Name: 細胞外マトリックスベースおよび細胞外マトリックスフリーのマウス精巣オルガノイドの生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: 学ぶマウス精巣オルガノイドの生成法。ECMあり・なしの2D・3D培養で構造的模倣性と内分泌機能を持つオルガノイドを作製し、精子形成と生殖内分泌学の研究に応用します。

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この研究は、国立衛生研究所、国立衛生人間開発研究所(NICHD)F31 HD089693、国立環境衛生研究所/国立トランスレーショナルサイエンス推進センター(NIEHS/NCATS)UH3TR001207および4UH3ES029073-03、トーマス・J・ワトキンの記念教授によって資金提供されました。
著者らは、エリック・W・ロスが透過電子顕微鏡の支援をしてくれたことに感謝したいと考えています。この研究は、ソフトおよびハイブリッドナノテクノロジー実験(SHyNE)リソース(NSF ECCS-1542205)からの支援を受けているノースウェスタン大学のNU ANCE センターのBioCryo施設を利用しました。材料研究センターのMRSECプログラム(NSF DMR-1720139)国際ナノテクノロジー研究所(IIN)そしてイリノイ州、IINを通じて。また、MRIプログラム(NSF DMR-1229693)からサポートを受けているCryoCluster機器を利用しました。図 1 のグラフィックスは、BioRender.comを使用して設計されています。

