Name: 三次元運動神経オルガノイド発生 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: 学ぶ ヒトiPS細胞由来運動神経オルガノイドの作製法。PDMSマイクロ流体チップを用いて軸索束を自発的に形成し、運動ニューロン疾患の薬剤スクリーニングや病態メカニズム解析に応用する革新的な3D培養モデルです。

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本研究は、日本科学振興会(JSPS)の科学研究助成金17H05661および18K19903、コア2コアプログラム、およびビヨンドAI研究所によって支援されました。

<ol><li>Raper, J., Mason, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+strategies+of+axonal+pathfinding%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspective+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular strategies of axonal pathfinding.</a> Cold Spring Harbor Perspective Biology. 2 (9), 001933(2010).</li>
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<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+ALS+with+iPSCs+Reveals+that+Mutant+SOD1+Misregulates+Neurofilament+Balance+in+Motor+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling ALS with iPSCs Reveals that Mutant SOD1 Misregulates Neurofilament Balance in Motor Neurons.</a> Cell Stem Cell. 14 (6), 796-809 (2014).</li>
<li>Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microphysiological+3D+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+%28ALS%29+from+human+iPS-derived+muscle+cells+and+optogenetic+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons.</a> Science Advances. 4 (10), (2018).</li>
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<li>Kawada, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+Motor+Nerve+Organoid+with+Human+Stem+Cell-Derived+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Generation of a Motor Nerve Organoid with Human Stem Cell-Derived Neurons.</a> Stem Cell Reports. 9 (5), 1441-1449 (2017).</li>
<li>Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Pre-Assembled+Plastic+Microfluidic+Chips+for+Compartmentalizing+Primary+Murine+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Use of Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips for Compartmentalizing Primary Murine Neurons.</a> JoVE. (141), e58421(2018).</li>
<li>Paranjape, S. R., Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalization+of+Human+Stem+Cell-Derived+Neurons+within+Pre-Assembled+Plastic+Microfluidic+Chips%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips.</a> JoVE. (147), e59250(2019).</li>
<li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+small-molecule+inhibition+accelerates+developmental+timing+and+converts+human+pluripotent+stem+cells+into+nociceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Combined small-molecule inhibition accelerates developmental timing and converts human pluripotent stem cells into nociceptors.</a> Nature Biotechnology. 30 (7), 715-720 (2012).</li>
<li>Rimington, R. P., Fleming, J. W., Capel, A. J., Wheeler, P. C., Lewis, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+model+of+the+human+motor+unit+with+physiologically+functional+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Bioengineered model of the human motor unit with physiologically functional neuromuscular junctions.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
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<li>Sances, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+ALS+with+motor+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Modeling ALS with motor neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Nature Neurosciences. 19 (4), 542-553 (2016).</li>
<li>Qu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+motor+neuron+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+and+the+function+of+Islet-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High-efficiency motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells and the function of Islet-1.</a> Nature Communications. 5 (1), 3449(2014).</li>
<li>Kirihara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Tissue+Model+of+a+Cerebral+Tract+Connecting+Two+Cortical+Regions%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">A Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Tissue Model of a Cerebral Tract Connecting Two Cortical Regions.</a> iScience. 14, 301-311 (2019).</li>
<li>Rigamonti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-Scale+Production+of+Mature+Neurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+in+a+Three-Dimensional+Suspension+Culture+System%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Large-Scale Production of Mature Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Three-Dimensional Suspension Culture System.</a> Stem Cell Reports. 6 (6), 993-1008 (2016).</li>
<li>Yan, Y., Song, L., Madinya, J., Ma, T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+Cortical+Spheroids+from+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+in+a+Suspension+Bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Derivation of Cortical Spheroids from Human Induced Pluripotent Stem Cells in a Suspension Bioreactor.</a> Tissue Engineering Part A. 24 (5-6), 418-431 (2017).</li>
</ol>

