細菌細胞での共発現と組み合わせたプルダウンアッセイは、困難なタンパク質間相互作用をテストするための時間効率の良いツールとして

この方法は、ヘテロ二量体の形成など、効率的な試験サンプルのために共発現を必要とするタンパク質複合体の形成を研究することを可能にする。この方法の主な可能性は、互換性のあるベクターの組み合わせを使用して、異なるタグが付けられた研究対象タンパク質の共発現を利用して、効率的な複雑なアセンブリを促進するとともに、時間効率の高いワークフローとスケーラビリティにより、複数の相互作用の迅速なパッチテストを可能にすることです。この方法は、最適なタンパク質発現および精製条件の迅速なスクリーニングにも使用できます。

視覚的なデモンストレーションは、共発現のセットアップ、細胞破壊、その後のプルダウンステップなど、プロトコルの重要なステップを正しく実行するのに役立ちます。まず、ルリア・ベルターニ(LB)培地中の大腸菌BL21(DE3)株を摂氏37度で光学密度(OD)0.1〜0.2に増殖させます。1ミリリットルの細菌懸濁液を摂氏4度で9, 000 Gで1分間遠心分離し、上清を捨てます。

次に、0.5ミリリットルの氷冷形質転換バッファー(TB)を加え、氷上で10分間インキュベートします。インキュベーションの終わりに、摂氏4度で8, 000 Gで30秒間遠心分離し、上清を捨てます。次に、100マイクロリットルのTBバッファー、100ナノグラムの各ベクターを加え、氷上で30分間インキュベートします。

摂氏42度で150秒間加熱してから、氷上で1分間冷やします。次に、抗生物質を含まない1ミリリットルのLB培地を加え、摂氏37度で90分間インキュベートします。インキュベーション後、ペレットを遠心分離し、100マイクロリットルのLB培地に再懸濁してから、0.5%グルコースと対応する抗生物質を含むLB寒天プレートに懸濁液をプレーティングします。

プレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、2ミリリットルのLB培地でプレートから細胞を、対応する抗生物質を含む50ミリリットルのLB培地に洗い流します。その後の実験のために摂氏マイナス70度で20%グリセロールを含むアリコートを保存する前に、金属イオンまたは他の既知の補因子を追加します。

摂氏37度で220 RPMの一定の回転で細胞を0.5〜0.7の外径まで成長させます。培養液を室温まで冷却し、IPTGを最終濃度1ミリモルまで添加します。誘導されていないサンプルのコントロールとして細胞懸濁液の20マイクロリットルアリコートを保存します。

細胞を摂氏18度で220 RPMで一晩インキュベートします。翌日、細菌懸濁液を2つの部分に分け、20マイクロリットルのアリコートを保存してタンパク質発現を確認します。残りの細胞懸濁液を4, 000 Gで15分間遠心分離します。

プルダウンアッセイでは、実験の直前にプロテアーゼ阻害剤と還元剤を添加した1ミリリットルの氷冷溶解バッファーにペレットを再懸濁します。試験したタンパク質のバッファー組成を調整します。氷上で超音波処理によって細胞を破壊し、電気泳動のために20マイクロリットルのアリコートを保存する。

16, 000 Gで30分間遠心分離し、電気泳動のために20マイクロリットルの清澄化ライセートを収集します。樹脂を1ミリリットルの氷冷溶解バッファーで10分間平衡化し、次に2, 000 Gで30秒間遠心分離し、上清を廃棄します。細胞ライセートを樹脂に加え、15 RPMの一定回転で10分間インキュベートします。

次いで、遠心分離し、分析のために20マイクロリットルの未結合画分を収集する前に上清を廃棄する。次に、1ミリリットルの氷冷洗浄バッファーを加え、1分間インキュベートします。再度、遠心分離し、上清を廃棄する。

次に、氷冷洗浄バッファーで2回の長時間洗浄を行います。2回目の洗浄後、結合したタンパク質を50マイクロリットルの溶出バッファーで1,200 RPMの振とう機で摂氏4度で10分間溶出します。溶出したタンパク質をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析します。

ジンクフィンガー関連ドメイン(ZAD)、マルトース結合タンパク質(MBP)におけるホモ二量体化、および6xヒスチジンプルダウンアッセイの研究を以下に示します。MBPとチオレドキシン6xヒスチジン融合ZADの共発現は、良好で再現性のあるホモ二量体化活性を示し、MBPプルダウンアッセイのSDS-PAGE結果に追加のバンドとして現れます。代替複合体形成を研究するためにこの方法を使用する別の例がここに示されている。

共発現アッセイでは、6xヒスチジンタグ付きENY2はGSTタグ付きSgf11およびMBP-CTCFの両方と相互作用しましたが、MBPプルダウンにはGST-Sgf11は存在せず、その逆も同様でした。ここでは、従来のプルダウンアッセイのワークフローにおける必要な時間間隔を、共発現に結合したプルダウンと比較した段階的な比較を示します。CP190タンパク質のBTBドメインとショウジョウバエCTCFタンパク質のGSTタグ付きC末端ドメインとの間の同じ相互作用を研究するために両方の技術を利用した結果をここに示す。

アフィニティーおよび溶解性試験(チオレドキシン、GST、またはMBP)の正しい選択は、アッセイの効率的な実行にとって重要です。もう一つの重要なステップは、迅速かつ均一な細胞破壊です。マルチチップ超音波処理器プローブを使用することを強くお勧めします。

この方法は、従来のプルダウンアッセイにおける精製タンパク質のインキュベーション中に解離しないホモ二量体を形成するタンパク質ドメイン間のヘテロ二量体形成の直接研究を可能にする。