すべてのマウス実験はノースウェスタン大学の施設動物管理使用委員会(IACUC)によって承認され、すべての手順はIACUC承認プロトコルの下で行われました。
1. 酵素組織解離液の調製
<ol><li>2種類の酵素溶液(溶液1および溶液2)を用いて、いずれも基底培養培地溶液(BM)を用いて作製した。</li>
	<li>BMを調製するには、血清およびペニシリンストレプトマイシンを最小必須培地から最終濃度10%および1%にそれぞれ加えます(特定の試薬の材料表を参照)。次いで、0.22 μmフィルターを介してBMを無菌でフィルタします。細胞と共に使用する前に、培養皿に分注し、加湿した5%CO2インキュベーターを最低1時間37°Cで入2れることによって、無菌BMを中性pHに事前平衡化する。 注:BMは、新鮮なBMを作る必要があり、その後、1週間まで4°Cで保存することができます。</li>
	<li>コラゲレーターIストック液を調製するために、まず100mgのコラゲレーターIを1mLの無菌胚グレードH2O(最終濃度10%m/v)に溶解し、反転または旋回して溶解し、後で使用するために-20°Cで20μLのアリコートを保存する。アリコートは一度だけ解凍する必要があります。</li>
	<li>デオキシリボヌクレアーゼI(DNase I)ストック溶液を調製するには、DNase Iの20mgを無菌胚グレードH2O(最終濃度2%m/v)の1mLに加え、反転または旋回して溶解し(渦を起こさない)、後で使用するために-20°Cで20μLのアリコートを保存する。アリコートは一度だけ解凍する必要があります。</li>
	<li>ヒアルロニダーゼストック溶液の場合、1mLの無菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS、Ca++/Mg++を含むPBS中の最終濃度3%m/vヒアルロニダーゼ++)に30mgを加え、反転または渦巻いて溶解し、100μLアリコートを-20°Cで保存して後で使用します。アリコートは、酵素活性を失うことなく、数回解凍して再凍結することができます。</li>
	<li>解離 液1を調製するには、10μLコラゲナーゼIと10μL DNase Iを1mLの無菌、事前平衡化されたBM(最終濃度:1mg/mLコラゲナーゼIおよび5 μg/mL DNase I)に加えます。ピペットで軽くトリチュレートして溶液を混合し、組織と共に使用する前に37°Cに予熱します。 注:溶液2は、溶液1の1mLあたり33μLのヒアルロニダーゼ(37°Cに予熱)を加えて調製される(最終濃度1mg/mL)。これは、以下のステップ2.5で精巣組織の酵素解離を経て途中で起こる。</li>
</ol>2. 精巣組織解離
注:すべてのマウスはポリプロピレンケージ内に収容され、食品と水のアドリビタムを提供しました。動物は植物エストロゲンを含まない照射チャウを与えられた。若年性CD-1マウスは、産後5日間(dpp)、全ての実験に使用され、安楽死および組織採取前に、イソフルラン気化器に付着した麻酔室内(O2中2.5 L/分)内で麻酔を行った。マウスは、つま先刺しに対する応答がない場合に完全麻酔を確認し、その後マウスを切断によって安楽死させた。
<ol><li>イオブルランチャンバーでマウスを麻酔し、つま先刺しで麻酔を行い、鋭利なはさみを使ってマウスの首を切ります。解剖マットの上に安楽死させたマウスの上に置き、70%エタノールで腹部を殺菌する。下腹部の皮膚を鉗子でテントにし、腹部をはさみで開きます。</li>
	<li>腹部の左下および右のりすがり領域に精巣を見つける。精管とアンカー結合組織への接続を切断し、動物から精巣全体(精巣上体がまだ取り付けられている状態)を持ち上げます。事前に平衡したBMのペトリ皿に精巣を置く。</li>
	<li>解剖顕微鏡の下で、無菌の分野内で、小さなマイクロディションはさみのいずれかで、または2つの細かい鉗子を使用して穏やかに引き裂くことによって、各精巣の一端にチュニカアルブギネアで小さな切開を行います。<ol>
<li>次に、切開の反対側の端から精巣を保持しながら、細かい鉗子で精巣を軽く絞り、チュニカの穴に向かって穏やかな掃引運動を押し込みます。これは精巣組織を1つのまとまりのある部分として放出する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>精巣を小さく切り(≤2mm3)、あらかじめ温めた(37°C)解離液1mLに入れる。<ol>
<li>37°Cで10分間インキュベートします。</li>
		<li>10以上の試験の場合、解離液の総体積を1mL増やし、10回の精巣につき最低1mLの解離溶液を確保します(例えば、20回の精巣に対して2mL、30回の精巣等で3mL)。</li>
		<li>P1000ピペットを用いて溶液1中に精巣片を50回(50倍)軽く三分化する。この時点で、尿細管が互いに分離し、間質組織から分離していることを確認します。塊が残っている場合は、さらに5分間インキュベートし、もう一度(50倍)トリチュレートします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>溶液1解1解離液混合物(部分的に解離した精巣組織および細管を含む)あたり33μLのヒアルロニダーゼストック溶液(ステップ1.5から事前に加温)を加える。ヒアルロン化症を添加した後、これを溶液2と呼ばれる。<ol>
<li>P1000を用いてトリチュレート(50倍)を37°Cで5分間インキュベートする。</li>
		<li>P200ピペットを使用してトリチュレート(50倍)</li>
		<li>この時点で、可視の細管または細胞の塊が存在しないようにしてください。塊が持続する場合は、P200ピペット(50x)を使用してさらにトリウテーションを使用して、さらに5分までインキュベートします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ウシ胎児血清(FBS)を溶液2の全容量の10%に加えて解離酵素をクエンチする。P200ピペットを使用して数回トリチュレートして塊が残らないようにし、40 μmのセルストレーナーを通してフィルターを通して単一細胞懸濁液を生成します。</li>
	<li>遠心分離細胞を 100xg で7分間、上清を捨て、新鮮なBMで細胞を再懸濁する。</li>
	<li>ヘモサイトメーター上のトリパンブルー排除を使用して、総および生存細胞濃度をカウントします。1:1希釈、細胞懸濁液の10 μLを加える:トリパンブルー溶液、ヘモサイトメーターセル計数チャンバー( 材料表を参照)<ol>
<li>100 x g で 7 分間再遠心分離し、新鮮な BM で再懸濁します。 注:セルの濃度と数を計算するために生存可能なセルのみを使用してください。オルガノイドを発生させる≥80%の生存率の細胞懸濁液のみを使用する。</li>
		<li>セクション3で下記のプロトコル固有のステップで使用されるボリュームを与えられた280,000細胞をアリツーコートするために説明したように、単一細胞懸濁液を細胞濃度に準備する:2D ECM-Free – 0.56 x 106セル/mL、 2D ECM – 0.56 x 106セル/mL、 3D ECM フリー –6 4.66 x 10 6 セル/mL, 3D ECM – 2.8 x 10 6 細胞/mL. 注:ここで紹介するすべての培養実験は、培養1回あたり280,000個の細胞を播種していきます。これらの数値は、図 1 、 図 2、 図 3、 図 4の代表的なデータと一致しています。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. オルガノイド培養皿の作製と細胞の播種