この議定書の一部として、川田二郎が設立したジクサック・バイオエンジニアリング社に特許が認可されている。

このプロトコルは、ヒトiPS細胞から生成された運動ニューロンスフェロイドから伸長した軸索束を有する運動神経オルガノイド(MNO)の形成を記述する。形成された軸索束は厚く、適用範囲が広く、単方向構造でよく整理されている。軸索束を解剖することにより、生化学的分析のために高純度軸索タンパク質およびRNAを十分に得ることができる。ニューロン活性は、カルシウムイメージングを用いた軸索束およびスフェロイドで測定することができる。軸索リセート中の核タンパク質と樹状タンパク質の汚染は、ウェスタンブロッティングでは検出されず、我々の方法が効率的に軸索を細胞体と樹状突起から分離することを実証した。
このプロトコルの利点の1つは、3Dプロトコルで4週間、2Dプロトコルを使用して5-6週間ですべてのプロセスを行うことができる軸索バンドルを装備したMNOの急速な差別化と生成です。これは、通常、胚性幹細胞およびiPS細胞17 からMNに分化するのに3〜4週間かかる他のプロトコルと比較して短く、軸索伸長を得るのにさらに2〜4週間かかる。3D プロトコルは、2D プロトコルと比較して、分化時間が短く、手順が少なく、技術上のリスクが低減されるため、一般的に 2D プロトコルよりも好まれます。マイクロ流体ベースの組織培養チップは、MNSの軸索がマイクロチャネルを通じて他のコンパートメントに向かって伸びるように設計されており、アクソン間のアキソ軸索相互作用と親和性を誘発することによって軸索の束の形成を容易にする。単純な実験的なセットアップのために、ここで説明するすべてのプロトコルは、組織培養チップの操作に精通しているバイオエンジニアだけでなく、マイクロ流体および微細加工技術に精通していない生物学者や神経科学者によっても実行することができます。手順 1 および 2 は、外部ファブリケーション サービスを使用して実行することもできます。
プロトコルを実現するための重要な手順の 1 つに、培養メディアの順次変更があります。分化中の各工程で培養培地を完全に変更し、使用済み培地の因子がMN分化を妨げないようにすることが推奨される。このプロトコルのもう一つの重要なポイントは、未分化iPS細胞を良好な品質で維持することです。初期iPS細胞培養の品質は、運動ニューロンおよびMNOを得るための効率に大きく影響する。もう1つのポイントは、MNSの直径がチップの穴のサイズ(1.5mm)よりも小さくなるべきであるということです。より大きな回転楕円体はチャンバーに入ることができず、中央部に重度の低酸素壊死を経験する可能性がある。MNSのサイズは、iPS細胞の初期シード数(3Dプロトコル)または運動ニューロン(2Dプロトコル)を変更することで制御できます。細胞の播種密度は、各iPS細胞株に合わせて最適化する必要があります。
マイクログルーブと小さな細孔フィルターを備えた区画化されたマイクロ流体デバイスは、軸索を細胞体および樹状突起から分離するために広く使用されてきました。この技術はまた、細胞体および樹状突起から軸索を分離することができ、束ねられた組織の軸索の優れた豊富さ。他の方法と比較して、この方法の1つの大きな制限は、2つの異なる培地を必要とする2つの異なる細胞の共培養能力を妨げる組織培養チップの現在の設計において2つの異なる培養培地を分離できないことである。もう一つの制限は、PDMSチップが組織のサイズに所定の制限を置くということである。穴より大きい回転楕円体はチャンバに入ることができず、軸索束はマイクロ流体チャネルの幅よりも厚く成長することができません。
この方法は、他のタイプのニューロンに適用することができます。我々のグループは、大脳オルガノイド技術18と組み合わせた修飾法を用いて大脳管をモデル化する能力を示した。コルチカルスフェロイドは両方のコンパートメントに導入され、軸索は各スフェロイドに向かって往復的に伸び、その後自発的に形成された軸索束である。その結果、2つの皮質スフェロイドを軸索束を介して接続することができ、組織を一片として得ることができる。これは、このアプローチが神経細胞タイプに関係なく軸索束組織を形成する汎用性が高いということを示している。このプロトコルでは、ヒトiPS細胞を用いたが、ヒトES細胞およびヒト神経幹細胞を含む他の幹細胞は、提示されたプロトコルに対する改変とともに使用され得る。ニューロンの3Dスフェロイドは、多様なプロトコル19、20によって生成することができる。軸索束を用いて組織を作るこの方法は、将来的に3D MNスフェロイドを作るための他の分化プロトコルと組み合わせることができる。さらに、軸索バンドルの厚さと長さは、将来の発展のために組織培養チップのマイクロチャネルの幅と高さを単に変更することによって制御することができます。
このプロトコルは、薬物検査やスクリーニングに使用でき、軸索の発達と疾患の根底にあるメカニズムの理解に貢献できると考えています。

