高スループットDNA抽出プレートの装填のための改変方法により、汚染の可能性を低減
June 3rd, 2020
DNA抽出用に96ウェルプレートをロードする現在の方法は、汚染を起こしやすい可能性があります。ウェル間のクロスコンタミネーションのリスクを低減する96ウェルプレートの新しいロード方法を詳しく説明します。当社の方法は、他の研究者が高スループットDNA抽出技術の効率を活用し、汚染のリスクを最小限に抑えるのに役立ちます。
このプロトコルは、サンプルクロス汚染のリスクを同時に低減しながら、96ウェルDNA抽出プレートのロードの効率を高める技術を提供します。この技術は、96ウェルプレートの各ウェルにサンプルを個々に添加することにより、DNA抽出の重要な第一段階で汚染の可能性を低減します。この方法論は、マイクロバイオーム研究の多様な分野のいずれかに適用することができます。
実験を始める前に、70%エタノールでベンチトップをミスト。拭いた後、ベンチに10%漂白剤を吹き付ける前に、ベンチを空気乾燥させます。拭いて空気乾燥した後、マイクロスコキュラー、スパタラー、湾曲した外科用はさみを95%エタノールに浸し、ツールを炎にさらします。
その後、各ツールを10%漂白剤に浸し、ツールを空気乾燥させます。サブサンプリングの前に、エタノールは手袋を殺菌し、土壌サンプルを十分に均質化します。次に、各チューブに適切な位置を持つサンプル ID を割り当てます。
各チューブが約半分になるまで、チューブごとに1つのサンプルで2ミリリットル遠心管を標識した95を充填します。第96管は抽出ブランクとして使用されるべきである。氷の上にサブサンプルチューブを置き、96ウェルプレートのウェルラベルに従って96無菌200マイクロリットルのフラットキャップPCRチューブにラベルを付け、ラベル200マイクロリットルチューブを96ウェルラックに順番に配置します。
実験用に96ウェルプレートを準備するには、プレートからカバーを取り外し、カバーを無菌のビニール袋に入れます。袋を密封して汚染を防ぎ、プレートを穿孔可能なシールフィルムで覆います。その後、ゴムローラーを使用してシールをプレートにしっかりと接着し、プレートを摂氏4度で保存します。
サブサンプルをプレートに移すには、2つのミリリットルサブサンプルチューブの24を氷ブロックに入れ、サンプル名とウェル位置シートを使用して、適切な200マイクロリットルのフラットキャップチューブを選択します。サブサンプルを一度に1個ずつ、1サンプルあたり5秒間ボルテックスして均質化を確保し、各サンプルの約200マイクロリットルを適切な対応するPCRチューブにロードします。サンプルの24個すべてがロードされたら、漂白したびれた紙のワイプを使用して1本のPCRチューブの外側を洗浄し、ベンチのチューブを反転してタップしてサンプルをチューブの上部に移動させます。
炎の殺菌および漂白されたはさみを使用して、サンプルの開口部を作成するためにPCRチューブの底をクリップし、適切なウェルに達するまでカットエンドを上に向けてプレートの上にチューブを渡します。プレートを少し傾け、切り込み前の密閉フィルムの穿刺を容易にし、チューブを正しい井戸の真上に置き、切った先端がウェルに収まるようにプレートを素早く慎重に反転させます。すべての土壌がチューブから井戸に落ちるまでチューブの上部をタップするために殺菌ツールを使用してください。
そして、リードを閉じた状態で井戸にチューブを残します。すべてのサンプルが同じ方法でロードされたら、1つの200マイクロリットルのフラットキャップPCRチューブを取り除き、750マイクロリットルのビーズ溶液をサンプルウェルに加えます。200マイクロリットルのフラットキャップPCRチューブを井戸に戻し、井戸に押し込み、井戸に押し込む。
そして、井戸がロードされていることを示すためにチューブの上部をマークするためにシャーピーを使用してください。すべての井戸にビーズが積み込まれるとき24のサンプル管を摂氏20度の貯蔵に戻し、24個の新しいサブサンプルチューブを氷のブロックに加え、次のサンプルセットを96ウェルプレートに積み込むことができます。95個のウェルすべてにサンプルとビーズ溶液がロードされたら、ビーズ溶液を96番目の井戸にのみ追加します。
すべてのチューブを取り外し、覆われた井戸の上にのみ渡し、慎重にプレートからピアス可能なフィルムを取り除きます。その後、慎重にビニール袋からプレートにプレートカバーを転送し、計画抽出まで20°Cでプレートを置きます。プレートローディング方法の比較は、実証された方法がブランクウェル内で最も低いDNA濃度をもたらすことを示しています。
この方法を用いて、マクファーソンらによって提案された方法を用いた場合、DNA濃度は有意に低かった。この方法によるDNA濃度は、qiagenのデフォルト法と統計的に異なるものではなかった。3つの方法はいずれも、1マイクロリットル当たり2ナノグラム以下の平均DNA濃度を生成する。
この新しい方法だけが測定可能なDNA濃度を持たない井戸を作り出すが。こぼれの可能性を最小限に抑えるには、プレート上で200マイクロリットルチューブを直立に保ち、プレートを傾け、チューブを正しいウェルに挿入します。
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概要
この研究は、DNA抽出時の効率を高め、交差汚染のリスクを低減するための96ウェルプレートの新しい装填方法を紹介します。この技術は、ミクロバイオーム研究の様々な分野に適用可能で、ハイスループットのDNA抽出プロセスを改良することを目的としています。
主要な研究構成要素
研究領域
- ミクロバイオーム研究
- ハイスループットのDNA抽出
- 汚染防止方法
背景
- DNA抽出プロセスにおけるサンプル間の交差汚染に直面する課題
- サンプルの完全性を維持することの重要性
- 効率的なラボプロトコルの必要性
使用された方法
- 96ウェルプレートにサンプルを装填するプロトコル
- 汚染を最小限に抑えるために使用されるツールと滅菌技術
- 既存の方法との比較分析
主要な結果
- 新しい方法は、従来のプロトコルと比較して、ブランクウェルにおけるDNA濃度を大幅に低減します
- ブランクウェルにおいて測定可能なDNA濃度がありません
- 観察結果は、DNA収率を損なうことなく、汚染制御が向上していることを示しています
結論
- この研究は、DNA抽出ワークフローにおける汚染リスク低減に効果的なアプローチを示しています
- 研究者が実験結果の信頼性を向上させるための貴重な洞察を提供しています
よくある質問
Executive Industry Relevance