注:均質なECMを確実にするために、実験の前にECMの凍結されたアリコートを一晩解凍する。ECMアリコートは、温度のゆっくりとした緩やかな上昇を保証するために、4°C冷蔵庫または冷蔵室内の氷のバケツ内に沈む必要があります。すべてのECMは、培養のためにBMの1:1最終希釈で使用されます。解凍したECMと1:1希釈ECMを使用する直前まで氷上に保管し、それ以外の場合はECMが早期に重合する可能性があります。
<ol><li>2D ECMフリー培養では、特別な調製は必要なく、プレート単一細胞懸濁液(BMで0.56 x 106 細胞/mLの500 μL)を直接4-ウェルチャンバースライド上に配置し、培養用35°Cインキュベーターに入れます。 注: 細胞は培養の最初の 24 時間以内に培養皿の底に付着し、この同時に小さな 3D 細胞クラスターを示す可能性があります。</li>
	<li>2D ECM培養の場合、冷たい1:1希釈された細胞外基底マトリックス媒体の100 μLを4ウェルチャンバースライドに分配し、ゲルが皿底全体を覆っていることを確認します。<ol>
<li>チャンバースライドを35°Cインキュベーターに30分以上入れ、ECMをゲルに重合させます。</li>
		<li>重合した後、2Dゲルの上に直接細胞懸濁液(0.56 x 106 細胞/mLの500 μL)を加えます。 注: セルは、培養の最初の 24 時間内に小さな 3D クラスターを形成するために、一緒にクラスター化する必要があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>3D ECMフリー培養の場合、細胞培養を開始する前にアガロース3Dペトリ皿の挿入物を準備します。<ol>
<li>まず、オートクレーブ1.5gアガロースパウダーを100 mLビーカーに入れ、75 mLの滅菌、蒸留水、マイクロ波を加えて、3Dペトリ皿鋳造用の2%アガロースを溶融して生成します。</li>
		<li>無菌ワークスペース内で、メニスカスが金型の側面と同じレベルになるまで、溶融アガロースを3Dペトリ皿型に分配します。</li>
		<li>アガロースを冷却し、固める。固体の場合は、金型を逆さまにし、アガロース3Dペトリ皿が金型から自由になるまで穏やかに繰り返し屈曲します。 注:この時点で、多くのアガロース3Dペトリ料理を準備し、1ヶ月以上4°Cで滅菌H2OまたはDPBSでそれらを保存することができます。</li>
		<li>培養する前に、アガロース3Dペトリ料理を24のウェルカルチャーディッシュに入れ、1mLのBMで覆います。3Dペトリ料理は、37°C培養器内で少なくとも30分間BMで平衡させます。BMを廃棄し、1 mLの新鮮なBMでもう一度平衡を繰り返します。BMで3Dペトリ料理を平衡化した後、それらはBM(すなわち、ピンク)と同じ色で現れます。</li>
		<li>細胞の播種の準備のために、ウェルからすべてのBMを取り出し、3Dペトリ皿の中心凹部の内側ではなく、周りに新鮮なBMの200 μLを分配します。また、マイクロウェルインサートの中央細胞播種凹部の内側から残りのBMを収集する。</li>
		<li>アガロース3Dペトリ皿の中央凹部に単一細胞懸濁液(BMの60 μLで4.66細胞/mL)を分配します。上下に軽く三分酸して細胞を混合し、培養開始時に単一の細胞懸濁液を保証します。</li>
		<li>培養用に加湿した35°Cインキュベーターに入れる。翌日、マイクロウェルインサートの周りからBMの200 μLを取り出し、1 mLのフレッシュBMに交換します。これにより、液体レベルが挿入物の平面の上に、培養物全体を水没させます。</li>
		<li>アガロース3Dペトリ皿の外側からゆっくりと慎重にメディアを取り出します。オルガノイドは一晩で圧縮され、底部で休むことを可能にし、オルガノイドを邪魔されないままにするメディアの変更を可能にするべきである。</li>
	</ol>
</li>
	<li>3D ECM培養の場合、BM中の細胞懸濁液を冷たく解凍前ECM(最終濃度=2.8 x 106 細胞/mL)と組み合わせて単一細胞懸濁液を調製する。<ol>
<li>すぐにセル-ECM混合物を4ウェルチャンバースライドに分配し、混合物がプレートの底全体を覆っていることを確認します。</li>
		<li>チャンバースライドをインキュベーターに35°Cに入れ、内容物を重合します。これには少なくとも30分かかります。重合後、培養の上部に500μLのBMを加えます。 注: セルは、培養の最初の 24 時間内に小さな 3D 集計を形成するために、一緒にクラスター化する必要があります。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. オルガノイドメンテナンス
<ol><li>35°Cで全オルガノイドモデルタイプを培養する。 すべての文化タイプのために2日ごとに新鮮なBMとメディアの半分を交換します。オルガノイドがメディアを交換している間に誤って収集されないようにするために、常にチャンバースライド皿の隅から、そしてアガロース3Dペトリ皿の外の外の点からゆっくりとメディアを収集します。すべての培地は、後で免疫アッセイまたは他の分析(すなわち分泌された生殖ホルモンまたはサイトカインの定量化)で使用するために-20°Cで保存することができる。</li>
	<li>培養で7日後、卵胞刺激ホルモン(最終濃度20 mIU/mL)およびヒト絨毛性ゴナドトロピン(最終濃度4.5 IU/mL)を含むBMを使用する。これは、すべてのオルガノイド培養タイプに適用されます。</li>
	<li>オルガノイドの形成を特徴付け、時間の経過とともに自己集合、発達、成長の指標を定量化するために、すべてのオルガノイド培養物(すなわち、タイムラプスイメージング)を日常的に画像化する。</li>
</ol>5. オルガノイドコレクション
注:すべてのオルガノイドは、下流の免疫標識および組織学的分析のためにPBSで4%パラホルムアルデヒドで固定することができます。回転で室温で2時間、または4°Cで一晩固定します。
<ol><li>2D ECM フリーの培養物の場合は、まず新鮮な PBS でサンプルをリンスし、次に付着したコンストラクトの上に直接固定液を追加します。</li>
	<li>ECM(2Dおよび3D)培養方法の場合、PBSで一度リンスし、ECMオルガノイドサンプルの上部に直接固定剤を追加するか(ECMゲルとオルガノイドを一緒に固定する)、またはオルガノイドを上下に穏やかにピペットして周囲のECMから解放し、別のチューブに移して固定する。</li>
	<li>3D ECMフリー培養の場合、アガロース3Dペトリ皿の中央凹部内でオルガノイドを上下にピペットします。これはピペットで彼らの容易なコレクションを促進するオルガノイドを洗い流す。その後、オルガノイドを別のチューブに移して固定します。</li>
	<li>パラフィンに加工する前に、組織処理ゲルの小さな体積(〜30μL)内に多くのオルガノイド(≥20)を埋め込みます。これにより、オルガノイドをパラフィンブロック内の小さな領域に配向して濃縮し、パラフィンセクション内での断面化時の観察が容易になり、視覚的な識別が容易になります。 注:オルガノイドは、パラフィンの埋め込みとミクロトームの切除後の識別に困難な場合があります。</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

