Name: サンプルチャンバーベースの光シート蛍光顕微鏡における複数の昆虫胚の同時ライブイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: 学ぶ光シート蛍光顕微鏡を用いた複数の昆虫胚の同時ライブイメージング法。クモの巣ホルダーを使用してDrosophila胚を同時に観察し、環境変動を排除して発生生物学研究の精度とスループットを向上させる。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

エルンスト・H・K・ステルツァーは、彼のリソースだけでなく、原稿に関する彼の貴重なコメントを使用する機会に感謝します, トリボリウム ライブイメージングのためのサポートのためのアニタ・アンデルル, 技術サポートのためのスヴェン・プラスだけでなく、イラン・デイビス, ニコール・グリーダーとジェロルド・シュービガーは、ブルーミントンストックセンターを介して彼らの遺伝子導入 ショウジョフィラ ラインを共有しました.

1. 準備作業
<ol><li>科学的な質問に合ったLSFM用の照明レンズ/検出レンズ/カメラの組み合わせを選択し、顕微鏡を設定します。視野の大きさは、カメラチップサイズの商と検出レンズの倍率です。照明レンズは、視野全体が平面ライトシート34で覆われるように選択されるべきである。3 つの推奨される組み合わせを 表 1に示します。</li>
	<li>アガロースアリコートと検索皿を調製するには、200mLオートクレーブ水道水に2gの低溶融アガロースを加え、すべてのアガロース粒子が溶解するまで600〜800 Wの電子レンジで混合物を加熱します。1.5 mL または 2 mL 反応チューブに 1 mL アガロースアリコートを用意し、高さ 3~5 mm の高い 90 mm の Ø ペトリ料理をアガロースで満たします。固めたアリコートと料理を4°Cで保管してください。</li>
	<li>ショウジョウバエの場合:新鮮な飼育バイアルを準備するには、十分な量のカスタムメイドまたは市販のショウジョウバエ培地を調理し、5〜15mLを広いバイアルに移し、4°Cで保管してください。 産卵皿を準備するには、低融解アガロース1gを50mLのオートクレーブ水道水に加え、すべてのアガロース粒子が溶解するまで600-800 Wの電子レンジで混合物を加熱します。混合物を45°Cまで冷やし、50 mLフルーツジュース(好ましくはリンゴまたは赤ブドウ)を加え、十分に混ぜます。35 mm Ø ペトリ皿に混合物を注ぎ、4 °Cで固化した産卵皿を保管します。</li>
	<li>Triboliumの場合:成長培地を調製するには、全粒粉と不活性乾燥酵母を710μmのメッシュサイズふるいに通し、ふるいにかけられた小麦粉を5%(w/w)ふるい酵母で補います。産卵培地を準備するには、250 μmメッシュサイズふるいを通して細かい小麦粉と不活性乾燥酵母を渡し、ふるいにかけた小麦粉を5%(w/w)ふるいにかけた酵母で補います。</li>
</ol>2. 蛍光微小球を用いたサンプルチャンバーベースLSFMの較正
注:キャリブレーションの目的は、照明レンズと検出レンズの焦点を合わせることです(図2A)。これは、鮮明な画像の前提です。LSFMは、少なくとも3〜4週間に1回は定期的に校正する必要があります。
<ol><li>80°Cの乾燥ブロックヒーター/ミキサーでアガロースアリコートを再液化し、アガロースアリコートを35°Cまで冷却します。</li>
	<li>50 μLのアガロースを1.5 mL反応チューブに移し、0.5 μLの蛍光微小球溶液を加えます。1,400 rpmで1分間混ぜます。</li>
	<li>クモの巣ホルダーのスロット穴にアガロース/蛍光微小球溶液混合物を10μL充填し、薄いアガロースフィルムが残るまでできるだけ多くのアガロースを吸引します。固化のために30-60 sを待ちます。</li>
	<li>サンプルチャンバーにオートクレーブ水道水を充填します。サンプルチャンバーにゆっくりとクモの巣ホルダーを挿入し、検出レンズの前にマイクロトランスレーションステージでスロット穴を移動します。</li>
	<li>回転ステージでクモの巣ホルダーを、イルミネーション(x)軸と検出軸(z軸)に対して45°の位置に回転させます。クモの巣ホルダーは、伝送灯チャネルで見えない必要があります。</li>
	<li>それぞれの蛍光チャネルに切り替え、蛍光微小球が適切な信号を提供するように、レーザーパワーと露光時間を調整します。</li>
