Name: 単一細胞レベルでの形状依存性転写論の研究方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: 学ぼう、単一細胞レベルで心筋細胞の形態に基づく分選と遺伝子発現解析の手法。マイクロパターン化チップと自動マイクロキャピラリーシステムを用いて、心不全治療薬のスクリーニングを効率的に行う革新的なプラットフォームです。

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動物に関するすべての手順は、カロリンスカ研究所、ストックホルム、スウェーデンの動物倫理委員会の規制に従っていました。
1. マイクロパターンチップレイアウト
<ol><li>カスタム設計のチップ(材料表)(図1A):活性マイクロパターンを有する19.5mm x 19.5mmのカバースリップを、ホウケイ酸ガラスにフォトリソグラフィーで印刷した。 注: これらのマイクロパターンは、サイトフォビック領域で囲まれています。したがって、シードされたセルは、これらのマイクロパターンの1つにしか付着して成長できず、そのマイクロパターンのARを捕捉することができます。チップは3つのゾーンに分けられ、各ゾーンは特定のARを持つマイクロパターンで構成されています。チップのレイアウトを図 1Bに示します。定義された AR のジオメトリは 、表 1に示されています。フィブロネクチンマイクロパターンの異なる形状の拡大蛍光画像は、 図1Bの下の画像に示されている。</li>
</ol>2. マイクロパターン化されたチップをコーティングする
<ol><li>80 μgのフィブロネクチンをリン酸緩衝生理食塩水の 2 mL に加えて、各チップに 2x コーティングタンパク質溶液を調製します (PBS-/-)。</li>
	<li>チップを35mmグライナーペトリ皿に移し、すぐに2 mLのPBSを追加します。その後、2xコーティングタンパク質溶液の2mLを加えます。</li>
	<li>チップを室温で2時間インキュベートします。</li>
	<li>PBS-/-で連続した希釈工程でコーティング液を洗浄します。チップ表面は常に濡れているはずです。次いで、2mLのめっき培地に置換し、細胞を播種するまで37°Cでインキュベートする。</li>
</ol>3. CM の分離
<ol><li>DMEM:M199(4:1)を10%の馬血清、4%のウシ血清、2%HEPES(1 M)および1%ペニシリン/ストレプトマイシン(10,000 U/mL)22で補ってメッキ培地を調製する。</li>
	<li>2日前齢の新生児ラットの心臓の左心室から組織を解剖し、PBSを含む10cmの皿に移す。約1mm3 個に組織を切断します。</li>
	<li>収穫した組織をローターキャップチューブに移し、組織解離用キャップにローターを装着(材料表)。組織を落ち着かせ、上清を慎重に取り除きます。</li>
	<li>Cチューブに、新生児心臓解離キット(材料表)を使用して調製した酵素ミックス1と2の混合物の2.5 mLを加え、キャップをしっかりと閉じます。</li>
	<li>ローターキャップチューブを、ヒーター(図2AとB)を装備した解離器のスリーブに挿入します(材料表)。インキュベーション プログラムを実行37C_mr_NHDK_1 (図 2C)を実行します。</li>
	<li>インキュベーションプログラムが実行されている間、PBS、pH 7.2で2 mM EDTAおよび0.5%のウシ血清アルブミン(BSA)を含むPEBバッファーを調製し、4°Cに保ちます。</li>
	<li>インキュベーションプログラム終了後、ローターキャップチューブ(図2D)を取り外し、7.5mLのプレウォームメッキ媒体を追加します。</li>
	<li>サンプルを再中断し、70 μmのストレーナーを使用して細胞懸濁液をフィルター処理します。</li>
	<li>ストレーナーを別の3mLのメッキ媒体で洗います。</li>
	<li>600 x g で細胞懸濁液を5分間遠心分離する。上清を完全に吸引する。</li>
	<li>60 μLのコールド PEB バッファーに細胞ペレットを再懸濁します。</li>
	<li>非CMを対象とするミクロンサイズのビーズを含む新生児心筋細胞分離カクテル(材料表)を20μL追加します。</li>
	<li>20 μL の抗赤血球ビーズを加える(材料表)。</li>
	<li>懸濁液を混ぜ、4°Cで15分間インキュベートします。</li>
	<li>400 μL の PEB バッファを追加します。</li>
	<li>セル懸濁液をLDカラム(材料表)に塗布し、マグネットスタンドに垂直に挿入し、PEBバッファーでよく洗浄します。</li>
	<li>ラベルのない細胞を収集し、PEBバッファーの0.5 mLでカラムを洗浄します。</li>
	<li>8 mLのメッキ培地を加え、細胞懸濁液を75cm2 の未コーティング培養フラスコに移し、37°Cで1.5時間インキュベートする。残りの非CMは非コーティングされた細胞培養に付着し始め、細胞懸濁液はCM集団によって濃縮される。</li>
</ol>4. CM のパターン化
注: 1 つの CM と 1:1、7:1、または 11:1 の AR を比較しました。これは、1:1、7:1または11:1の定義されたARsを備えたフィブロネクチンコーティングされたマイクロパターンで満たされた特別に設計されたチップに分離された新生児ラットCMを播種することによって行われます。マイクロパターンをフィブロネクチンによってコーティングし、サイトフォビック表面で囲んだ。したがって、CMはフィブロネクチン基板上で成長させることによって、マイクロパターンの定義されたARを取り付け、広げ、捕獲します。次の手順に従って、分離された CM をパターン化します。
<ol><li>細胞懸濁液を15mLチューブに移し、適切なめっき培地を添加して細胞を1mL当たり10万細胞の濃度まで希釈して数えた。</li>
	<li>35mmグライナーペトリ皿の中に2mLの温かいめっき媒体に既に沈められているチップに2mLの細胞懸濁液を加えます。</li>
	<li>37°Cで5%CO2で皿をインキュベートし、CMをフィブロネクチンコーティングされたマイクロパターンに取り付け、各CMがその基板マイクロパターンのARを取得できるようにします。</li>
	<li>18時間後、チップを確認します。ほとんどの細胞が結合している場合は、パターン化された細胞に付着した破片および死んだ細胞を取り外して取り除きます。これを行うには、めっき媒体を取り除き、PBS-/- ドロップワイズを穏やかに加え、チップの中心から側面に向かって移動します。2回繰り返します。</li>