このオルガノイド生成プロトコルの完成により、ユーザーはECMまたはECMフリー環境で精巣構造およびオルガノイドを組み立てるために利用可能な4つの異なる培養技術を有する。重要なことに、4つの方法はすべて、研究者がタイムラプスイメージングまたはビデオ記録を通じて時間の経過とともにオルガノイド自己集合を非侵襲的に観察し、培養中に組織を乱すことなく、分泌されたホルモンおよびサイトカインの分析のために非侵襲的に条件付き培地を収集することを可能にする。すべての方法において、24時間の間に、実験者は細胞数が許す限り数百個のオルガノイド/精巣構造を生成することができる。これらの方法は、組織の自己集合を異なるサイズと形態を持つ構造に促進します。オルガノイドサイズは、培養で使用される細胞数および濃度に依存し、他のオルガノイド報告書34に見られるようになる。オルガノイドの大きさや直径を小さくすることは、時にはより大きなオルガノイドに現れる壊死の内側領域の発達を減らすのに役立つかもしれない。2D ECMおよび3D ECMフリープロトコル法の特定の強みは、形態学的模倣精巣オルガノイドを生成する能力であり、管状細胞型...

精巣オルガノイドは、精巣の発達、精子形成、および生理学をvitro11、2、3、42,3,4で研究するための先駆的な技術である。オルガノイド生成のためにいくつかの方法が検討されている。これらには、2次元(2D)および3次元(3D)の向きの両方で、さまざまな細胞外マトリックス(ECM)およびECMフリー培養系が含まれる。異なる生成方法は、明確なセルラーアセンブリ戦略を促進することができます;これにより、公開されたオルガノイドモデル間の形態学的および機能的変動の高いレベルが生じる。この記事の目的は、精巣の器官化実験を設計する際に、体外精巣モデルの現状を議論し、将来の研究者のためのテンプレートとして機能することです。本研究では、4つの異なる培養系のアーキタイプが、実験過程および生物学的結果において定義され、特徴付けられる。これらには、2D ECM フリー、2D ECM、3D ECM フリー、および 3D ECM カルチャメソッドが含まれます。本書に示す戦略は、異なる研究所と研究グループ間で、シンプルでアクセスしやすく、再現性の高い戦略です。
歴史的に精巣のために、「in vitro」という指定は、精巣組織および細胞のいくつかの異なる培養方法のために使用されてきた。これらには、組織/臓器培養方法(すなわち、外植培養)5、単離された半細管培養6、精巣細胞培養7、およびデノボ組織形態形成(すなわち、生物学的構造およびオルガノイド)の方法が含まれる。体外精子形成の最初の調査は約100年前に行われ、ウサギの精巣の培養は19208年に、そして1937年にはマウスの外植体9で外植した。これらの最初の実験の中で、精子は培養の最初の週に大部分が退化することが観察されたが、いくつかのmeiottって分化する細胞が同定された。これらの歴史的な報告を連想させる、精巣培養は2011年に復活し、精巣10を研究するための実現可能な技術になるために最適化された。2011年以来、外植培養は、複数のレポート11、12、13,12で不妊治療の有能な精子を13産生している。しかし、外植培養が既存の在来精巣細管に依存しているため、これらの最近の進歩は、生物の体内からの除去時に維持または再開された組織機能である「ex vivo」精巣機能および精子形成の例としてより正確に記述されている。文献におけるその有病率にもかかわらず、精巣外植物内の長期生殖細胞維持および分化は、特に体外精子形成で完全に観察するのに十分な長さの時間枠にわたって14、15、16、17、18,15,16,17,18を複製することは困難である(ヒトでは19および74のマウスでは35日)。100年前に経験した同じ課題の多くが、今日でもex vivo精子形成の中で経験されていることを理解することは興味深いです。
ex vivoアプローチとは異なり、精巣オルガノイドは、細胞源(すなわち、一次精巣細胞)から完全にインビトロで生成されたデノボ組み立てられたマイクロ組織である。精巣オルガノイドは、既存のネイティブ組織に対するフィールドの歴史的依存を回避し、精巣生物学を完全にインビトロで再現するための創造的な戦略を提供します。ほとんどのオルガノイド組織モデルで共有される複数の要件があります。これらは、(1)生体擬態組織形態またはアーキテクチャにおいて、(2)代表組織の複数の主要な細胞型、(3)その生成における自己集合または自己組織化、および(4)表される組織の機能および生理学21、22、23、2422の一21定レベルをシミュレートする能力を含む。,23,24精巣の場合、これは4つの主要な特徴で捉えることができます:(1)主要な精巣細胞タイプを含む、 胚芽、セルトリ、ライディグ、骨膜、および他の間質細胞、(2)細胞指向組織アセンブリ、(3)適切に区分された細胞型を別々の管状コンパートメント(胚芽およびセルトリ)および間質領域(他のすべての細胞型)、および(4)ある程度の組織機能(例えば、生殖ホルモン分泌または生殖組織応答)および異なる細胞の応答を含む。生殖細胞分化ex vivoおよびin vitroを維持する際の歴史的課題を考慮すると、精巣生理学のシミュレーション(例えば、内分泌)機能を生成することを示唆する追加マーカーを用いた生体内模倣精巣精巣アーキテクチャ(すなわち、半細管に似た構造)の再現は、1日の精子で生殖機能を持続する臓器組織の生成に向けた優先的なマイルストーンである。
公示された精巣オルガノイド法の大部分は、市販のECM(例えば、コラーゲンまたは独自のECM製剤)25、26、27,26,27またはカスタム供給ECM(すなわち、脱細胞化精巣ECM由来ヒドロゲル)28、29、30,29,30を利用する。外因性ECMは、組織生成のための組み立て支持足場を提供することにより、デノボ組織形成を促進する。ECMの方法は、いくつかの生殖細胞の存在と組織模倣形態25、28を含む組織形成の印象的なレベルを28与えている。しかし、彼らが利用するECMは、常に普遍的に入手可能であるとは限らず(すなわち、脱細胞化されたECM由来ヒドロゲル)、そしていくつかの方法は洗練されたゲルおよび細胞の播種の向き(例えば、ECMおよび3D印刷の3層の勾配)25、31、3231,32を必要とする。25足場を含まない方法(例えば、ハンギングドロップおよび非接着培養プレート)33、34、35はまた、ECMゲルまたは足場を必要とせずに堅牢で再現性の高いオルガノイドを生成した。33,34,35しかし、これらの足場を含まないオルガノイドの組織形態は、生体内精巣と異なることが多く、これらの報告のほとんどは、組織形成を促進するために生化学的ECM添加剤を組み込み、33、34、36、34,36または代わりに、強制細胞凝集および圧縮34のための遠心分離に依存し、細胞指向移動および自己組織化を研究するのに理想的ではない。33
本稿で紹介する4つのオルガノイド生成法には、ECM依存性と独立した戦略の両方が含まれ、それぞれが細胞駆動型オルガノイド自己集合の観察を可能にする単純な細胞播種を用いる。4 つの手法はすべて、同じセルの中断から実行することも、カスタムおよびセル型の濃縮された集団を利用することもできます。これらの方法の強みは、オルガノイドをリアルタイムで自己集合的に観察し、精巣構造が異なる培養マイクロ環境間でどのように自己集合するかを直接比較する能力である。これら4つの培養方法の間の語体的な違いは、研究者の研究課題または主題に与える影響について考慮されるべきである。各方法は、24時間以下の生物学的構築物またはオルガノイドを生成する。結論として、ここで提示される方法は、精巣オルガノイドアセンブリ、組織の発達、および精巣生理学を試験的に研究するためのオルガノイド組立技術のツールキットを提供する。