	<li>今横方向のアガロースフィルムを完全に覆うビューのボリュームを指定します。それぞれの照明レンズ/検出レンズの組み合わせ34に対して可能な最大の軸解像度を計算して、z間隔を定義する。あるいは、横解像度の4倍を大まかな近似として使用することができる。</li>
	<li>蛍光微小球の3次元テストzスタックを記録し、x、y、zの最大投影をキャリブレーションチャートと比較する(図2)。微小球がぼやけた、ぼやけている、または歪んでいる(図2B,C)場合は、照明レンズや検出レンズの位置を調整します。</li>
</ol>3. ショ ウジョウバエ の回収
<ol><li>選択した ショウジョウバエ ラインの成人100~200人を、イメージングアッセイの2〜3日前に新鮮な飼育バイアルに移し、採卵培養を確立する。まだ存在しない場合は、古い飼育バイアルを使用して子孫の文化を始めることを検討してください。成人が生後2週間以下であることを保証するために、胚採取培養物を子孫培養物に間に合うように置き換える。</li>
	<li>室温に産卵皿を温め、寒天の上に酵母ペーストを一滴加えます。</li>
	<li>卵のコレクション文化から空の狭いバイアルに大人を転送し、産卵皿の上に置きます。卵の収集設定を室温で15分間インキュベートします。可能であれば、このステップ中に麻酔(冷たい、CO2)を避けてください。</li>
	<li>大人を飼育バイアルに戻します。便利な温度/時間の組み合わせで産卵皿をインキュベートし、産卵皿から100 μmメッシュサイズのセルストレーナーに小さな絵筆で10〜20個の胚を移します。産卵皿を捨てる。</li>
	<li>ショ ウジョウバエ の各線について、手順3.1~3.4を繰り返します。</li>
</ol>4. トリボリウム 胚のコレクション
注: 便宜上 、Tribolium の卵の収集手順のスキームが提供されています (図 3A) この手順のブラケット内の数字も参照します。
<ol><li>選択したトリボリウムラインの成人200~300名(約400~700mg)を、イメージングアッセイの2~10日前に空の1-Lガラスボトルに移し、コレクション培養を確立する(図3 A_01)。ボトルに50〜100gの新鮮な成長培地を充填してください。まだ存在しない場合は、利用可能な幼虫と子犬を使用して子孫培養を開始することを検討してください。成人が生後3ヶ月以下であることを保証するために、卵の採取培養を子孫の培養物に間に合うように置き換えます。</li>
	<li>800 μm メッシュサイズのふるいを通して、卵の採取培養を渡します(図3A_02)。非段型胚を含む成長培地を初期ボトル(図3 A_03)に戻し、大人を空の1つのLガラス瓶に移す(図3 A_04)。産卵培地(図3 A_05)を10g加え、卵の採取設定を室温で1時間インキュベートする(図3 A_06,07)。</li>
	<li>800 μm メッシュサイズのふるいを通して、卵の収集設定を渡します(図3A_08)。大人を最初のボトルに戻す(図3 A_09)。画像化すべき発達過程に応じて、現在約30〜100個の胚を含む産卵培地を便利な温度/時間の組み合わせでインキュベートする(図3A_10)。</li>
	<li>産卵培地を300μmメッシュサイズの篩(図3A_11)に通し、胚(図3A_12)を100μmメッシュサイズのセルストレーナーに移します。ふるいにかけた産卵媒体を捨てる(図3A_13)。</li>
	<li>各トリボリウム線について、手順 4.1 ~ 4.4 を繰り返します。</li>
</ol>5. 次亜塩素酸ナトリウム系デコール化
注:ショ ウジョウバエ と トリボリウム の胚は、除去後に胚が湿っている限り、適切な発達に不可欠ではない保護的で重い光散乱タンパク質層であるコリオンで覆われています。両方の種の胚のデコールリオネーションプロトコルは同一である。
<ol><li>A1、A2、A3、B3ウェルを8mLのオートクレーブ水道水とB1およびB2ウェルに7mLのオートクレーブ水道水と1mLの次亜塩素酸ナトリウム(NaOCl)溶液で充填して6ウェルプレートを準備する(図3B)。透過光の中で理想的には、ステレオ顕微鏡でデコールリオネーションプロセスを観察してください。 注意:次亜塩素酸ナトリウムは腐食性です。</li>
	<li>胚含有細胞ストレーナー(ステップ3.4および/または4.4)をA1ウェルに挿入し、穏やかな攪拌の下で約30〜60sの胚を洗います。</li>
	<li>細胞ストレーナーをB1ウェルに移動し、プレートを30sのために激しく振り、それをA2ウェルに移し、穏やかな攪拌の下で胚を1分間洗います。</li>