	<li>DMEM:M199(4:1)に4%の馬の血清、4%のウシ血清、2%HEPES(1 M)および1%ペニシリン/ストレプトマイシン(10,000 U/mL)を補充することによって、新鮮な維持培地でPBSを吸引する。</li>
</ol>5. 付着 CD のピッキング
注: 72 時間の培養期間の後、パターン化された単一の CM は、半自動化されたセル ピッカー (表オブ マテリアル) を使用してフィブロネクチンマイクロパターンから選択されます (図 3)。セルピッカーは、ソフトウェア23 を使用して電動ステージを制御します(図3A)。70 μmのガラスマイクロキャピラリー(図3B)を使用して、パターン化された新生児ラットCMを選んで注入します。細胞ピッカーは、真空を発生させ、圧力を加えることによって細胞を注入することによって、接着細胞をソートする。シリンジ番号1の真空は、シリンジポンプを使用してシリンジを引っ張ることによって適用される(図3C)。静水圧は重力に基づいており、顕微鏡デスクの上に87cmの距離に注射器番号2を置くことによって誘導されます。シリンジ1および2は、それぞれPTFEチューブを介して接続され、制御ユニットに埋め込まれているバルブ1と2に接続されている(図3D)。PTFE管はRNase自由水で完全に満ちている。次いで、選んだ単一細胞をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)チューブに注入し、3.55μLのリシスバッファーを含む。
<ol><li>72時間の培養期間の後、古い媒体を取り除き、チップ表面を温かいDPBS-/-で静かに洗い流します。<ol>
<li>皿を平らに保ち、皿の片側から1000 μLのピペットで古い媒体を優しく吸引します。チップが常に濡れたままであることを確認してください。</li>
		<li>2 mLのDPBSを追加 -/- 穏やかに、パターン化された細胞に取り付けられている死んだ細胞のほとんどをドロップワイズで取り外し、チップの中心からその側面に移動します。</li>
		<li>DPBSの大部分を吸引して、切り離された浮遊細胞をできるだけ多く取り除き、チップの中心から始めて側面に移動する。</li>
		<li>ステップ 5.1.2 と 5.1.3 をもう一度繰り返します。</li>
	</ol></li>
	<li>チップの端をつかむために斜め鉗子を使用し、すぐに新しい滅菌35ミリメートルグライナーペトリ皿に移して、選んでいる間に浮遊細胞の数を減らします。</li>
	<li>すぐに1.5 mLのDPBS-/- を加え、チップが乾燥しないようにします。</li>
	<li>1.5 μLの鮮やかな色素サイクルグリーンを加えて、生細胞の核を可視化します。</li>
	<li>鉗子の先端を使用して、グライナーペトリ皿の中央にチップを置きます。</li>
	<li>チップの上にチャンバー(材料のテーブル)を置きます。チャンバーは、細胞パターンへのアクセスをブロックすることなく、皿の底にチップを固定します。</li>
	<li>グライナーペトリ皿をセルピッカーステージの皿ホルダーに取り付け、マグネットキャップを挿入します。</li>
	<li>自動注入を調整します。<ol>
<li>ライブビューウィンドウの画像の中央にある電動ステージに刻まれた十字線を探します。</li>
		<li>十字線に焦点を合わせ、[スキャンと並べ替え] ウィンドウで[自動注入用の調整] ボタンを選択します。</li>
	</ol></li>
	<li>DPBS-/- を DPBS/トリプシンの 1.5 mL に置き換えて-/- (1:1) 皿がステージ上にある間に、フィブロネクチンから細胞を緩めて、液体真空を使用して細胞を選ぶことができます。</li>
	<li>[スキャンと並べ替え] ウィンドウの [スキャン] タブを使用して、チップ全体をスキャンします。視野内のチップの左上隅を見つけ、左上隅の列の現在の顕微鏡の位置をクリックします。<ol>
<li>次に、電動ステージをチップの右下隅に移動します。顕微鏡をフォーカスし、右下隅の現在の 顕微鏡位置 をクリックします。</li>
	</ol></li>
	<li>[ 最も鮮明な平面を設定 ]ボタンをクリックし、ポップアップウィンドウで 右上角に移動をクリックします。顕微鏡をフォーカスし 、左下隅に移動 をクリックして、フォーカスを設定します。完了したら 、[完了 ]ボタンをクリックして、スキャンを開始します。</li>
	<li>スキャンが終了したら、[ 分析 ]タブに移動し、スタディ条件を満たす単一のセルを選択します。</li>
	<li>ガラスのマイクロキャピラリーが顕微鏡のライブビューの真ん中に入っていることを確認します。</li>
	<li>ソフトウェアのポンプウィンドウを使用して、シリンジ ポンプ を制御します。直径27mmの50mL番号1シリンジから4mLを引き出して真空を作ります。</li>
	<li>[ 並べ替え ] タブ<ol>
<li>バルブの射出パラメータを設定します。選択した単一のセルを送出した注入量は1μlであり、バルブ2が120ミリ秒間開かれ、次いでバルブ1が200ミリ秒開いた場合、200ミリ秒の時間経過後にミリ秒であったと計算された。管の弾性のために、開弁1は流れを注入するのを止める。</li>
		<li>バルブのピックアップパラメータを設定します。バルブ1が20ミリ秒間開かれ、その後バルブ2が10ミリ秒間開かれた場合、10ミリ秒のタイムラプスの後、ほとんどのパターン化された細胞を拾い上げることができると計算された。これは、トリプシンによって処理された後にフィブロネクチン結合が緩んだためです。</li>
		<li>[パスの 計算 ] ボタンをクリックします。ソフトウェアは、選択したセルをピックアップし、チップ全体に注入するために、セルからセルへの最速パスを計算します。</li>
		<li>顕微鏡をチップ表面のパターン化されたセルに焦点を合わせます。</li>
		<li>ジョイスティックを使用して、微小キャピラリーを慎重に下に移動し、細胞に触れることなく微小毛柱の先端の最も鮮明な画像を得ることができるようにします。</li>
		<li>マイクロピペットオフセットセクションの「設定」ボタンをクリックします。新しいウィンドウがポップアップし、マイクロキャピラリー断面が表示されます。毛細血管の正確な中心をクリックします。その後、ソフトウェアは、キャピラリーの先端オフセットを x、y、z 座標に記録します。</li>
		<li>[並べ替えの開始] ボタンを使用して 並べ替えを起動 します。</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