脊髄運動ニューロン(MN)は、体の動きを制御するために骨格筋に軸索を拡張します。彼らの軸索軌道は、発達過程において高度に組織化され、規制されている。軸索拡張とガイダンス1に関する多くの研究にもかかわらず、組織化された軸索束形成のためのメカニズムはまだ調査中である。運動ニューロンの軸索は筋萎縮性側索硬化症(ALS)2などの神経変性疾患によって損傷を受けることが多いが、軸膜の損傷の病態生理学的メカニズムは十分に理解されていない。したがって、軸索束の形成と回帰を再現する生理学的および病理学的モデルが現場で必要とされている。
ヒト幹細胞由来運動ニューロンは、ALS 3などの発症や疾患を理解するための有望なプラットフォームである。ヒト誘導多能性幹細胞(iPS細胞)は、患者由来細胞を用いた疾患のモデル化に使用できる。現在までに、多能性幹細胞からMNへの種々の分化方法が4,5,6に報告されている。しかしながら、二次元培養におけるニューロンの軸索はランダムに配向しており、緻密なアキソ軸索相互作用を介して一方向に組み立てられる神経の中で生体内微小環境を再現しない。この問題を克服するために、ヒトiPS細胞8から運動神経に似た三次元組織を生成する技術を開発し、その組織を運動神経オルガノイド(MNO)と名付けました。MNOは、運動ニューロンスフェロイド(MNS)に位置する細胞体と、スフェロイドから伸びた軸索の魅惑から構成されています。ファシクルの軸索は一方向に向き、運動神経の発達における軸索に似ている。したがって、MNは独特に生理学的軸索微小環境を提供し、これは他の以前に開発された神経培養法では行われなかった。
本プロトコルでは、開発されたチップにおける組織培養チップの製造方法、急速運動ニューロン分化、運動神経オルガノイド形成の方法について述べている。当社の組織培養チップは非常にシンプルで、スフェロイドを受け入れるためのコンパートメント、軸索束を形成するためのマイクロチャネル、およびハウジング軸索端子用のコンパートメントのみが含まれています。デバイスには、サイズ9,10で軸索と細胞体を分離するためによく使用されるマイクログルーブやマイクロポアフィルタを含む複雑な構造は含まれていません。したがって、フォトリソグラフィのセットアップが利用可能な場合、このプロトコルで説明されている手順に従うことによって、当社のデバイスを簡単に製造することができます。
ヒトiPS細胞の急速な分化は、誘導およびパターン化因子(SB431542、LDN-193189、レチノイン酸(RA)、および平滑化アゴニスト(SAG))および加速因子(SU5402およびDAPT)の最適化された組み合わせで達成される。SU5402とDAPTの組み合わせにより、末梢ニューロンと神経堤細胞11の分化が加速することが報告されている。このプロトコルでは、MMOを生成する3つの異なる方法を提供し、読者が自分のニーズに最も適した方法を決定できるようにします。分化したMNSは組織培養チップに直接移すことができるため、スフェロイド(3D法)を形成した後にヒトiPS細胞の分化を行うことを推奨します。あるいは、ヒトiPS細胞は、単層(2D)培養において運動ニューロンに分化され、その後、我々が先に報告した8のように三次元運動ニューロン回転楕円体に作り出すことができる。プロトコルを更新し、このプロトコルで説明した三次元分化法により、2Dから3Dへの移行を回避し、MMOは解離ステップなしでより短い分化時間、より少ないステップ、および技術的リスクの低減で得ることができる。市販のニューロンは、分化のための時間を短縮するためにMNSを生成するために使用することもできる。
MNOを生成するために、組織培養チップでMNSを培養した。軸索は回転楕円体から伸び、軸索が集まって一方向に整列するマイクロチャネルに伸びる。これは、このプロトコルによって独自に達成されるマイクロチャネルにおける軸索の緊密に組み立てられた単一方向バンドル組織のアキソ軸索相互作用および自発的な形成を促進するが、自発的な束形成または導かれた軸索方向は、他のプロトコル12、13、14によって単独で達成することができる。典型的な実験では、少数の細胞がスフェロイドからマイクロチャネルに移行し、ほとんどの細胞は近くのスフェロイドにとどまります。この方法により、軸索をサイズ依存の物理的障壁(マイクログルーブやマイクロポアフィルタなど)を使用せずに、軸索を回転楕円体から自発的に分離して、軸索を細胞体から分離することができます。
結果として得られるMNOは形態学的、生化学的および物理的な分析を含むさまざまな検査を受けることができる。細胞体と拡張軸索束は切断によって物理的に単離することができ、下流の実験、例えば生化学的アッセイのために別々に分析することができる。RNAやタンパク質を含む生物学的材料は、RT-PCRおよびウェスタンブロッティングを含む通常の生化学的アッセイのためのほんの数個の軸索束から単離することができる。ここでは、軸索の発達と疾患のメカニズムを研究するための魅力的な生理学的および病理学的モデルを提供するiPS細胞から運動神経オルガノイドを生成するためのプロトコルについて述べる。