	<li>細胞ストレーナーをB2によく移動し、ほとんどの胚が完全にデコリオネートされるまでプレートを激しく振り(図3C)、それをA3ウェルに移し、穏やかな攪拌の下で1分間胚を洗います。</li>
	<li>取り付け手順を進める前に、セルストレーナーをB3によく保管してください。</li>
	<li>各行に対して手順 5.1 ~ 5.5 を繰り返します。</li>
</ol>6. クモの巣ホルダーを用いた複数の胚の取り付け
<ol><li>80°Cの乾燥ブロックヒーター/ミキサーでアガロースアリコートを再液化し、アガロースアリコートを35°Cまで冷却します。</li>
	<li>クモの巣ホルダーのスロット穴の上にアガロースのピペット10 μL。ピペットの先端で、細いアガロースフィルムだけが残るまで、アガロースを細孔の上に広げ、できるだけ多くのアガロースを吸引する。固化のために30-60 sを待ちます。</li>
	<li>各ラインに対して、小さな絵筆で1つ以上の胚を慎重に選び、アガロースフィルムに置きます。</li>
	<li>細孔の長い軸に沿って胚を配置し、その後、前部後方軸をスロット穴の長い軸に合わせます(図3D)。</li>
	<li>1-2μLのアガロースを胚とアガロース膜の間の隙間に入れ、慎重に胚を安定化させる。固化のために30-60 sを待ちます。</li>
	<li>取り付けられた胚を持つクモの巣ホルダーを、画像バッファで満たされたサンプルチャンバーにゆっくりと挿入します。</li>
</ol>7. サンプルチャンバーベースLSFMにおける比較ライブイメージング
<ol><li>検出レンズの前にマイクロトランスレーションステージを持つ胚の1つを移動します。クモの巣ホルダーが、照明(x)および検出(z)軸に対して45°の位置にあることを確認します(図 1Cを参照)。</li>
	<li>透過光チャンネルで、胚を視野の中央に移動します。クモの巣ホルダーは表示されません。</li>
	<li>胚のミッドプレーンが焦点面と重なるまで、すなわち輪郭が鋭くなるまで、zのマイクロトランスレーション段階で胚を移動します。蛍光チャネルに切り替えないで、ミッドプレーンから250μm離れて両方向に移動して、ビューの体積を指定します。</li>
	<li>必要に応じて、複数の方向に沿ってイメージングが必要な場合は、胚を適切に回転させ、ステップ7.2および7.3を繰り返します。クモの巣のホールダーは90°のステップの4つまでのオリエンテーションを支える。</li>
	<li>クモの巣ホルダーに取り付けられた他のすべての胚について、ステップ7.1~7.3(7.4)を繰り返します(図3E)。最下の胚が検出レンズの前にあるときに、最上の胚がイメージングバッファを離れないようにしてください。</li>
	<li>蛍光チャネル(レーザーパワー、露光時間、検出フィルタ)およびタイムラプス(間隔、全持続時間)パラメータを定義し、イメージングプロセスを開始します。指標値については、サンプル データセットのメタデータ テーブル (補足表 1) を参照してください。数日間続くアッセイについては、蒸発を減らすためにサンプルチャンバーの開口部を少なくとも部分的に覆うことを検討してください。</li>
</ol>8. 画像化胚の検索とさらなる培養
<ol><li>イメージングアッセイが終了したら、サンプルチャンバからクモの巣ホルダーを慎重に取り外します。</li>
	<li>小さな絵筆でアガロースフィルムから胚を取り外し、適切にラベル付けされた顕微鏡スライドに移します。スライドを取り出し皿に入れ、それぞれの標準的な飼育条件下でインキュベートします。</li>
	<li>実験モダリティについて、胚発生がいつ完了したかを推定する。孵化タイムポイントが近づくにつれて、頻繁に検索皿をチェックし、孵化した ショウジョウバエ 幼虫を個々の飼育バイアルと トリボリウム 幼虫に24ウェルプレートの個々の井戸に移します。成長培地で半分までの井戸を埋めます。それぞれの標準的な飼育条件の下でインキュベートする。</li>
	<li>観察された個人が成人になったら、適切な交配パートナーを提供し、数日後に子孫をチェックします。</li>
</ol>9. 画像データ処理とメタデータのドキュメント
注意: 画像データ処理の場合、ImageJ 派生フィジー35 (imagej.net/Fiji/Downloads) をお勧めします。FIJI はインストールを必要とせず、32 ビットバージョンと 64 ビットバージョンも利用できます。LSFM データで最も頻繁に使用される形式の 1 つは、TIFF コンテナーの形式でイメージ スタックを保存できるタグ付きイメージ ファイル形式 (TIFF) です。