<table><tbody><tr><td>0.22 um媒体の生殖不能</td><td>フィルターMilliporeのシグマ</td><td>scgpu05re</td><td>生殖不能のろ過媒体</td></tr><tr><td>3&ベータのため;HSD 一次抗体</td><td>Cosmo Bio Co</td><td>K0607</td><td>Leydig cell marker, 1:500 dilution</td></tr><tr><td>AlexaFluor 568 &-Mouse</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21202</td><td>蛍光タグ付き二次抗体</td></tr><tr><td>AlexaFluor 568 &-Rabbit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10042</td><td>蛍光タグ付き二次抗体</td></tr><tr><td>Alpha Minimum Essential Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11-095-080</td><td>培地のベース</td></tr><tr><td>コラゲナーゼ I</td><td>ワーシントン バイオ</td><td>LS004197</td><td>解離液用 1</td></tr><tr><td>コーニング マトリゲル膜マトリックス、LDEVフリー</td><td>コーニング</td><td>354234</td><td>2Dおよび3D ECM培養ゲルのキャスティングに使用される細胞外マトリックス</td></tr><tr><td>Countess セルカウンター</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>C10227</td><td>オートメイテッドセルカウンター(血球計算装置)</td></tr><tr><td>Countess Cell Counting Chamber Slides</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10228</td><td>Hemacytometer slide for use with Countess自動カウンター</td></tr><tr><td>DDX4 一次抗体</td><td>Abcam</td><td>138540</td><td>Spermatogonia marker, 1:500 dilution</td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I (2,280 u/mgDW)</td><td>Worthington Bio</td><td>LS002140</td><td>解離液用 1</td></tr><tr><td>DPBS 1X, + CaCl + MgCl</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14040182</td><td>再構成用 ヒアルロニダーゼ</td></tr><tr><td>ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水 +Ca/+Mg</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>14040117</td><td>PBS</td></tr><tr><td>胚グレード H2O</td><td>ミリポア シグマ</td><td>W1503</td><td>再構成用 コラゲナーゼIおよびドナーゼI</td></tr><tr><td>の再構成用 ウシ胎児血清</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>16000044</td><td>クエンシング酵素解離液</td></tr> 卵<tr><td>胞刺激ホルモン</td><td>アブカム</td><td>ab51888</td><td>長期オルガノイド培養用</td></tr><tr><td>ヒト絨毛性ゴナドトロピン</td><td>ミリポアシグマ</td><td>C1063</td><td>長期オルガノイド培養用</td></tr><tr><td>ヒアルロニダーゼ、ウシ精巣由来</td><td>ミリポアシグマ</td><td>H4272</td><td>解離液用 2</td></tr><tr><td>インヒビンB 酵素結合免疫吸着アッセイ</td><td>アンッシュラボ</td><td>AL-107</td><td>インヒビンB ELISAキット</td></tr><tr><td>ノックアウト血清交換</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10828-028</td><td>基礎培地用血清ソース</td></tr><tr><td>マイクロ組織 3Dペトリ皿 マイクロモールドスフェロイド(24-35、5x7アレイ)</td><td>ミリポアシグマ</td><td>Z764051</td><td>3D ECMフリーオルガノイド製造用</td></tr><tr><td>Nunc、Lab Tek IIチャンバースライドシステム、4ウェル</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-565-7</td><td>2D ECMフリー、および2D、3D ECM培養</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン用</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15-140-122</td><td>メディア用抗生物質</td></tr><tr><td>リチャード・アラン・サイエンティフィック;Histogel, Specimen Processing gel</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>HG-4000-012</td><td>For aiding paraffin embedding</td></tr><tr><td>SOX9 primary antibody</td><td>Millipore Sigma</td><td>AB5535</td><td>Sertoli Marker, 1:500 dilution</td></tr><tr><td>Tedklad Global Mouse Chow (ブリーダー)</td><td>Teklad Global</td><td>2920</td><td>Mouse food without phytoestrogens</td></tr><tr><td>Tedklad Global Mouse Chow (Maintenance)</td><td>Teklad Global</td><td>2916</td><td>植物性エストロゲンを含まないマウス食品</td></tr><tr><td>テストステロン 酵素結合免疫吸着アッセイ</td><td>Calbiotech</td><td>TE373S</td><td>テストステロン ELISA キット</td></tr><tr><td>トリパン ブルー 溶液、0.4%</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>15250061</td><td>細胞計数</td></tr><tr><td>用&α;SMA 一次抗体</td><td>ミリポア シグマ</td><td>A2547</td><td>尿管周囲マーカー、1:500 希釈</td></tr><tr><td>&β;カテニン一次抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>610154</td><td>Sertoli Cytoplasm marker、1:100</td></tr></tbody></table>希釈