本研究では、単一細胞のトランスクリプトームを検出できる新しい強力な技術である単細胞RNAシーケンシングを用いた。これは、単一のCMを培養するための革新的なアプローチと組み合わされ、そうでなければ生体内でのみ観察できる異なるARを引き受けました。
研究にはいくつか制限があった。例えば、新生児CMは、定義された形状で72時間の重要な成体CMを培養することは非常に困難であるため、異なる形態型を生成するために使用する必要がありました。さらに、CMは72時間培養され、遺伝子発現パターンに影響を与えた可能性がある。しかし、細胞が特定の形態型を形成できるように、この培養が必要であった。さらに、単核化し、フィブロネクチンマイクロパターンを完全に覆った単一細胞のみが選別のために選択された。各チップ上のパターン化されたセルは、単にソートの1ラウンドでソートする必要があります。最後に、選択した細胞の約3分の1である約50個の細胞が各チップから正常にピックアップされた。正常に選択されたセルの数を制限した理由は 2 つあります。まず、いくつかの細胞はフィブロネクチンパターンにあまりにもしっかりと付着しており、ピックアップフローはそれらを正常に拾うのに十分なほど強制できませんでした。第二に、トリプシン治療のために、いくつかの細胞とフィブロネクチンの間の付着が緩くなりすぎた。その結果、これらの細胞は、マイクロキャピラリーがそれらに近づくと、フィブロネクチンの微小パターンから押し出され、彼らは拾われなかった。著者らは、このセットアップがin vivo環境と同じであると主張していないが、研究の質問に答える実行可能なアプローチであることが判明した。
提案された方法は、異なるセルタイプ(hiPS-CMの場合など)に適用可能です。しかし、他の細胞タイプを研究するためには、次の因子を最適化する必要があります。特定の細胞型の付着に適したECM接着分子は、マイクロパターンのコーティングに使用する必要があります。マイクロパターンのジオメトリは、研究の質問とセルタイプに応じて修正する必要があります。培養期間は、研究の質問に基づいて変更できます。剥離試薬とそのインキュベーション時間は、研究セルタイプに合わせて正確に最適化する必要があります。例えば、胚性幹細胞および神経幹細胞の剥離には、トリプルの代わりにAccutaseを使用することができる。バルブの開口時間パラメータは、セルを正常に選択するために精査する必要がありますが、穏やかに。要約すると、私たちは、この分野の研究者に貴重な資源を提供できる細胞形状を研究するための新しいプラットフォームを設計しました。この文脈では、細胞アーキテクチャと遺伝子発現の相互作用を同定するために、血行力学的制約によって生体内でCMに課されるインビトロ特性形状を模倣する実験的アプローチを設計した。また、HF in vitroを研究する新しいプラットフォームの開発と、遺伝子発現の強力な決定要因としての細胞形状の同定についても報告する。生物学や医学に広範囲に及ぶ意味を持つ新しい観測です。

