サンプルチャンバーベースの光シート蛍光顕微鏡における複数の昆虫胚の同時ライブイメージング

サンプルチャンバーベースのライトシート蛍光顕微鏡は、高スループットではなく、ハイコンテント用に設計されています。したがって、ライブイメージングアッセイは、周囲の変動による影響を少なくするために、順次実行する必要があります。当社のクモの巣ホルダーは、複数の胚のスタッキングと同時イメージングを可能にし、周囲のばらつきを排除し、スループットを向上させます。

蜘蛛の巣ホルダーに胚をマウントするには、ある程度の技巧が必要です。説明ビデオは、多くの短い行動ジェスチャーのシーケンスを説明するのに理想的です。サンプルチャンバーベースのライトシート蛍光顕微鏡のキャリブレーション用。

まず、アガロースアリコートをドライブロックヒーターミキサーで摂氏80度で液化します。溶かしたアガロースを摂氏35度に冷まし、50マイクロリットルのアガロースを1.5ミリリットルの反応チューブに移します。0.5マイクロリットルの蛍光マイクロスフェア溶液をアガロースと1分間1,400回転で混合し、クモウェブホルダーのスロット穴を10マイクロリットルのアガロース蛍光マイクロスフェア溶液混合物で満たします。

薄いアガロース膜だけが残るまでできるだけ多くのアガロースを吸引し、アガロースが30〜60秒間固化するのを待ちます。サンプルチャンバーにオートクレーブ処理した水道水を入れ、クモの巣ホルダーをゆっくりとサンプルチャンバーに挿入します。検出レンズの前にある長穴を動かし、ホルダーを照明軸と検出軸に対して45度の位置に回転させます。

クモの巣ホルダーは、透過光チャネルで見えないようにする必要があります。適切な蛍光チャンネルに切り替え、レーザー出力と露光時間を調整して、蛍光マイクロスフェアが適切な信号を提供するようにします。横方向になったアガロースフィルムを完全に覆うビューボリュームを指定し、それぞれの照明レンズと検出レンズの組み合わせで可能な最大軸解像度を計算して、Z間隔を定義します。

次に、蛍光マイクロスフェアの3次元テストZスタックを記録し、X、Y、およびZの最大投影をキャリブレーションチャートと比較します。マイクロスフィアがぼやけている、ぼやけている、または歪んでいるように見える場合。照明レンズや検出レンズの位置を調整します。

胚のデコレーションには、1ラインあたり1-6ウェルプレートのA1、A2、A3、B3ウェルに8ミリリットルのオートクレーブ処理した水道水を追加します。次に、7ミリリットルのオートクレーブ処理された水道水と1ミリリットルの次亜塩素酸ナトリウム溶液をB1ウェルとB2ウェルに加えます。最初のプレートを実体顕微鏡の下に置き、最初の胚を含む細胞ストレーナーをA1ウェルに挿入します。

胚を30〜60秒間穏やかに攪拌して洗浄してから、ストレーナーをB1ウェルに移動します。プレートを30秒間激しく振ってから、ストレーナをA2ウェルに移します。穏やかに攪拌しながら胚を1分間洗浄し、ストレーナーをB2ウェルに移して、ほとんどの胚が完全に脱角化されるまで激しく振とうします。

次に、ストレーナーをA3ウェルに移して1分間穏やかに洗浄してから、デコレーション胚のストレーナーをB3ウェルに保存して、他の系統の胚が実証されたように処理されるまで保存します。胚をクモの巣ホルダーに取り付けるには、示されているように別のアガロースのアリコートを液化します。アガロースが冷えたら、クモの巣ホルダーを実体顕微鏡の下に置き、10マイクロリットルのアガロースをスロット穴に追加します。

ピペットの先端を使用してアガロースを長穴に広げてから、薄いアガロースフィルムだけが残るまでできるだけ多くのアガロースを吸引します。アガロースが固まったら、絵筆を使用して胚を慎重に選び、アガロースフィルムに移します。長穴の長軸に沿って配置し、前後軸を長穴の長軸に合わせます。

胚を安定させるために、胚とアガロースフィルムの間の隙間に1〜2マイクロリットルのアガロースを慎重にピペットで入れます。アガロースが固まったら、マウントされた胚を入れたクモの巣ホルダーを、画像バッファーで満たされたサンプルチャンバーにゆっくりと挿入します。胚を画像化するには、クモの巣ホルダーが照明軸と検出軸に対して45度の位置にあることを確認し、透過光チャネル内で胚を視野の中心に移動します。

クモの巣ホルダーが見えないようにする必要があります。次に、胚の中面が焦点面と重なり、輪郭が鮮明に見えるまで、Zのマイクロ翻訳ステージで胚を動かします。蛍光チャネルに切り替えずに、胚を両方向に250ミクロン動かして、視野の容積を指定します。

多方向に沿ったイメージングが必要な場合は、胚を適切に回転させ、胚に焦点を合わせ、示したように視野の容積を指定します。次に、他のすべてのマウントされた胚に対してこの手順を繰り返します。すべての胚の視野量を指定したら、蛍光チャネルとタイムラプスパラメータを定義し、イメージングプロセスを開始します。

数日間続くアッセイの場合は、蒸発を減らすために、サンプルチャンバーの開口部を少なくとも部分的に覆うことを検討してください。イメージングアッセイが終了したら、クモの巣ホルダーをサンプルチャンバーから慎重に取り外し、小さなペイントブラシを使用して胚をアガロースフィルムから切り離し、適切に標識された顕微鏡スライド上に胚を置きます。スライドをリトリーバルディッシュに入れ、適切な標準飼育条件下でインキュベートします。

孵化の時点が近づいたら、回収皿を頻繁にチェックし、孵化した幼虫を24ウェルプレートの個々のウェルに移します。ウェルの半分を適切な成長培地で満たし、次に適切な標準的な飼育条件下で幼虫をインキュベートします。観察された個体が成人期に達したら、適切な交配パートナーを提供し、数日後に子孫を確認します。

このビデオでは、異なるトランスジェニックショウジョウバエ株に由来する3つの胚の蛍光シグナルダイナミクスを約1日にわたって観察することができます。すべての系統が、おそらく遍在し、構成活性のあるプロモーターの制御下で核局在化EGFPを発現していたため、同様の蛍光パターンが予想されました。しかし、ライブイメージングの結果を比較すると、表現パターンには強い空間時間的な違いがあり、これは周囲の分散による二次的な影響ではないことが明らかになりました。

この解析では、同じピギーバックベースの導入遺伝子を持つ3つのTribolium胚の解析。原腸陥入時の漿膜窓閉鎖過程のライブイメージング結果の比較結果から、2 番目のサブラインは他の 2 つのサブラインよりも全体的に非常に強い信号を提供することが示唆されています。これらのデータが示すように、ゲノムの状況もTriboliumの導入遺伝子の発現レベルに強い影響を与える可能性があります。

私たちのアプローチは、野生型コントロール胚を同時にイメージングできるため、ノックダウンおよびノックアウト表現型の解析に非常に適しています。私たちのプロトコルは、2つ以上の昆虫種の形態形成を比較するためにも使用できます。したがって、開発の進化についてより深い洞察を得ることができます。