- 骨標本の調達
- マイクロコンピュータ断層撮影
- 最小限破壊的サンプリング方法
背景
- SRµCT用骨標本調達方法に関するデータが乏しい。
- 品質データのための一貫したサンプル寸法の重要性。
- 現在の文献には、これらの技術に関する包括的なチュートリアルが欠けている。
使用された方法
- 骨標本の採取のための地質学的コーリングサンプリングプロトコル
- 生物学的システムとしての人間大腿骨
- 撮像のためのシンクロトロンマイクロコンピュータ断層撮影の使用
主要な結果
- コーリングプロトコルが撮像アーチファクトを減少させることを実証しました。
- コーリングサンプルの品質を回転工具で得られたものと比較しました。
- 皮質骨のマイクロアーキテクチャと石灰化差の可視化を改善しました。
結論
- この研究は、撮像用高品質骨標本を得るための信頼できる技術を効果的に実証しています。
- これらの結果は、生物学研究における撮像方法論の向上に関連しています。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Standardized cortical bone specimen procurement enhances data quality in high-resolution imaging workflows, reducing artifacts that compromise microarchitectural analysis. This method supports reliable preclinical evaluation of bone-targeted therapeutics by ensuring consistent sample geometry and minimizing technical variability. The approach enables reproducible assessment of bone structure, which is critical for target validation and mechanistic de-risking in musculoskeletal drug discovery programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of cortical bone microstructure to validate targets involved in bone remodeling pathways.
- Operational Value: Provides uniform cylindrical specimens that reduce imaging artifacts and improve reproducibility across experimental batches.
- Predictive Value: Supports assessment of compound effects on bone porosity and canalicular networks with enhanced visualization fidelity.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates preparation of validated bone samples for downstream imaging-based assays assessing osteonal architecture.
- Operational Value: Standardizes specimen preparation to improve throughput and reduce variability in synchrotron-based screening platforms.
- Predictive Value: Enables quantitative comparison of mineralization and vascular canal morphology across treatment conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains structural integrity of cortical bone for longitudinal assessment of therapeutic effects on microarchitecture.
- Operational Value: Adapts to related hard tissue models in disease-relevant systems such as osteoporosis or fracture healing models.
- Predictive Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by improving confidence in preclinical bone phenotype readouts.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology workflows by providing standardized specimens for hypothesis testing in bone pathophysiology models.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and target validation through consistent 3D imaging of cortical microstructure.
- Screening: Enhances assay readiness by delivering reproducible specimens with uniform X-ray path length for synchrotron micro-CT.
- Analytics: Enables quantitative dependent variable measurements such as canal diameter, porosity, and osteonal spacing for comparative analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by preserving tissue integrity for multimodal imaging correlation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable specimen preparation capability applicable across bone imaging modalities and material science collaborations.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduction of mechanistic ambiguity in bone microstructure analysis through artifact-minimized imaging.
- Operational Value: Standardization and scalability of specimen procurement for multi-site preclinical studies.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions via reliable bone phenotype data, reducing late-stage attrition in skeletal indications.
- Portfolio Impact: Risk-based prioritization of bone-modulating candidates using validated microarchitectural endpoints.
Implementation Considerations
- Requires expertise in histological preparation and micro-drilling techniques for hard tissue handling.
- Depends on access to precision sectioning equipment, coring drills, and thermal epoxy bonding materials.
- Necessitates cross-team standardization between histology, imaging, and data analysis groups for consistent results.
- Involves adaptation considerations when applying to non-human bone sources or synthetic biomaterials with varying density.
- Includes practical limitations such as specimen size constraints based on donor bone availability and coring depth restrictions.