<ol><li>すべての z スタックの z 最大投影を計算します (イメージ|スタック |Z プロジェクト を選択し、[ 最大強度]を選択します。最大投影法は、空間ディメンションの数を 3 から 2 に減らすデータ単純化アプローチです。バッチ処理用のフィジースクリプトが提供されています (補助ファイル 1)。</li>
	<li>それぞれの z 最大投影を連結して時間スタック(t スタック)を作成します。これらを 1 つの TIFF コンテナーに保存します。すべての記録された胚に加えて、該当する場合は、それぞれの方向および蛍光チャネルにこれを行います。</li>
	<li>z 軸を中心に z と t のスタックを回転させて、胚の前後軸を x または y イメージ軸に合わせます (イメージ |変換|回転)。3 つのイメージ軸すべてに沿って z スタックを切り取り、x および y イメージ軸の t スタックをトリミングして、胚の周りの最小のバッファ空間(x 軸と y 軸に沿って 20 ~ 40 ピクセル、z 軸に沿った 5 ~10 の画像)だけが残るようにします(Image ||を調整するx 軸と y 軸のキャンバス サイズ、 イメージ |スタック | ツール| z 軸のスライスキーパー)。<ol>
<li>必要に応じて、記録されたすべての胚とそれぞれの方向にこれを個別に行います。蛍光チャネルは、該当する場合、同一の回転およびトリミングパラメータで処理する必要があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>メタデータをできるだけ詳細に文書化します。ガイドラインとして、「代表的な結果」セクションに記載されているサンプルデータセットのメタデータテーブルを使用できます (補足表 1)。</li>
</ol>10. データの視覚化
注: このデータ可視化ガイドラインは、主に、複数の方向または時間の経過に沿っていくつかの記録された胚を示すz最大投影画像行列の作成に焦点を当てています。次の手順では、表示された図と「代表的な結果」セクションにリンクされたビデオを作成するためにサンプル データセットに適用されたデータ視覚化手順について説明します。
<ol><li>複数の方向のスタックを組み合わせる (画像|スタック |ツール|) を結合または複数の蛍光チャネル (画像|) を結合するカラー|チャネルをマージする ) を使用して、目的の生物学的構造および/またはプロセスを視覚化します。</li>
	<li>t スタックの強度を調整します (画像||を調整する必要に応じて、"Set"関数を使用して明るさ/コントラストを指定します。表示される最小値はバックグラウンド信号より少し上に設定する必要があり、最大表示値はコントラストが便利になります。それぞれの z スタックの一貫した調整に使用できるため、両方の値を文書化します。適用機能を使用して調整をインプリントします。実験のモダリティに応じて、記録されたすべての胚を同じ値で処理することを検討してください。</li>
	<li>強度調整後の t スタックを別々のファイルとして保存し、調整されていない t スタックを上書きしないでください。専用の画像選択関数(例えば、画像|を使用して調整されたtスタックから適切なサブスタックをコンパイル スタック |ツール|スライスキーパー)を使用し、モンタージュツール(画像|スタック |「モンタージュを作成」をクリックして、フィギュアデザインに使用できるイメージグリッドを作成します。</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

LSFの排他的な応用分野の1つは、発生生物学です。この分野では、生きた標本を見ることは重要であり、そうでなければ形態形成プロセスは動的に記述することはできません。ここで説明するサンプルチャンバベースのLSFMにおける同時ライブイメージングの実験的フレームワークは、2つの大きな理由から便利である。
連続ライブイメージングでは避けられない周囲分散は、積極的に対処することができます。昆虫胚関連の生画像では、例えば、次の感受性が見られます。卵の採取培養物は、胚採取時に異なる年齢を有し得る。 ショウジョウバエでは、これが子孫45の性質に影響を与えることを示している。適切に非同期化されたカルチャを使用することもできますが、同期カルチャとの同時イメージングの方が便利です。 ショウジョウバエと トリボリウムベースの代表的な結果は、両方とも同期した卵の採取培養に由来し、異なる蛍光特性が親の老化の意図しない効果であることを確信して排除することができます。
<p class="jove_cont...

