異種細胞系におけるタンパク質凝集による細胞間相互作用の測定

この細胞ベースのアッセイにより、長時間のタンパク質精製や特殊な装置を必要とせずに、トランス接着相互作用の観察と定量が可能になります。ここで検証されたタンパク質相互作用は神経生物学に関連していますが、この方法は、タンパク質の接着が細胞間で起こっている研究のどの分野にも適用できます。HEK-293T細胞をトランスフェクションしてから48時間後、6ウェルプレートから細胞を回収して凝集させます。

まず、PBSで各ウェルを2回洗います。次に、細胞を穏やかに解離するために、各ウェルに1ミリリットルの10ミリモルEDTAを加え、プレートを摂氏37度でインキュベートします。5分間のインキュベーション後、プレートを軽くたたいて細胞を切り離し、各ウェルを別々の15ミリリットルの円錐管に回収します。

チューブを500 x gで室温で5分間遠心分離します。細胞がペレット化されている間に、微量遠心チューブの上部に実験条件をラベル付けして、6本のインキュベーションチューブを準備します。GFPとmCherryのすべての順列を使用する必要があります。

15ミリリットルの円錐管から上清を取り除き、細胞を500マイクロリットルの培地に再懸濁します。血球計算盤を使用して、各円錐管内の細胞をカウントします。次に、各条件から200,000個の細胞を適切なインキュベーションチューブに分注し、総容量500マイクロリットルの1対1の混合物にします。

次のセクションで説明するベースライン凝集を評価した後、インキュベーションチューブを室温で低速のチューブローテーターに入れます。凝集を評価するには、ベースライン時と60分後に、インキュベーションチューブから40マイクロリットルを帯電した顕微鏡スライドにピペットで移します。ベースライン取得は、微量遠心チューブに細胞を添加した後、できるだけ早く行う必要があります。

スライドを蛍光下で緑と赤の両方のチャンネルで画像化します。各スライドで、3つの異なる視野の画像を1つの焦点面にキャプチャします。HEK-293T細胞に目的タンパク質、目的変異タンパク質、または目的リガンドをトランスフェクションし、蛍光タンパク質と同時トランスフェクトしました。

目的のタンパク質を発現する細胞集団を、目的のリガンドを発現する細胞集団と混合し、60分後の凝集を評価しました。緑と赤のチャンネルでキャプチャされた画像のオーバーレイでは、集約は黄色のプンクタとして表示されます。細胞がシナプスリガンドを発現していない条件では、凝集は最小限でした。

また、2つの集団のうち1つだけがシナプスリガンドを発現している場合、最小限の凝集が示されました。細胞の2つの集団が不適合な接着分子を発現した場合、凝集は示されませんでした。適合する接着分子を有する条件は、60分間のインキュベーション後に有意な凝集を示しました。

驚くべきことに、目的の変異タンパク質は、野生型のタンパク質よりも有意に多くの凝集を示し、点変異がタンパク質の結合能力を強化することを示唆しています。多くの接着分子の変異は、一般的に神経発達障害、神経精神障害、および依存症に関連しています。この手法により、疾患に関連する点突然変異がトランス相互作用に及ぼす影響をスクリーニングすることができます。