細胞外マトリックスベースおよび細胞外マトリックスフリーのマウス精巣オルガノイドの生成

Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids

精巣オルガノイドは、精巣の発達、精子形成、および内分泌学を体外で研究するためのツールを提供します。精巣オルガノイドを作るためにいくつかの方法が開発された。これらの方法の多くは、de novo組織アセンブリを促進するために細胞外マトリックス(ECM)に依存しますが、バイオミメティック形態と組織の機能の点で方法の違いがあります。さらに、公開されたメソッドの直接比較はほとんどありません。ここでは、オルガノイド生成プロトコルの違いを研究することによって直接比較が行われ、結果が得られる。4つの原型生成方法:(1)2D ECMフリー、(2)2D ECM、(3)3D ECMフリー、および(4)3D ECM培養法が記載されている。精巣オルガノイド発生を評価するために3つの主要なベンチマークが使用された。これらは、細胞自己集合体、主要な細胞タイプ(セルトリ、レイディグ、胚芽、および骨膜細胞)を含み、適切に区分された組織アーキテクチャである。試験された4つの環境のうち、2D ECMおよび3D ECMフリー培養は、尿管細胞型と間質細胞型のデノボ区画化、管状構造の開発、確立された長期内分泌機能など、天然精巣に最も類似した内部形態を有するオルガノイドを生成した。研究されたすべての方法は、未ソートの一次マウス精巣細胞懸濁液を利用し、一般的にアクセス可能な培養リソースを使用した。これらの精巣オルガノイド生成技術は、精巣の器官形成および生理学の研究イニシアチブのための非常にアクセス可能で再現性の高いツールキットを提供する。

精巣細胞が培養72時間以内に自己集合しなかった場合、オルガノイド生成は失敗と考えられていたが、ここで提示されるすべての方法は、若年性(5dpp)マウス細胞を使用する場合には24時間以内に組み立てられる。培養後も自由に懸濁した細胞( 図1の0hカラム)の継続として提示される生物学的構築物生成の失敗(72時間)。。組織自己集合性がない場合、任意の見かけの細胞クラスターは、穏やかな操作(すなわち、ピペット化)でさえも個々の細胞に容易に分散する。正常に生成された組織は、最初は3D細胞の「クラスター」として観察された( 図1の6hカラムの黄色い矢印)。ECMフリー環境(2Dおよび3D)内では、これらの構造は、特に3Dアガロースペトリ皿(図1A,C)で、文化の最初の24時間にわたって「コンパクト」に見えました(ECM 環境 (2D および 3D) のセル クラスターでは、クラスタとその周辺環境との間に明確なマージンがあります (<stro...

ここでは、原発性新生児マウス精巣細胞から精巣オルガノイドを生成する4つの方法、すなわち、細胞外マトリックス(ECM)およびECMフリーの2Dおよび3D培養環境について説明する。これらの技術は、複数の研究アプリケーションを持っており、体外で精巣の発達と生理学を研究するために特に有用である。

Testicular organoids provide a tool for studying testicular development, spermatogenesis, and endocrinology in vitro. Several methods have been developed ...