蛍光顕微鏡は、生命科学、特に細胞生物学および発生生物学において最も重要なイメージング技術の1つです。共焦点蛍光顕微鏡1では、1990年代半ば以降の3次元蛍光イメージングの最先端のものであり、同じレンズが蛍光色素励起および発光光検出に使用されている。照明レーザービームは、照明/検出軸に沿ってすべての蛍光を励起し、それぞれの焦点外信号はピンホールによって検出される前に識別されます。したがって、各2次元画像について、全体の標本が照らされます。その結果、各3次元画像、すなわち、空間的に連続した2次元画像の積層に対して、検体全体が数十〜数百倍2回照らされ、光漂白および光毒性を促進する3。
約20年前、光シートベースの技術4 は、3次元蛍光イメージングの有望な代替手段として登場し、発生生物学5において貴重なツールとなりました。このアプローチでは、照明と検出が分離されます。照明レンズは、垂直に配置された検出レンズの焦点面内に数マイクロメートルの深さの光シートを生成するために使用される。したがって、2 次元イメージごとに、焦点面の周りの薄い平面ボリュームのみが照らされます。その結果、各3次元画像について、検体全体が一度だけ照射され、光漂白と光毒性6が強く減少する。このため、光シート蛍光顕微鏡(LSFMs)は、複数の生物学的に関連するスケールで複雑なプロセスを研究するための効率的なソリューションを提供し、特に数ミリメートルの大きさの標本を細胞内レベルで分析する必要がある発生生物学において価値があります。
歴史的に、LSCMはサンプルチャンバーベース7、8であった。これらの設定では、照明(x)および検出(z)軸は、通常、重力軸(y)に垂直に配置されます。サンプルチャンバーは、十分な実験の自由を提供します。第一に、それらは、特定の温度9を維持したり、生化学的ストレッサーを適用するために、環境を制御するために灌流システムの使用を容易にする、大きなイメージングバッファ容量を提供します。また、それらは、三次元を維持しながらそれぞれの実験ニーズに合わせたカスタマイズされた取付方法10を支持し、場合によっては、試料の完全性を動的にする。さらに、サンプルチャンバベースのセットアップは、通常、y軸の周りに標本を回転させ、2つ、4つ以上の方向に沿ってそれらをイメージするために使用される回転関数が装備されています。一般的に使用されるモデル生物の胚は、顕微鏡の文脈では、腹側側側、横方向、および/または前後部体軸に沿って比較的大きく、連続したイメージングがより包括的な表現を提供するからである。これにより、例えば、複雑な3次元移行経路12、13に沿って移動する細胞の長期追跡が可能になります。
軽シート系蛍光顕微鏡は、ショウジョウバエメラノガスターの胚形態形成を研究するために広範囲に適用されており、いずれも体系的に14、15、ならびに開発の生物物理学的側面に特に焦点を当てています。例えば、胚芽伸長16中の内胚葉内挿と軸延長との間の生体力学的リンクを検出するために高解像度のモルモジェネティックデータを収集し、さらに、胃の間の力発生パターンと複雑な細胞流を関連付けるために使用した。また、他の最先端技術、例えば、表皮18における前後部パターニング中のWntシグナル伝達の調節を調査する光遺伝学も組み合わされている。