<table><tbody><tr><td>(トリデカフルオロ-1,1,2,2-テトラヒドロオクチル)-1-トリクロロシラン</td><td>Sigma</td><td>440302</td><td></td></tr><tr><td>16% パラホルムアルデヒド(ホルムアルデヒド)水溶液</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>200&micro;l ワイドボアピペットチップ</td><td>BMBio</td><td>BMT-200WRS</td><td></td></tr><tr><td>6ウェルプレート</td><td>ビオラモ</td><td>2-8588-01</td><td></td></tr><tr><td>アキュターゼ</td><td>ICT</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>B-27 サプリメント (50X)</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td></td><td>Sigma A6003</td><td></td></tr><tr><td>脳由来神経栄養因子 (BDNF)</td><td>和光</td><td>020-12913</td><td></td></tr><tr><td>CO2インキュベーター</td><td>パナソニック</td><td>MCO-18AIC</td><td></td></tr><tr><td>クライオスター CS10</td><td>幹細胞技術</td><td>07959</td><td></td></tr><tr><td>DAPT</td><td>シグマ</td><td>D5942</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>シグマ</td><td>D8437</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>同人堂研究所</td><td>CS22</td><td></td></tr><tr><td>グルタマックス</td>サプリメント <td>ギブコ</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>成長因子減少マトリゲル(基底膜マトリックス)</td><td>コーニング</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>HB9 抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-22542</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>和光</td><td>085-09355</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma</td><td>14533</td><td></td></tr><tr><td>iCell motor neuron (市販のヒトiPS細胞由来運動ニューロン)</td><td>Cellular Dynamics</td><td>R1051</td><td></td></tr><tr><td>イソプロピルアルコール(IPA)</td><td>和光</td><td>166-04836</td><td></td></tr><tr><td>ノックアウト血清補充</td><td>Gibco</td><td>10828028 LDN193189</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>SML0559</td><td></td></tr><tr><td>MEAプローブ</td><td>Alpha MED Scientific</td><td>inc MED-P5004A</td><td></td></tr><tr><td>MEM 非必須アミノ酸溶液(100x) (NEAA)</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡ガラス</td><td>松波</td><td>S9111</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR Plus</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>05825</td><td></td></tr><tr><td>N2 supplement</td><td>Wako</td><td>141-08941</td><td></td></tr><tr><td>神経基礎培地</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>フォトレジスト SU-8 2100</td><td>Microchem</td> <td>#SU-8 2100</td><td></td></tr><tr><td>プライム 表面 96U</td><td>住友ベークライト</td><td>MS-9096U</td><td></td></tr><tr><td>ReLeSR(継代試薬)</td><td>幹細胞テクノロジー</td><td>05872</td><td></td></tr><tr><td>レチノイン酸</td><td>和光</td><td>186-01114</td><td></td></tr><tr><td>SAG</td><td>シグマ</td><td>SML1314</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>和光</td><td>192-16541</td><td></td></tr><tr><td>シリコンウエハー</td><td>SUMCO</td><td>PW-100-100</td><td></td></tr><tr><td>シルポット184 cキット付</td><td>ダウ東レ</td><td>シルポット 184 w/c キット</td><td></td></tr><tr><td>Smi32 抗体</td><td>バイオレジェンド</td><td>801701</td><td></td></tr><tr><td>SU5402</td><td>シグマ</td><td>SML0443</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 現像液</td><td>Microchem</td><td>Y020100</td><td></td></tr><tr><td>Synapsin I 抗体</td><td>ミリポア</td><td>Ab1543</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express 液体 フェノールレッド (解離液)</td><td>Gibco</td><td>12604-021</td><td></td></tr><tr><td>Tuj1</td>抗体<td>バイオレジェンド</td><td>801202</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>和光</td><td>030-24021</td><td></td></tr></tbody></table>