In high-throughput DNA extraction workflows, cross-contamination between samples in 96-well plates compromises data integrity and increases false-positive rates in downstream applications such as microbiome profiling and biomarker discovery. This method addresses a critical pre-analytical vulnerability by reducing well-to-well drift and double-loading, thereby enhancing the reliability of high-throughput nucleic acid preparation. For biopharma R&D, minimizing contamination at the extraction stage improves predictive confidence in target validation assays and supports reproducible screening campaigns.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Reduces false signals from contaminant DNA, improving target specificity in hypothesis-driven screening.
- Operational Value: Enables consistent sample preparation across replicates, reducing variability in early-stage target engagement data.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces extraction blanks with no measurable DNA concentration, establishing a true negative control for assay background.
- Operational Value: Standardizes sample loading into 96-well formats, improving reproducibility across automated and manual pipetting platforms.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant sample processing by maintaining microbiome sample integrity from collection to extraction.
- Operational Value: Facilitates scalable processing of environmental or biological cohorts without increasing false discovery rates.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the early discovery continuum, specifically enhancing sample preparation for high-throughput extraction prior to library construction and sequencing in microbiome-based target identification workflows.
- Discovery Biology: Ensures that observed microbial signals originate from true biological variation rather than technical artifacts.
- Screening: Generates contamination-controlled DNA inputs suitable for quantitative PCR, sequencing, or functional screening assays.
- Analytics: Delivers low-background DNA extracts that improve signal-to-noise ratios in metagenomic and metatranscriptomic analyses.
- Translational Research: Maintains continuity from environmental or clinical sample collection through unbiased microbial profiling.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, contamination-minimized loading procedure applicable across multiple projects and laboratory sites.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through reduced mechanistic ambiguity from contaminant-derived signals.
- Operational Value: Reproducibility and standardization of high-throughput plate loading across users and batches.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions in target validation by lowering false-positive risk in screening data.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of leads based on cleaner, more reliable molecular phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires training in aseptic technique and tool sterilization protocols including ethanol and bleach treatment.
- Depends on access to pierceable PCR sealing films, sterile flat-capped PCR tubes, and flame-sterilizable dissection tools.
- Necessitates standardized sample tracking via well-location sheets to prevent misloading during serial processing.
- Involves cold storage steps (ice blocks and 4°C plate storage) to maintain sample integrity during loading.
- Limited to manual or semi-automated workflows; not compatible with fully robotic liquid handlers without adaptation.