これらのプロトコルは、2Dまたは3D培養条件下でECMおよびDCMフリー環境の両方で、構造的に模倣および内分泌機能精巣オルガノイドを多数生成することを可能にする。これらの技術は、非常に再現性が高く、標準的な生物学的実験室の設定に簡単に適用され、共通のツールと材料のみを利用しています。精巣オルガノイドは、インビトロで精子形成と生殖内分泌をシミュレートするための新しいツールであり、いつかインビトロゲーム産生の研究を可能にするかもしれません。まず、安楽死させたマウスの上に、解剖マットの上にマウスの上を置き、70%エタノールで腹部を殺菌します。下腹部の皮膚を鉗子でテントに張り、はさみで開きます。腹部の左下および右のりぎり領域に精巣を見つけ、精管およびアンカー結合組織への接続を切断する。その後、動物から精巣全体を持ち上げます。事前に平衡したBMのペトリ皿に入れます。解剖顕微鏡の下で、小さなマイクロ解剖はさみのいずれかで、または2つの細かい鉗子で穏やかに引き裂くことによって、各精巣の一端にチュニカアルブギネアに小さな切開を行います。精巣を切開の反対側の端から保持しながら、細かい鉗子で軽く絞り、テクリアの穴に向かってスイープモーションを押し込み、精巣組織を1つのまとまりのある部分として放出します。組織を小さく切ります。1ミリリットルのプリウォーム解離溶液1つに入れ、摂氏37度で10分間インキュベートします。インキュベーション後、P1000ピペットで精巣片を50回軽くトリチュレートします。細管が互いに分離し、間質組織から分離することを確認します。塊が残っている場合は、さらに5分間インキュベートし、再びトリチュールします。解離混合物の1ミリリットルあたり33マイクロリットルのヒアルロンジダーゼストック溶液を加える。その後、P1000ピペットで50回トリチュレートし、5分間摂氏37度でサンプルをインキュベートします。インキュベーション後、P200ピペットで50回トリチュレートします。目に見える細管または細胞の塊が存在することを確認した後、サンプルの総体積の10%にFBSを加えることによって解離酵素をクエンチし、P200ピペットで数回それを三分化する。40マイクロメートルの細胞ストレーナーの中央を培地で濡らし、吸引し、サンプルを予め濡れたストレーナーに加え、それを濾過して単一細胞懸濁液を作り出します。懸濁液を100回gで7分間遠心する。上清を捨て、新鮮なBMで細胞を再中断します。トリパンブルーの排除を使用してヘモサイトメーター上の生存細胞を数え、遠心分離機を再び、新鮮なBMで再中断します。2D ECMフリー培養の場合、プレート単細胞懸濁液を4ウェルチャンバースライドに直接配置し、スライドを35°Cインキュベーターに配置します。2D ECM-cultureの場合、冷たい1対1の希釈された細胞外マトリックス媒体の100マイクロリットルを4ウェルチャンバースライドに分配し、ゲルが皿底を覆うことを保証する。ECMがゲルに重合できるように、最低30分間、インキュベーターにスライドを置き、その上に細胞懸濁液を加えます。3D ECMフリーの文化のために、アガロース3Dペトリ料理を24ウェルの文化皿に入れ、1ミリリットルのBMで覆います。35°Cインキュベーターで少なくとも30分間BMで平衡化し、BMを捨て、新鮮なBMの1ミリリットルでもう一度平衡を繰り返します。ウェルからすべてのBMを取り出し、3Dペトリ皿の中央凹部の内側ではなく、新鮮なBMの200マイクロリットルを分配し、マイクロウェルインサートの中央セルシード凹部の内側から残りのBMを収集します。単一セルの懸濁液を中央の凹部に分配し、上下に軽くトリチュレートします。食皿を加湿した35度の培養器に入れます。翌日、アガロース3Dペトリ皿の周りから既存のメディアをゆっくりと慎重に取り除き、新鮮なBMの1ミリリットルに置き換えます。オルガノイドは一晩で圧縮され、底部で休むことを可能にするはずです。3D ECM培養の場合、BMの細胞懸濁液の等しい部分を冷たプレ解凍ECMと組み合わせて単細胞懸濁液を調製する。それが十分に混合されていることを確認するために数回トリチュレート。その後、すぐに4ウェルチャンバースライドに混合物を分配し、プレートの底全体を覆っていることを確認します。チャンバースライドを摂氏35度でインキュベートし、その内容物を少なくとも30分間重合させます。重合後、培養物の上に500マイクロリットルのBMを加える。35°Cですべてのオルガノイドモデルタイプを培養します。すべての文化タイプについて、メディアの半分を2日ごとに新鮮なBMと交換します。このプロトコルは、若年性マウス精巣細胞を用いて24時間以内にオルガノイド生成を達成するために使用された。正常に生成された組織は、最初は3D細胞クラスターとして観察された。ECM 環境では、セル・クラスターはクラスターとその周辺環境の間に明確なマージンを持っていました。細胞クラスターは、ECMを横断し、融合することも観察された。3D ECM カルチャでは、他のすべてのカルチャメソッドよりも、de novo 構造体を組み立てるのにかなり多くの時間が必要でした。そして、3D ECMフリー培養は、3Dアガロースペトリ皿の各井戸内に単一の大きくてコンパクトなクラスターを持つ最大のクラスターを生産しました。オルガノイドモデルがネイティブ組織に似ているかどうかを評価するために、生物学的構築物を細胞特異的マーカーについて調査し、免疫蛍光で視覚化した。2D ECMおよび3D ECMフリーの方法は精巣の区分の非常に模倣の内形学を有するオルガノイドを作り出した。3D ECMフリーの集付オルガノイドに対して長期分析を行った。オルガノイドを14日間培養し、次いで細胞および構造特異的マーカーについて調査した。チューブ状構造が観察された。3D ECMフリーオルガノイドは、ゴナドトロピン刺激を伴う12週間の培養で内分泌機能についても研究された。テストステロンとインヒビンBは、両方ともオルガノイド調整培地から定量化された。12週間後, ゴナドトロピンを除去しました 48 時間, テストステロンとインヒビン B 濃度が減少します。.性腺刺激ホルモンが戻ったとき、両方のホルモン濃度が有意に増加し、適切な内分泌応答性を示す。オルガノイドアセンブリは、生存可能な未熟精巣細胞の自律的な行動を利用する。創造的な実験はカスタマイズされた細胞分類または雑種細胞混合物を使用して容易に考案することができる。細胞播種後、ライブビデオイメージングまたはタイムラプスイメージングを使用して、オルガノイドの自己集合を定量化することができます。培養物全体、オルガノイドおよびコンディション培地を収集して、組織学的およびアミノアッセイ分析を行うことができます。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