世界保健機関(WHO)によると、心血管疾患(CVD)は世界中の罹患率と死亡率の主な原因です。CVDは人々の生活の質に劇的に影響を与え、社会経済的に大きな影響を与えます。HCMやDCMなどの心筋症は、心筋の主要な障害であり、HFの主な原因は高い罹患率および死亡率と関連している。HFには、感染や毒素や特定の薬物への暴露などの環境影響を含む多くの原因があります 8.HFはまた、遺伝的素因、すなわち突然変異9によって引き起こされる可能性がある。細胞外マトリックス(ECM)分子、インテグリンまたは細胞骨格タンパク質に影響を与える遺伝的組成の変化は、メカノセンセーションの障害および様々なタイプの心疾患10の原因となり得ると考えられている。
HCMの主な特徴は、左心室11の原因不明の肥大であり、時には右心室12の、そしてこれが頻繁に心室中隔の優勢な関与を呈する。HCMはまた、拡張期機能不全および筋細胞崩壊および線維症13によって特徴付けられる。ほとんどの場合、心臓の収縮装置は肉体タンパク質の突然変異の影響を受け、筋細胞14の収縮性の増大をもたらす。対照的に、DCMは、心室の一方または両方の拡張を特徴とし、症例15の30%〜50%で家族病因を有する。DCMは、広範囲の細胞機能に影響を及ぼし、筋細胞の収縮障害、細胞死および線維性修復16を招く。
遺伝学は、特定のタイプの突然変異がHCM3中に単一のCMに特定の形状特性、すなわち長さ:幅ARを持つ正方形の細胞を採用することを強制することを示しています:1:1 4(AR1)。同じことがDCMにも当てはまり、ARを持つ細長いセルは11:1(AR11)にほぼ等しくなります。さらに、HFは、後負荷の増加(例えば高血圧)によって引き起こされる可能性がある。これらのケースでは、血行力学的要求は、ラプラスの法則に従って、CMが正方形の形状を取ることを強制し、ARは7:1 5(AR7)から1:1 6、7に変更されます。HFは、プリロードの増加(例えば、ボリューム過負荷につながる条件)によっても引き起こされる可能性があります。この場合、生物物理学的制約により CM が強制的に伸び、AR が 7:1 から 11:1 に変化します。
膜でのシグナル伝達活性は、細胞AR、サイズ、膜表面積および膜曲率18などのグローバルな細胞幾何学的パラメータに依存する。新生児ラットCDが特定の長さ:幅ARで細胞を制約するようにパターン化された基質上でメッキされたとき、彼らは比率が健康な成人心臓の細胞と類似しているときに最良の収縮機能を実証した。対照的に、彼らは、比率が失敗した心臓19における筋細胞のものと類似していたときに不十分なパフォーマンスを示した。肥大の初期段階では、細胞は、断面領域の増加によって反映されるように、広くなります。HFは、肥大および細胞の後期に生じ、典型的には細長く現れる。したがって、慢性肥大のin vivoラットモデルが左心室筋細胞長の20%程度の増加を報告していることは驚くべきことではないが、体外で肥大性刺激で急性治療されたトランスジェニックマウスモデルからの成体CMは、代わりに21の代わりに細胞幅の同様の増加を示した。
単一細胞のトランスクリプトームを正確に解析できる単細胞RNAシーケンシングは、現在、細胞生物学の理解に革命を起こしている。この技術は、個々の細胞形状が遺伝子発現にどのような影響を与えたかという問題に答える際に好ましい方法でした。特に、1:1、7:1、または11:1のARと、異なる形状を持つ単一セルを比較しました。これは、1:1、7:1または11:1の定義されたARsを持つフィブロネクチンコーティングされたマイクロパターン2 で満たされた特別に設計されたチップに新生児ラット室CMを播種することによって行われた。マイクロパターンはフォトリソグラフィ技術を用いて作製された。マイクロパターンをフィブロネクチンによってコーティングし、サイトフォビック表面で囲んだ。したがって、CMは、シトフォビック領域を避けながら、フィブロネクチン基板上で成長させることによって、マイクロパターンの定義されたARを取り付け、広げ、捕獲します。マイクロパターンは、適切な形式ではありません。代わりに、フィブロネクチンレベルは、周囲のサイトフォビック領域とまったく同じ高さである。これは、周囲の壁からのストレスがないので、ペトリ皿中の細胞の成長と同様の条件を提供した。また、異なる AR を持つマイクロパターンの表面積は等しい。
実験計画には特に重要な2つの側面があり、バルクRNAシーケンシングの代わりに単細胞RNAシーケンシングを使用することにつながった。まず、単一のセルで占めることができるマイクロパターンの数パーセントだけである。第二に、単一のセルがマイクロパターンの表面を完全に占有しないことがあります。マイクロパターン表面を完全に覆う単一細胞は、単細胞RNA解析のために選ばなければなりません。チップ上のめっき細胞のサブグループだけが両方の基準を満たしていたため、単にチップ全体をトリプシン化し、バルクRNAシーケンシングのためにすべての細胞を収集することは不可能でした。半自動セルピッカーを使用して、限定セルを個別に選択する必要がありました。
CM形状が単独で心筋シンチウムに機能的な影響を及ぼすかどうかは、現在のところ不明である。本稿で提案された方法の主な目的は、細胞の形状が転写体17に影響を与えたかどうかを研究する新しいプラットフォームを開発することであった。インビトロ研究はインビボ研究とは異なるが、この研究の目的は、生体内の異なる形状を持つ細胞を比較することは非常に厳しいという、遺伝子発現に対する異なる細胞形状の影響を調査することであった。これらの実験は、同様のアプローチを用いて、細胞の形状の変化による生理学的パラメータの変化を観察したことを報告したKuoらら19によって促された。

