実験計画法と自動化ワークフローで実現された遺伝子コード化されたバイオセンサー設計空間の効率的なサンプリング

バイオテクノロジーへの応用に向けたバイオセンサーの開発と最適化は、私たちの研究の範囲です。具体的には、バイオセンサーの遺伝的要素の調節を通じてバイオセンサーを最適化および設計する方法を理解することを目指しています。古典的なプロモーター工学や蛍光活性化細胞選別など、直感主導の設計選択は、バイオセンサーの特性評価と設計に日常的に適用されている技術です。

実験計画法は、遺伝子回路設計にはまだ広く採用されていません。このプロトコルを通じて、遺伝子回路とバイオセンサー設計におけるこれらのタイプの技術の採用を増やすことを目指しています。まず、理論上のライブラリサイズを決定し、95%を超えるライブラリカバレッジを確保するために必要な個々のバリアントの数を計算します。

スクリーニングするコロニーの数に応じて、抗生物質を添加した溶原性ブロス培地の必要量を計算します。リキッドハンドラーソフトウェアを開き、MTP液体移送プログラムの横にある[実行]をクリックします。準備した培地を対応するリザーバー位置に置きます。

次に、レイアウトに従って空のマイクロタイタープレートでデッキを満たします。200マイクロリットルの培地を分注するようにプログラムを設定します。[OK]をクリックして、プログラムの開始を確認します。

次に、充填されたマイクロタイタープレートウェルをコロニーピッカープラットフォームに移し、プラスミドバリアントライブラリDNAで形質転換されたPseudomonas putidaの正方形のオーガープレートを開封してコロニーピッカープラットフォームに移します。コロニーピッカーを使用して、形質転換プレートからの単一のコロニーを各プレフィルドウェルに接種します。接種したプレートを再密封し、オフラインの振とうインキュベーターに移します。

インキュベーション後、成長したプレートをリキッドハンドラープラットフォームに戻し、開封します。MTPプロトコルにグリセロールを追加するプロトコルの横にある[実行]をクリックします。画面上のプレートのレイアウトがリキッドハンドラードックのプレートレイアウトと一致していることを確認します。

そして、順番に [OK] をクリックしてプロトコルを実行します。完了したら、プレートを密封し、毎分800回転のオフライン振とうインキュベーターで5分間短時間混合します。プレートにバーコードを付け、必要になるまで摂氏80度で保管します。

ディープウェルブロックに必要な抗生物質添加培地の量を計算します。DWB液体移送プログラムの横にある[実行]をクリックします。メディアが正しいリザーバーに追加されていることを確認します。

空のディープウェルブロックは正しいレイアウト位置にあり、チップの十分な供給が利用可能です。495マイクロリットルの培地を分注するようにプログラムを設定します。準備ができたら、順番にクリックします OK プログラムを開始します。

次に、充填されたディープウェルブロックを通気性のある膜で密封し、摂氏4度の一時保管場所に移します。次に、解凍されたMTPプログラムから接種の横にある[実行]をクリックします。MTPクライオストックと充填ディープウェルブロックがレイアウトごとにプラットフォームに移され、十分なチップがロードされていることを確認します。

順番に、[OK] をクリックして初期化します。プログラムが終了したら、接種した一晩ディープウェルブロックを通気性のある膜で密封します。それらをオフラインプレートシェーカーインキュベーターに移し、摂氏30度、毎分800回転、湿度75%で16時間セットします。

クライオストックマイクロタイタープレートを再密封し、混合し、摂氏80度の冷凍庫に戻します。次に、スクリーニングする一晩のディープウェルブロックに必要なエフェクター濃度と抗生物質濃度を添加した培地の量を計算します。DWB液体移送プログラムの横にある[実行]をクリックします。

次に、エフェクターを補充した培地リザーバーが正しく配置されていることを確認します。空のディープウェルブロックをリキッドハンドラープラットフォームに追加します。十分なチップが利用可能な場合は、順番に「OK」をクリックしてプロトコルを開始し、アッセイディープウェルブロックを生成します。

充填後、アッセイディープウェルブロックを通気性のある膜で密封します。リキッドハンドラーに空のプレートを補充します。すべてのアッセイブロックが満たされるまで接種を繰り返します。

次に、アッセイDWBプログラムへの転送の横にある[実行]をクリックします。エフェクターを添加した培地を含む密封されていないアッセイディープウェルブロックが正しく配置された後、レイアウトごとに成長したP.putidaを含む一晩のディープウェルブロックを移して開封します。[OK] を順番にクリックしてプロトコルを開始します。

プログラムが終了したら、アッセイプレートをオフラインインキュベーターに移送します。接種後、一晩のディープウェルブロックを廃棄します。次に、ディープウェルブロックを遠心分離機に移します。

摂氏18度の氷制御ローターで4, 000 Gの細胞を5分間ペレット化します。上清を廃棄した後、遠心分離機ブロックをリキッドハンドラープラットフォームに置きます。スクリーニングするディープウェルブロックの数に基づいて、必要なPBSの1倍の体積を計算します。

アッセイの横にある「実行」をクリックし、PBS再懸濁DWBプログラムをセットアップし、分注量を500マイクロリットルに設定します。次に、PBSが正しいリザーバーに追加されていることを確認し、レイアウトに従って遠心分離プレートを配列します。クリック OK チップの可用性を確認した後、プログラムを開始します。

再密封し、再懸濁したディープウェルブロックをリキッドハンドラーから取り外します。プレートの下側をチェックして、ペレットが完全に再懸濁されていることを確認します。アッセイセットアップセルとPBSエディションMTPプログラムの横にある[実行]をクリックします。

次に、再懸濁したディープウェルブロックをレイアウトに従ってリキッドハンドラーに移します。レイアウトに従って空のマイクロタイタープレートをロードし、分注量を200マイクロリットルに設定してから、「OK」をクリックします。充填されたマイクロタイタープレートをオフラインのマルチモードプレートリーダーに移し、相対蛍光とOD600を測定します。

5, 000のプロモーターバリアントの自動スクリーニングにより、3.6倍を超える活性化を示す上位候補が特定されました。100のユニークなバリアントのEC 50値をプロットして、感度分布を視覚化し、堅牢な候補を特定しました。EC 50値は、226の濃縮されたバリアントについて計算され、Lin-log変換を使用してランク付けされ、感度スケールのライブラリを形成しました。

4 つのモジュールからの 1、0、および 1 レベルの分散を使用して、最終的なスクリーニング デザインが構築されました。輸送、レギュレーター、P-out、および出力リボソーム結合部位モデルプロファイルは、4つのモジュールの発現レベルの変化がEC 50とヒル係数に非線形にどのように影響するかを明らかにしました。RBS-Outで最適な発現の組み合わせを同定し、感度と傾きの両方に強いプラスの効果を示します。

理想的なモジュール強度を組み込んだグローバルに最適化されたバイオセンサー バリアントは、親バージョンと DSD 最適化バージョンの両方と比較して、感度とヒル係数が向上していることが実証されました。