三次元運動神経オルガノイド発生

このプロトコールは、体外のヒトiPS細胞に由来する運動神経オルガノイドを用いて、軸索束の発生や疾患の根底にあるメカニズムの解明を容易にします。神経細胞のスフェロイドとカスタムメイドのマイクロカルチャーチップを培養するだけで、一方向軸索束を自発的に生成し、さまざまな下流実験に利用することができます。運動神経オルガノイドは、以前のin vitroシステムであったより生理学的モデルを提供することにより、LSを含む運動ニューロン疾患の薬物のスクリーニングと試験を容易にすることができます。

ドラフトで、適切なPPEを着用し、3ミリリットルのSU-8 2100をアセトン洗浄されたシリコンウェーハに分注し、ウェーハをスピンコーターの中央に置きます。ウェーハを真空で固定し、ウェーハを毎分500回転で10秒間回転させて、ウェーハ表面全体にSU-8を均一にコーティングし、次にウェーハを毎分1,500回転で30秒間回転させ、毎秒300回転の加速でウェーハを回転させて、ウェーハ上に150ミクロンの厚さのフォトレジスト層を得る。ソフトベーキング後、フォトマスクをマスクアライナーにセットし、ウェーハを紫外線に60秒間さらします。

ホットプレート上でベーキングした後、オービタルシェーカーで攪拌しながらフォトレジスト現像液で10〜20分間現像し、途中で現像液を一度交換します。チップの最下層を組織培養用に調製するには、新たに調製したPDMSをウェーハに所望の厚さまで注ぎ、真空チャンバー内で混合物を脱気します。PDMSをオーブンで60°Cで少なくとも3時間硬化させます。

冷却後、ブレードを使用して硬化したPDMSをウェーハから切断し、ベーキングを施した未硬化のPDMSを使用して培地リザーバーをPDMS最下層に接着し、組み立てられたPDMS組織培養チップを取得します。運動神経オルガノイド形成のためのPDMSチップを調製するには、チップと76×52ミリメートルの顕微鏡ガラスを70%エタノールを含むペトリ皿で少なくとも1時間滅菌します。インキュベーションの最後に、チップを湿った顕微鏡ガラスに置きます。

一晩乾燥させた後、チップはガラスに付着するはずです。DMEM/F12 の希釈した基底膜マトリックスの 30 マイクロリットルの液滴をチャネルの入口の片側に置き、入口の反対側から溶液を吸引して、マイクロチャネルの表面をマトリックスでコーティングします。次に、PDMSチップとコーティング溶液をペトリ皿で室温で1時間インキュベートします。

3D iPS細胞の運動ニューロンへの分化を誘導するには、100マイクロリットルのフィーダーと無血清細胞培養培地に10マイクロモルのY-27632を添加した96ウェルU底プレートの適切な数のウェルに、ウェルごとに10〜4のiPS細胞を播種します。翌日、各ウェルの上清を、10マイクロモルのSB431542と100ナノモルのLDN-193189を補充した100マイクロリットルのKSR培地と交換します。2日目と3日目に、上清を100マイクロリットルのKSR培地に交換し、10マイクロモルのSB431542、100ナノモルのLDN-193189、5マイクロモルのDAPT、5マイクロモルのSU5402、1つのマイクロモルのレチノイン酸、および1つのマイクロモル平滑化アゴニストを補充します。

4 日目と 5 日目に、上清を 75% の KSR 培地と 25% の N2 培地の混合物に 10 マイクロモルの 10 マイクロモル SB431542、100 ナノモルの LDN193189、5 マイクロモルの DAPT、5 マイクロモルの SU5402、1 つのマイクロモル レチノイン酸、および 1 つのマイクロモル平滑化アゴニストを補給します。6 日目と 7 日目に、上清を 50% の KSR 培地と 50% の N2 培地の混合物に交換し、5 マイクロモルの DAPT、5 マイクロモルの SU5402、1 つのマイクロモル レチノイン酸、および 1 つのマイクロモル平滑化アゴニストを補給します。8 日目と 9 日目に、上清を 25% の KSR 培地と 75% の N2 培地を添加した 5 マイクロモル DAPT、5 マイクロモル SU5402、1 マイクロモル レチノイン酸、および 1 マイクロモル平滑化アゴニストの混合物と交換します。

10 日目と 11 日目に、上清を 5 マイクロモル DAPT、5 マイクロモル SU5402、1 マイクロモル レチノイン酸、および 1 マイクロモル平滑化アゴニストを添加した N2 培地と交換します。12日目に、各ウェルの上清を100マイクロリットルの成熟培地に交換し、ウェルあたり1ミリリットルあたり20ナノグラムの脳由来神経栄養因子を補充します。運動神経オルガノイド形成を誘導するには、PDMSチップのコーティング溶液を150マイクロリットルの成熟培地に交換し、1ミリリットルあたり20ナノグラムの脳由来神経栄養因子を補充し、ワイドボアマイクロピペットチップを使用して、96ウェルプレートの1ウェルから運動ニューロンスフェロイドをチップのマイクロチャネルの入口に穏やかに加えます。

培地の蒸発を防ぐために、ディッシュ内の組織培養チップの近くに滅菌水の小さなリザーバーを置き、ディッシュを摂氏37度および5%二酸化炭素インキュベーターに入れます。2〜3日ごとに、培地リザーバーの中心から使い果たされた培地の半分を、脳由来神経栄養因子のミリリットルあたり20ナノグラムを補充した新鮮な成熟培地と交換します。軸索は運動ニューロンのスフェロイドからチャネルに成長し、2〜3週間の期間で自発的に1つの束に集まり、運動神経オルガノイドを形成します。

運動ニューロンは、3D分化手順で12〜14日以内に分化します。重要なことに、細胞の60%以上が分化中に運動ニューロンマーカーHB9を発現し、運動ニューロンスフェロイドの細胞の約80%がSMI32陽性であることです。マイクロチャネルが物理的なガイドとして機能すると、軸索は運動ニューロンスフェロイドから伸びて、スフェロイドへの導入から24時間以内に軸索-軸索相互作用によって束ねられたものを形成します。

軸索は、次の3〜4日以内にマイクロチャネルの中心に到達し、さらに10日後にマイクロチャネルのもう一方の端まで伸びました。運動神経オルガノイドは、PDMSを顕微鏡ガラスから取り外すことにより、生物学的分析のためにチップから収集できます。その後、軸索束と細胞体を解剖し、サージカルナイフまたはピンセットを使用して顕微鏡で分離できます。

運動神経オルガノイドの軸索束では、樹状突起マーカータンパク質はウェスタンブロッティングでは検出されません。スフェロイドが培養チップ内の底に完全に落下していることを確認することが重要です。部位の調査を示し、底面はチップ内のスフェロイドの位置を決定するのに役立ちます。

単離された軸索束は、さまざまな追加の方法について調べることができます。大量の軸索を取得し、相当な材料を必要とする生化学的アッセイに使用することができます。