<table><tbody><tr><td>2100 バイオアナライザー 機器</td><td>アジレント・テクノロジー</td>ズ <td>G2939BA</td><td>自動電気泳動アナライザー</td></tr><tr><td>抗赤血球マイクロビーズ</td><td>ミルテニー・バイオテック</td><td>130-109-681</td><td></td></tr><tr><td>アクシオ オブザーバー顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td>Z1</td><td>倒立顕微鏡</td></tr><tr><td>ベタイン溶液 (5 M)</td> <td>シグマ・アルドリッチ、メルク</td><td>B0300</td><td></td></tr><tr><td>セルソーター</td><td>セルソーター</td><td>https://www.singlecellpicker.com/</td> <td>セルピッカー</td></tr><tr><td>CYTOOchamber</td><td>CYTOO</td><td>30-010</td><td>カスタムデザインチップ</td></tr><tr><td>CYTOOchip</td><td>CYTOO</td><td>10-950-00-18</td><td>チャンバー</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>31966-021</td><td>高グルコース、GlutaMAX サプリメント</td></tr><tr><td>dNTPミックス (25 mM)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>R1122</td><td></td></tr><tr><td>ロバ アンチマウス IgG アレクサ フルーア 488</td><td>アブカム PLC</td><td>ab150105</td><td></td></tr><tr><td>DTT (100 mM)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>18064071</td><td></td></tr><tr><td>ERCC RNA スパイクインミックス</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>4456740</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>フィブロネクチン</td><td>Sigma-Aldrich, MERCK</td><td>F4759</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS C チューブ</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td>ローターキャップチューブ</td></tr><tr><td>gentleMACS オクト ディスソシエーター ヒーター付き</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-427</td><td>ディスソシエーター</td></tr><tr><td>ヒーター付き Greiner CELLSTAR シャーレ</td><td>Sigma-Aldrich, MERCK</td><td>P6987</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>馬血清</td><td>Sigma-Aldrich, MERCK</td><td>H0146</td><td></td></tr><tr><td>LDカラム</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-901</td><td></td></tr><tr><td>中 199</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>31150-022</td><td></td></tr><tr><td>NE-1000 シリンジポンプ</td><td>ニューエラポンプシステム</td><td>NE-1000</td><td>シリンジポンプ</td></tr><tr><td>新生児心筋細胞分離カクテル、ラット</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-105-420</td><td></td></tr><tr><td>新生児心房解離キット、マウス、ラット</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-373</td><td></td></tr><tr><td>Oligo-dT30VNオリゴヌクレオチド</td><td>IDTテクノロジー5</td><td>&prime;&ndash;AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT30VN-3&プライム;</td><td></td></tr><tr><td>RNAse阻害剤(40 U&micro;L-1)</td><td>Clontech</td><td>2313A</td><td></td></tr><tr><td>sarcomeric &α;-actinin</td><td>Sigma-Aldrich, MERCK</td><td>EA-53</td><td></td></tr><tr><td>SP8 共焦点顕微鏡</td><td>Leica Microsystems</td><td>SP8</td><td>共焦点顕微鏡</td></tr><tr><td>Superscript II first-strand buffer (5x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18064071</td><td></td></tr><tr><td>Superscript II reverse transcriptase (200 U &micro;L-1)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>18064071</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich、MERCK</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>TryplE Express酵素、フェノールレッドなし</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>TSO (100 & micro;M)</td><td>QIAGEN</td><td>5&prime;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrG+G-3&prime;</td><td></td></tr><tr><td>鮮やかな染料サイクルグリーン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>V35004</td><td></td></tr></tbody></table>