三次元運動神経オルガノイド発生

Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation

軸索の魅力は、神経系で観察される主要な構造モチーフの一つです。軸索のファシクルの破壊は、発達および神経変性疾患を引き起こす可能性があります。軸索の研究は数多く行われてきましたが、軸索の形成と機能不全の理解は、堅牢な3次元インビトロモデルの欠如のために依然として限られています。ここでは、マイクロ流体ベースの組織培養チップにおけるヒト人工多能性幹細胞(iPS)細胞からの運動神経オルガノイド(MNO)の迅速な生成のためのステップバイステッププロトコルについて説明する。まず、この方法に用いるチップの製造について説明する。ヒトiPS細胞から、運動ニューロンスフェロイド(MNS)が形成される。次に、差別化されたMNSがチップに転送されます。その後、軸索は自発的にスフェロイドから成長し、チップに装備されたマイクロチャネル内の魅惑的に組み立てられ、スフェロイドから伸びる軸索の束を運ぶMNO組織を生成する。下流の分析のために、MMOは、形態学的分析のために固定されるか、生化学的分析のために解剖されるチップから取り出すことができるだけでなく、カルシウムイメージングおよび多電極アレイの記録。このプロトコルで生成されたMNは、薬物検査とスクリーニングを容易にし、軸索のファシクルの発症および疾患の根底にあるメカニズムの理解に貢献することができます。

運動ニューロンは、3D分化手順で12〜14日以内に分化した(図4および図5)。重要なことに、細胞の60%以上が分化中に運動ニューロンマーカーHB9を発現した。免疫細胞化学は、MNSの細胞の約80%がSMI32陽性運動ニューロンであることを明らかにした。HB9およびSMI32は、確立された初期段階の運動ニューロンマーカー15、16である。HB9およびSMI32の発現は、運動ニューロンの細胞の同一性を確保するために確認する必要がある重要なパラメータである。MNSを培養チップに導入した後、軸索はチャネルに伸び、軸索束が形成されます。物理ガイドとして機能するマイクロチャネルにより、軸索はMNSから伸び、アキソ軸索相互作用によってバンドルを形成する(図6A)。MNOの生成を確認するために顕微鏡観察によって軸索束の形成を確認することが不可欠である。成功したMNOは、50 μmより広い軸索バンドルを、チャネル内のバンドルから少数の孤立した軸索を負担します。軸索の初期伸びは、スフェロイドの導入後24時間で観察することができる。次の3〜4日以内に、軸索はマイクロチャネルの中心に達し、さらに10日以内にもう一方の端まで到達する(図6A)。その結果、軸索は、2〜3週間で一方向のまっすぐな束を組み立てて形成し、その後神経活動が観察された。
運動神経オルガノイドは、生体解析のために顕微鏡ガラスからPDMSを取り外すことによってチップから収集することができる(図6B)。軸索束および細胞体は、顕微鏡下で外科用ナイフまたはツイーザーを用いて切断することによって解剖および単離することができる(図6B)。RNAやタンパク質を含むこれらの生物学的材料は、RT-PCRおよびウェスタンブロッティングなどの通常の生化学的アッセイに使用することができます。MNの軸索束では、核または樹状のメーカーのタンパク質はウェスタンブロッティングでは検出されない(図6C)。
カルシウムインジケーター(Fluo-4 AM)と組み合わせて、神経細胞活性を組織培養チップに捕捉することができる。MNO内では、回転楕円体および軸索束中の運動ニューロンの自発的な活動が観察された。また、多電極アレイシステムを用いて神経活動を観察した。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig01.jpg"> 図1:PDMS組織培養チップの寸法。 (A)組織培養チップのフォトマスク。(B)組織培養チップ中のマイクロチャネルの寸法。運動ニューロンスフェロイドを保持するためのベースチャンバーの直径は2mmであり、チャンバー上のPDMSの穴は1.5mmである。マイクロチャネルブリッジ2室の幅と高さは、どちらも150 μmです。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig02.jpg"> 図2:運動ニューロン分化の模式図。 (A)分化ステップには、神経誘導、運動ニューロン系統へのパターニング、および運動ニューロンの成熟が含まれる。(B) iPS細胞から運動ニューロンスフェロイド(MNS)を作成する2つのオプション:3Dプロトコルと、運動ニューロンの解離ステップを持つ2Dプロトコル。運動神経オルガノイド(MNO)は、両方のプロトコルによって得ることができる。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig03.jpg"> 図3:基体膜マトリックスコーティングと運動ニューロン回転楕円体導入のためのステップバイステッププロトコル。 (A)組織培養チップのチャネルにおける基質膜マトリックスコーティング。(B)チップの穴に MNS を導入します。(C)培地を吸引して培地を吸引して培地を変化する。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig04.jpg"> 図4:2Dおよび3D運動ニューロン分化。 (A)代表的な3D MNS分化(3Dプロトコル)の時間経過。MNSのサイズは徐々に増加した。スケールバー:500 μm。(B) -D2、D0、D1、D6、D12 (2D プロトコル) での 2D 分化の時間経過。スケールバー:500 μm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig05.jpg"> 図5:運動ニューロンの特性 (A)(左) SMI-32抗体とDAPIで染色されたMNSのクライオセクション。(中央)基部膜マトリックスコーティングされた表面上の再めっきされたMNSの位相コントラスト画像。軸索伸びが認められた。(右)シナプシンIおよびTuj1抗体で染色された再めっきMNSの軸索。スケールバー:500μm(左と中央)と50μm(右)。(B)TujおよびHB9抗体で免疫染色された2D運動ニューロンの代表的な画像。スケールバー:200 μm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig05large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig06.jpg"> 図6:培養チップで発生する運動神経オルガノイド(MNO)の特性評価。 (A)D32上の軸索伸長と厚い軸索束形成の代表的な画像。スケールバー:500 μm。(B) SMI-32及びDAPIによる運動神経オルガノイド(MNO)の免疫染色軸索および細胞体は物理的に切断することによって隔離することができる。スケールバー:1mm(C)ウェスタンブロッティングによって定量された軸索および細胞体からのタンパク質の純度。樹状マーカーであるMAP2は軸索タンパク質では検出されなかったのに対し、軸索マーカーTau1は軸索タンパク質中に富化した。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig06large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

