細胞接着分子間のトランス相互作用を検出するための細胞凝集アッセイ

神経系では、細胞間相互作用(シナプス前ニューロンとシナプス後ニューロン上の特定のシナプス細胞接着分子、膜貫通タンパク質間の相互作用)がシナプスで複合体を形成し、シナプス経シナプスシグナル伝達を媒介します。

細胞凝集アッセイを介してヒト胚性腎臓細胞に発現するシナプス細胞接着分子間の細胞間相互作用を検出するには、トランスフェクトされた細胞懸濁液から始めます。

1つのトランスフェクトされた細胞集団は、目的のシナプス前細胞接着分子と緑色蛍光タンパク質を発現し、もう1つは特異的なシナプス後細胞接着分子と赤色蛍光タンパク質を発現します。緑色と赤色の蛍光タンパク質を発現する2つの細胞集団も得られます。

細胞を遠心分離します。カルシウムイオンを添加した適切な培地に細胞を再懸濁します。両方の集団のトランスフェクトされた細胞をチューブ内で均等に混合します。他の細胞集団についても繰り返します。

インキュベーション中、カルシウムイオンは細胞集団で発現するシナプス前タンパク質の特定の部位に結合します。これにより、シナプス前タンパク質と他の細胞集団のシナプス後リガンドとの相互作用が増加し、結合が促進され、これらの細胞間の異親和性細胞接着が媒介され、細胞凝集が促進されます。

蛍光顕微鏡下で、適切なチャネルを使用して細胞を画像化し、細胞の緑と赤の蛍光を視覚化します。画像を処理します。

蛍光タンパク質のみを発現する細胞集団では凝集は見られません。シナプス細胞接着分子を発現する緑色と赤色の蛍光細胞が重なり合うため、細胞凝集は黄色で視覚化され、分子間の細胞間相互作用が示唆されます。

HEK293T細胞をトランスフェクトしてから48時間後、凝集のために6ウェルプレートから細胞を回収します。まず、各ウェルをPBSで2回洗浄します。次に、細胞を穏やかに解離するには、1ミリリットルの10ミリモルEDTAを各ウェルに加えます。次に、プレートを摂氏37度でインキュベートします。

5分間のインキュベーション後、プレートを軽くたたいて細胞を剥がし、各ウェルを別々の15ミリリットルの円錐形チューブに収穫します。チューブを室温で500 x g で5分間遠心分離します。

細胞がペレット化されている間に、微量遠心チューブの上部に実験条件を標識して、6本のインキュベーションチューブを準備します。GFPとmCherryのすべての順列を使用する必要があります。

15ミリリットルの円錐形チューブから上清を取り出し、細胞を500マイクロリットルの培地に再懸濁します。血球計算盤を使用して、各円錐形のチューブ内の細胞をカウントします。次に、各条件から200,000個の細胞を適切なインキュベーションチューブにアリコートし、総量500マイクロリットルの1対1の混合を行います。インキュベーションチューブを室温で低速チューブ回転器に入れます。

凝集を評価するには、ベースライン時と60分後に、インキュベーションチューブから40マイクロリットルを帯電した顕微鏡スライドにピペットで移します。ベースラインの取得は、微量遠心チューブに細胞を追加した後、できるだけ早く行う必要があります。

緑と赤の両方のチャネルで蛍光下でスライドを画像化します。各スライドについて、1つの焦点面で3つの異なる視野の画像をキャプチャします。