単一細胞レベルでの形状依存性転写論の研究方法

An Approach to Study Shape-Dependent Transcriptomics at a Single Cell Level

心臓肥大の異なるタイプは、CM形態の変化と共に、心臓筋細胞(CM)の増加量に関連付けられている。遺伝子発現に対する細胞体積の影響はよく知られているが、細胞形状の影響は十分に理解されていない。本論文では、CMの形態が遺伝子発現に及ぼす影響を体系的に分析することを目的とした方法について述べている。これは、単一細胞mRNAシーケンシングが続く新しい単細胞トラッピング戦略の開発を詳述する。マイクロパターン化されたチップも設計されており、3000個の長方形フィブロネクチンマイクロパターンが含まれています。これにより、異なるタイプの心不全(HF)に対応する、明確な長さ:幅アスペクト比(AR)でCMを成長させることが可能になります。この論文はまた、半自動化されたマイクロピペット細胞ピッカーを使用して、パターンから単一の細胞を拾い上げ、個別のリシスバッファに個別に注入するように設計されたプロトコルについても説明しています。これにより、定義された幾何学的形態型を有する単一のCMのトランスクリプトームをプロファイリングし、正常または病理学的状態の範囲に従って特徴付けることを可能にしました:肥大型心筋症(HCM)または後負荷/同心中心対拡張心筋症(DCM)またはプレロード/偏心。要約すると、異なる病理を表す異なる形状を持つCMを成長させ、それらの形態に基づいて単一細胞レベルでそれらの付着CMを選別する方法を提示する。提案されたプラットホームはHFの異なったタイプのための高い効率および薬物スクリーニングへの新しいアプローチを提供する。