このプロトコルは、組織培養チップ内のスフェロイドから伸びる強い軸索束の自発的な組み立てを通じて、ヒトiPS細胞由来運動神経オルガノイドを作製するための包括的な手順を提供する。

A fascicle of axons is one of the major structural motifs observed in the nervous system. Disruption of axon fascicles could cause developmental and ...

このプロトコールは、体外のヒトiPS細胞に由来する運動神経オルガノイドを用いて、軸索束の発生や疾患の根底にあるメカニズムの解明を容易にします。神経細胞のスフェロイドとカスタムメイドのマイクロカルチャーチップを培養するだけで、一方向軸索束を自発的に生成し、さまざまな下流実験に利用することができます。運動神経オルガノイドは、以前のin vitroシステムであったより生理学的モデルを提供することにより、LSを含む運動ニューロン疾患の薬物のスクリーニングと試験を容易にすることができます。ドラフトで、適切なPPEを着用し、3ミリリットルのSU-8 2100をアセトン洗浄されたシリコンウェーハに分注し、ウェーハをスピンコーターの中央に置きます。ウェーハを真空で固定し、ウェーハを毎分500回転で10秒間回転させて、ウェーハ表面全体にSU-8を均一にコーティングし、次にウェーハを毎分1,500回転で30秒間回転させ、毎秒300回転の加速でウェーハを回転させて、ウェーハ上に150ミクロンの厚さのフォトレジスト層を得る。ソフトベーキング後、フォトマスクをマスクアライナーにセットし、ウェーハを紫外線に60秒間さらします。ホットプレート上でベーキングした後、オービタルシェーカーで攪拌しながらフォトレジスト現像液で10〜20分間現像し、途中で現像液を一度交換します。チップの最下層を組織培養用に調製するには、新たに調製したPDMSをウェーハに所望の厚さまで注ぎ、真空チャンバー内で混合物を脱気します。PDMSをオーブンで60°Cで少なくとも3時間硬化させます。冷却後、ブレードを使用して硬化したPDMSをウェーハから切断し、ベーキングを施した未硬化のPDMSを使用して培地リザーバーをPDMS最下層に接着し、組み立てられたPDMS組織培養チップを取得します。運動神経オルガノイド形成のためのPDMSチップを調製するには、チップと76×52ミリメートルの顕微鏡ガラスを70%エタノールを含むペトリ皿で少なくとも1時間滅菌します。インキュベーションの最後に、チップを湿った顕微鏡ガラスに置きます。一晩乾燥させた後、チップはガラスに付着するはずです。DMEM/F12 の希釈した基底膜マトリックスの 30 マイクロリットルの液滴をチャネルの入口の片側に置き、入口の反対側から溶液を吸引して、マイクロチャネルの表面をマトリックスでコーティングします。次に、PDMSチップとコーティング溶液をペトリ皿で室温で1時間インキュベートします。3D iPS細胞の運動ニューロンへの分化を誘導するには、100マイクロリットルのフィーダーと無血清細胞培養培地に10マイクロモルのY-27632を添加した96ウェルU底プレートの適切な数のウェルに、ウェルごとに10〜4のiPS細胞を播種します。翌日、各ウェルの上清を、10マイクロモルのSB431542と100ナノモルのLDN-193189を補充した100マイクロリットルのKSR培地と交換します。2日目と3日目に、上清を100マイクロリットルのKSR培地に交換し、10マイクロモルのSB431542、100ナノモルのLDN-193189、5マイクロモルのDAPT、5マイクロモルのSU5402、1つのマイクロモルのレチノイン酸、および1つのマイクロモル平滑化アゴニストを補充します。