ここで提示する前立腺上皮オルガノイドにおける薬理学的応答を研究するためのプロトコルである。オルガノイドは生体内生物学によく似ており、患者の遺伝学を再現し、魅力的なモデルシステムとなっています。前立腺オルガノイドは、野生型前立腺、遺伝子操作されたマウスモデル、良性ヒト組織、および進行前立腺癌から確立することができる。...

遺伝子型と突然変異プロファイルを薬理学的応答に変換するツールとしての前立腺オルガノイド培養

上皮細胞と間質細胞からなるヒト原発性子宮内膜オルガノイドを生成し、天然子宮内膜組織の特性を保持するプロトコルが提示される。このプロトコルは、子宮組織獲得から子宮内膜オルガノイドの組織処理までの方法を記述する。...

多細胞ヒト初等子宮内膜オルガノイドの生成

ここでは、市販のマイクロウェル培養システムを用いた精巣特異的組織アーキテクチャを用いたブタ精巣オルガノイドの再現可能な生成のためのプロトコルを提示する。...

マイクロウェル培養を用いた精巣特異的建築を用いたブタ精巣オルガノイドの生成

乳腺は二重構造であり、外筋上皮および内皮上皮細胞を含む。提示は、微分トリプシン法を用いてオルガノイドを調製するためのプロトコルである。この効率的な方法により、研究者はこれら2つの細胞タイプを別々に操作して、乳腺の形態と機能における彼らの役割に関する質問を探求することができます。...

微小トリプシン法によるモザイク乳腺オルガノイドの生成

このプロトコルでは、一次正常および腫瘍乳腺組織から差動遠心分離によって上皮オルガノイドを生成するためのアプローチについて説明します。さらに、包埋オルガノイドの3次元培養および免疫蛍光イメージングのための説明書が含まれています。...

継代なしの正常および腫瘍乳腺組織からのマウスおよびヒト上皮オルガノイドの生成とイメージング

成人のヒト心臓から単離された線維芽細胞をゼラチンでコーティングした皿の上でコンフルエントに培養し、心筋特異的な細胞外マトリックスを作製した。脱細胞化後、この基質は他の心臓細胞や細胞-マトリックス相互作用の培養や研究に使用できます。...

培養ディッシュコーティングのための成体ヒト線維芽細胞からの心臓細胞外マトリックスの作製

オルガノイドは、疾患モデリングのための貴重なツールとなっています。細胞外マトリックス(ECM)は、オルガノイド生成中の細胞運命を導き、天然組織に似たシステムを使用することで、モデルの精度を向上させることができます。この研究では、動物由来のECMとゼノフリーのハイドロゲルにおける人工多能性幹細胞由来ヒト腸オルガノイドの生成を比較しています。...

ヒト幹細胞維持と腸管オルガノイド生成のための基底膜マトリックスの比較研究

この記事は半固体基底の膜のマトリックス内の脾臓のセルを凝集し、カプセル封入するためのプロトコルを記述する。基底膜マトリックスコンストラクトは、オルガノイド発生の研究、または in vivo...

マウス脾臓組織形成研究のための基底膜マトリックスカプセル化細胞凝集

このプロトコルは、 in vitro および in vivoでの高悪性度漿液性卵巣癌(HGSOC)マウスモデルの開発について詳しく説明しています。マウス卵管オルガノイドの誘導から,ヒトHGSOC遺伝学を再現するための遺伝子組み換え,および腫瘍の in vivo...

高悪性度漿液性卵巣癌モデリングのための卵管上皮細胞からのマウス由来オルガノイド株の開発

本プロトコルは、制御された三次元培養システムにおいて乳腺形態形成の重要な特徴を再再現するヒト乳房オルガノイドを生成する定義されたハイドロゲルを用いた方法を記述しています。...

乳腺形態形成を再現する三次元ヒト乳房オルガノイドを生成する定義されたハイドロゲルベースの方法

学ぶマウス精巣オルガノイドの生成法。ECMあり・なしの2D・3D培養で構造的模倣性と内分泌機能を持つオルガノイドを作製し、精子形成と生殖内分泌学の研究に応用します。

細胞外マトリックスベースおよび細胞外マトリックスフリーのマウス精巣オルガノイドの生成

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