組織を2日齢の新生児ラットの心臓の左心室から解剖し、単一細胞に分けた。次いで濃縮されたCMを、別個のARsを有するフィブロネクチンパターンを含むチップに播種した。培養の72時間後、培地をDPBSで 1:1000の鮮やかな色素サイクルグリーンに置き換え、生きた細胞の核を可視化するために2分間置き換えた。次に、DPBS-/-/トリプシン(1:1)で細胞を処理し、フィブロネクチンから細胞を緩め、細胞の摘出を容易にするために流体真空を使用できるようにした。一方、チップ全体を10倍の倍率でスキャンし、セルピッカーに接続された反転顕微鏡を使用した。これは、トリプシン処理のために細胞が丸まる前に行われた。スキャンした画像に基づいて修飾されたセルが選択され、その座標がセルピッカーソフトウェアに保存されました。マイクロパターンは、単核単一細胞を含み、細胞がそのフィブロネクチンマイクロパターンを完全に覆う場合にのみ選択された。選択した細胞を1個ずつ選んだ細胞選別機を、摘み取りに成功した各単一細胞を直ちに個々のPCRチューブに注入し、顕微鏡ステージに置いた。各PCRチューブには3.55μLのリシスバッファーが含まれていた(表2)。メディアの削除から始まったソートプロセスは、40分以内に完了しました。相補的デオキシリボ核酸(cDNA)合成、PCRプリ増幅および精製は、Lysed単一細胞上で行った、Smart-Seq2プロトコル24 に基づく(表3)。精製されたcDNAの品質は、自動電気泳動分析装置によって確認された。1つの選ばれた単一細胞の事前増幅cDNAの電解電計を 図4に示す。RNA-Seq ライブラリは、Smart-Seq2 プロトコル24に従って作成されました。
パターン化されたCMのサルコメア構造を観察するために、パターン化されたCMを肉体α-アクチニン抗体で染色した。細胞を、二次染色のために室温で1時間、ロバ抗マウスIgGアレクサフルオール488 1:800でインキュベートした。核を1μg/mL DAPIで染色した。免疫蛍光画像は、63倍の油浸(NA 1.4)目的を用いて反転共焦点顕微鏡で取得した(図5)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61577/61577fig01.jpg"> 図1:フィブロネクチンマイクロパターンを用いてチップのレイアウト (A) カスタム設計チップの画像。チップは、ボロケイ酸ガラス上のフォトリソグラフィーによって印刷されたフィブロネクチンマイクロパターンを備えた19.5mm x 19.5 mmのカバースリップです。(B)チップレイアウト。チップは3つのゾーンに分割され、各ゾーンは特定のARを有するフィブロネクチンマイクロパターンで構成され、フィブロネクチン微小パターンの異なる形状の蛍光画像は、各ゾーンの拡大図で示されている。この図はハフトバラダラン・エスファハニらhttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/2によって「補足資料1」から変更されました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61577/61577fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61577/61577fig02.jpg"> 図2:ヒーター装置を搭載したディスコンシエータ。 (A)2日齢の新生児ラット左心室の完全自動解離に使用される解離器器具全体。(B)暖房ユニット。(C)ローターキャップチューブ。(D) 組織解離の完全自動化ワークフローのためのすぐに使用できるプログラム。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61577/61577fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61577/61577fig03.jpg"> 図3:細胞選択装置。 (A)セルピッカーの電動ステージの拡大図。ペトリ皿ホルダーと10のPCRストリップのための80の穴および口径測定の十字線のための穴はステージに埋め込まれる。(B) ガラスのマイクロキャピラリーの拡大図。(C)シリンジポンプ。(D)バルブ1と2の開閉時間ウィンドウを制御する制御ユニットは、制御ユニット内部に取り付けられる。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61577/61577fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61577/61577fig04.jpg"> 図4:1個の選ばれた単一細胞の予増幅cDNAの電解素図。 19 PCR サイクルのプリ増幅を使用して、1 ng/μL 精製 cDNA 収率の 15 μL を得た。ゲル状の密度測定プロットでは、エレクトロヘログラムの1852 bpのピークに相当する明確なバンドが観察される。フラグメントの平均サイズは1588 bpです。さらに、300bpより短い断片の少量は、良好なcDNAライブラリを示す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61577/61577fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61577/61577fig05.jpg"> 図5:異なるARsを有するパターンCMのα-アクチニン肉体構造(緑色)および核(青色)の免疫蛍光染色。 クロマチンをDAPIによって染色した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61577/61577fig05large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>形態型</td>
			<td>Ar</td>
			<td>長さ(μm)</td>
			<td>幅 (μm)</td>
			<td>フィブロネクチン面積(μm2)</td>
		</tr>
<tr>
<td>AR1</td>
			<td>1:1</td>
			<td>47</td>
			<td>47</td>
			<td>2209</td>
		</tr>
<tr>
<td>AR7</td>
			<td>7:1</td>
			<td>126</td>
			<td>18</td>
			<td>2268</td>
		</tr>
<tr>
<td>AR11</td>
			<td>11:1</td>
			<td>155</td>
			<td>14</td>
			<td>2170</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: パターン化された CM のジオメトリ
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>コンポーネント</td>
			<td>ボリューム(μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>ヌクレアスフリー水</td>
			<td>0.65</td>
		</tr>
<tr>
<td>(0.4% vol/vol)トリトンX-100</td>
			<td>1.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>dNTP ミックス (25 mM)</td>
			<td>0.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNase阻害剤(40 U μL-1)</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>オリゴdT30VNオリゴヌクレオチド(100 μM)</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>ERCC RNAスパイクインミックス(2.5 x 105 希釈)</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>単一のセルを注入</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>総量</td>
			<td>4.55</td>
		</tr>
</tbody></table>表2:単一セルカスタムのリシスバッファ。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>コンポーネント</td>
			<td>ボリューム(μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>上付き文字 II ファーストストランドバッファ (5x)</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>DTT (100 mM)</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>ベタイン (5 M)</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mgcl2 (1 M)</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNase阻害剤 (40 U μL-1)</td>
			<td>0.25</td>
		</tr>
<tr>
<td>上付き文字 II 逆転写酵素 (200 U μL-1)</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>TSO (100 μM)</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>総量</td>
			<td>5.45</td>
		</tr>
</tbody></table>表3:単一CMのリセートから第一鎖cDNAを合成する1つのRT反応に対する逆転転写(RT)ミックス。

本論文では、異なる病理を表す異なる形状を有する心臓筋細胞を成長させ、それらの形態に基づいてこれらの付着性心筋細胞を単一細胞レベルで選別する方法を提示する。提案されたプラットホームは心不全の異なったタイプのための高い効率および薬物スクリーニングへの新しいアプローチを提供する。

Different types of cardiac hypertrophy have been associated with an increased volume of cardiac myocytes (CMs), along with changes in CM morphology. While ...