4 日目と 5 日目に、上清を 75% の KSR 培地と 25% の N2 培地の混合物に 10 マイクロモルの 10 マイクロモル SB431542、100 ナノモルの LDN193189、5 マイクロモルの DAPT、5 マイクロモルの SU5402、1 つのマイクロモル レチノイン酸、および 1 つのマイクロモル平滑化アゴニストを補給します。6 日目と 7 日目に、上清を 50% の KSR 培地と 50% の N2 培地の混合物に交換し、5 マイクロモルの DAPT、5 マイクロモルの SU5402、1 つのマイクロモル レチノイン酸、および 1 つのマイクロモル平滑化アゴニストを補給します。8 日目と 9 日目に、上清を 25% の KSR 培地と 75% の N2 培地を添加した 5 マイクロモル DAPT、5 マイクロモル SU5402、1 マイクロモル レチノイン酸、および 1 マイクロモル平滑化アゴニストの混合物と交換します。10 日目と 11 日目に、上清を 5 マイクロモル DAPT、5 マイクロモル SU5402、1 マイクロモル レチノイン酸、および 1 マイクロモル平滑化アゴニストを添加した N2 培地と交換します。12日目に、各ウェルの上清を100マイクロリットルの成熟培地に交換し、ウェルあたり1ミリリットルあたり20ナノグラムの脳由来神経栄養因子を補充します。運動神経オルガノイド形成を誘導するには、PDMSチップのコーティング溶液を150マイクロリットルの成熟培地に交換し、1ミリリットルあたり20ナノグラムの脳由来神経栄養因子を補充し、ワイドボアマイクロピペットチップを使用して、96ウェルプレートの1ウェルから運動ニューロンスフェロイドをチップのマイクロチャネルの入口に穏やかに加えます。培地の蒸発を防ぐために、ディッシュ内の組織培養チップの近くに滅菌水の小さなリザーバーを置き、ディッシュを摂氏37度および5%二酸化炭素インキュベーターに入れます。2〜3日ごとに、培地リザーバーの中心から使い果たされた培地の半分を、脳由来神経栄養因子のミリリットルあたり20ナノグラムを補充した新鮮な成熟培地と交換します。軸索は運動ニューロンのスフェロイドからチャネルに成長し、2〜3週間の期間で自発的に1つの束に集まり、運動神経オルガノイドを形成します。運動ニューロンは、3D分化手順で12〜14日以内に分化します。重要なことに、細胞の60%以上が分化中に運動ニューロンマーカーHB9を発現し、運動ニューロンスフェロイドの細胞の約80%がSMI32陽性であることです。マイクロチャネルが物理的なガイドとして機能すると、軸索は運動ニューロンスフェロイドから伸びて、スフェロイドへの導入から24時間以内に軸索-軸索相互作用によって束ねられたものを形成します。軸索は、次の3〜4日以内にマイクロチャネルの中心に到達し、さらに10日後にマイクロチャネルのもう一方の端まで伸びました。運動神経オルガノイドは、PDMSを顕微鏡ガラスから取り外すことにより、生物学的分析のためにチップから収集できます。その後、軸索束と細胞体を解剖し、サージカルナイフまたはピンセットを使用して顕微鏡で分離できます。運動神経オルガノイドの軸索束では、樹状突起マーカータンパク質はウェスタンブロッティングでは検出されません。スフェロイドが培養チップ内の底に完全に落下していることを確認することが重要です。部位の調査を示し、底面はチップ内のスフェロイドの位置を決定するのに役立ちます。単離された軸索束は、さまざまな追加の方法について調べることができます。大量の軸索を取得し、相当な材料を必要とする生化学的アッセイに使用することができます。

three-dimensional-motor-nerve-organoid-generation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

マイクロ流体デバイスを使用して神経筋接合部の形成を実演しています。神経前駆細胞と筋前駆細胞は、デバイス内の異なるウェルに播種され、それぞれ運動ニューロンと筋管に成熟するまで放置されます。体積と化学的勾配の生成は、活動的な神経筋接合部の発達につながります。...

マイクロ流体デバイスを用いた神経筋接合部の生成

このビデオでは、まずヒトが誘導した多能性幹細胞を特殊な培地で培養してスフェロイドを形成し、次に特定の阻害剤を用いて運動ニューロンに分化させ、最後にマイクロ流体チップで培養して軸索を延長し、運動神経オルガノイドを形成するという運動神経オルガノイドの作り方を実演しています。...

マイクロ流体チップを用いたヒトiPS細胞由来運動神経オルガノイドの開発

このビデオは、パーキンソン病を研究するためのモデルを提供するために、ヒト胚性幹細胞(hESC)のドーパミン作動性ニューロンへの分化を示しています。hESCは、マイクロウェルプレート内の神経誘導培地で培養され、3Dニューロスフェアが形成されます。次に、これらを神経誘導培地で培養して、ドーパミン作動性前駆ニューロンへの分化を促進します。ニューロンの最終的な成熟は、気液界面条件下で培養インサートで起こり、成熟したドーパミン作動性ニューロンからなる3Dオルガノイドが得られます。...

ヒト胚性幹細胞からのドーパミン作動性ニューロンオルガノイドの作製

本研究では、ヒトの神経オルガノイド内のヒト神経オルガノイド内のヒト神経膠芽腫の発達を研究するための関連的かつ正確なモデルとして、2つの特定のヒト神経オルガノイドを導出するプロトコルを紹介し、説明する。三次元オルガノイドを生成する分化。...

脳癌と神経変性疾患を研究するためのヒト神経オルガノイド

ヒトが誘導した多能性幹細胞由来の運動ニューロンを、機能的に活性な神経筋接合の形成をもたらすヒトの一次メソアンジオ芽細胞由来筋膜と共培養することにより、市販の微小流体デバイスにおけるヒト運動ユニットを生成する方法を説明する。...

マイクロ流体デバイスにおける機能性神経筋接合を有するヒト運動ユニットの生成

ここでは、ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)から脳オルガノイドを生成するためのプロトコルについて説明する。脳オルガノイドを大量に、高品質で得るために、自家製ミニバイオリアクターを使用しています。...

自家製ミニバイオリアクターにおける人工多能性幹細胞からの脳オルガノイド発生

本研究では、標準的なフィーダーフリーhPSC培養を用いた、シンプルでありながら堅牢な皮質オルガノイド培養システムのための詳細な技術を提供する。これは、...

インビトロでの脳ニューロン老化のモデリングのための皮質脳オルガノイドの堅牢で再現性の高い生成

末梢神経系（PNS）は、損傷後の大幅な修理が可能ですが、少しは、この現象を支配する細胞および分子メカニズムについてはほとんど知られていない。ライブ、トランスジェニックゼブラフィッシュと再現神経切断アッセイを使用して、我々は、神経変性と再生の間ダイナミックグリア細胞の挙動を学ぶことができます。...

モーター神経切断とライブゼブラフィッシュにおけるグリア細胞の挙動のタイムラプスイメージング

中枢神経系の星状細胞は、有害な刺激に反応して機能的および構造的特性を変化させます。このレポートは、疾患状態または治療介入後の三次元アストロサイトの形態を評価するためのプロトコルを示しています。...

アストロサイトの三次元共焦点形態学的分析のためのプロトコル

このプロトコルは、神経固有のミトコンドリアを定量化を視覚化して三次元 (3 D) 画像処理・解析技術を使用します。テクニックは別の蛍光信号からデータのサブセットを分離する 1...

三次元画像と人間の表皮内神経線維内のミトコンドリアの解析

学ぶ ヒトiPS細胞由来運動神経オルガノイドの作製法。PDMSマイクロ流体チップを用いて軸索束を自発的に形成し、運動ニューロン疾患の薬剤スクリーニングや病態メカニズム解析に応用する革新的な3D培養モデルです。

三次元運動神経オルガノイド発生

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