我々は、単一細胞レベルで異なる形態の付着を成長させ、選別する方法を用いて、細胞形状が遺伝子発現に及ぼす影響を調べるための新しいプラットフォームを提案する。この技術の主な利点は、生体内の異なる形状を持つ細胞を比較するのと同様に、インビトロで細胞形状のハイスループット研究を容易にする技術的に要求される。パターン化された心筋細胞培養を設定するには、目的のアスペクト比で心筋細胞懸濁液を計数用15ミリリットルチューブに移し、適切なめっき培地濃度の5ミリリットル当たり10倍の細胞に希釈する。フィブロネクチンコーティングされたマイクロパターン化チップに2ミリリットルの細胞を加え、35ミリリットルのグレニエ・ペトリ皿の中に2ミリリットルの温かいめっき媒体に沈め、37°C、5%の二酸化炭素インキュベーターに18時間置きます。翌日、光顕微鏡でチップをチェックし、細胞のほとんどが取り付けられていることを確認します。皿から培地を取り出して破片や死んだ細胞を取り除き、中央から始めて左右に向かってドロップワイズで動き、PBSを細胞にそっと加えます。3回目の洗浄後、PBSを4ミリリットル維持培地に交換し、細胞を細胞培養インキュベーターに戻します。72時間後、示されているように、洗浄ごとに2ミリリットルの暖かいダルベッコのPBSでチップ表面を2回静かに洗い流し、鉗子を使用して洗浄されたチップを新しい滅菌35ミリリットルグレニエペトリ皿にすぐに移します。1.5マイクロリットルの鮮やかな二輪サイクルグリーン希釈1000倍のDPBSをチップに素早く加えます。チップの上にチャンバーを固定し、セルピッカーステージの皿ホルダーに皿を置きます。磁気キャップを挿入し、ライブ ビュー ウィンドウで十字線を探します。十字線に焦点を当て、スキャンとソートウィンドウで、自動注入とキャリブレーションのキャリブレーションを選択します。DPBS溶液中の1対1のトリプルEの1.5ミリリットルで皿上清を交換して、フィブロネクチンから細胞を緩め、スキャンタブを開きます。チップ全体をスキャンするには、視野内のチップの左上隅に焦点を合わせ、[現在の顕微鏡の位置を取得]をクリックします。次に、チップの右下隅に焦点を合わせ、現在の顕微鏡位置をクリックします。ポップアップ ウィンドウで、[最も鮮明な平面を設定] をクリックし、右上に移動をクリックして、左下隅のボタンに移動します。次に、[完了] をクリックしてスキャンを開始します。スキャンが完了したら、[解析] タブを開き、[マップの表示] をクリックして、スタディ条件を満たす単一セルを選択します。ガラスのマイクロキャピラリーを顕微鏡のライブビューの中央に中央に配置し、ポンプタブを開きます。真空を作成するには、プランジャーを50ミリリットルのナンバーワンシリンジ4ミリリットルから引き込み、ソートタブを開きます。単一のセルを選択できるようにするには、バルブ 2 を 120 ミリ秒、バルブ 1 を 200 ミリ秒のタイムラプスの後に 20 ミリ秒開くように設定します。選択したセルをリシスバッファーを含む PCR チューブに正常に送達できるようにするには、バルブ 1 を 20 ミリ秒、バルブ 2 を 10 ミリ秒のタイムラプス後 10 ミリ秒で開くように設定します。バルブの設定が調整されたら、[パスの計算] をクリックします。ソフトウェアは、選択したセルをピックアップしてチップ全体に注入するためのセルからセルへの最速パスを計算します。次に、チップ表面上のパターンに顕微鏡を焦点を合わせます。ジョイスティックを使用してマイクロキャピラリーを慎重に下に移動し、チップ表面に触れることなくマイクロキャピラリーの先端の最も鮮明な画像を得ることができるようにし、セットをクリックします。新しいウィンドウが開き、マイクロキャピラリー断面が表示されます。ソフトウェアで、X、Y、Z 座標のキャピラリーの先端オフセットを記録するには、キャピラリーの正確な中心をクリックします。次に、[並べ替えの開始] をクリックして並べ替えを開始します。この一細胞から予増幅されたcDNAの代表的な分析では、ゲル状の密度測定プロットのような明確なバンドが、エレクトロヘログラムにおける1,852塩基対のピークに対応して観察された。フラグメントの平均サイズは、300塩基対より短い少数のフラグメントを持つ1,588塩基対であり、良好なcDNAライブラリの生成を示す。免疫蛍光染色および分析は、パターン化された心筋細胞内のサルコメア構造を評価するためにも行うことができる。このプラットフォームは、さまざまなタイプの心不全のハイスループット研究と薬物スクリーニングへの道を開きます。

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Research

JoVE Journal

Genetics

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