しかし、1つの種だけを研究することは、発達の進化に関する洞察を提供するものではありません。系統的な文脈における胚発生を理解するために、代替昆虫モデル生物を用いて集中的な研究が行われている。最も包括的に調査された種の1つは、経済的に関連する貯蔵穀物害虫19である赤い小麦粉カブトムシトボリウムカスタネウムであり、その胚形態形成もすでにLSFM20で体系的に画像化されている。これら2種の胚形態形成は、いくつかの局面において著しく異なり、例えば、セグメンテーションモード21、ならびに胚外膜22の形成および分解が挙げられる。後者の側面は、LSFMを使用してすでに広範囲に分析されています。例えば、胚発生の良い部分に対する様々な危険からトリボリウム胚を包み込み、保護する胚外組織であるセロサは、背側閉鎖25の間に独自の撤退プロセスのための形態遺伝学的「ドライバー」としても作用することが示されている。また、気中中、ブラストドアルムの特定の領域が、非対称組織運動26を作成するためにビテリン膜に固定されたままであり、この観察に続いて、細胞がセロサ窓閉閉中に細胞を順次残すことを可能にすることが実証されている。
上記に引用したすべてのショウジョウバエとトリボリウム関連研究では、サンプルチャンバーベースのLSFMが使用されている。ほとんどの場合、胚はサンプル回転関数を使用して複数の方向に沿って記録された。明示的には述べられていないが、Tribolium20,28に関する我々の以前の研究と同様に、逐次ライブイメージングアッセイにおいて個別に独立して記録されていると仮定することができる。特定のシナリオでは、このようなアプローチは許容されますが、特に定量的比較アプローチでは、周囲分散が結果を歪める可能性があります。例えば、昆虫の発生速度は温度依存性29であると長い間知られているが、さらに最近の研究では、ショウジョウバエでは、温度がモルフォゲン30の濃度にも影響を与える可能性があることを示唆している。その結果、胚発生の特定の特性、例えば、細胞の動的な割合、分割速度および移動速度を、正確に定量化する必要がある場合、周囲分散を伴わない十分な反復が必要となる。これにより標準偏差と標準偏差誤差が最小限に抑え、わずかに発散した実験条件であっても他の条件との並置が容易になります。
しかし、サンプルチャンバーベースのLSFMは、主に高スループットアッセイではなく、高い含有量のために設計されています。顕微鏡スライド、ペトリ皿、ウェルプレート用の標準化クランプ機構が一般的に装備されている共焦点顕微鏡とは異なり、ほぼすべてのサンプルチャンバーベースのLSFMはシリンダーベースのクランプ機構を使用します。これらのメカニズムは、回転互換性があるカスタムメイドのサンプルホルダーと非侵襲的な10を対象としていますが、通常は20、31、32以上の標本用に設計されていません。サンプルチャンバーベースのセットアップの利点が損なわれない2つ以上の胚の同時ライブイメージングのフレームワークは、周囲分散の問題に対処し、それによって比較研究のためのLSFMsの価値を高める。
我々のプロトコルでは、y軸が胚を「積み重ねる」オプションとして使用されるサンプルチャンバーベースのLSFM(図1A)における比較ライブイメージングの実験的枠組みを提示する。まず、サンプルチャンバーベースのLSFMsに蛍光マイクロスフィアベースのキャリブレーションガイドラインを提供します。第二に、試料の回転に対応し、複数の方向に沿って複数の標本を同時に撮像できるクモの巣ホルダー28(図1B)に基づく複数の胚の取り付け方法を説明する(図1C)。いくつかの胚は、薄いアガロースフィルムの上に整列し、サンプルチャンバーに挿入した後、三次元画像を取得するためにライトシートを連続的に移動した。第三に、ショウジョウバエとトリボリウムのための3つの模範的なライブイメージングデータセットを提供します。前者については、トランスジェニックラインを蛍光標識核と並置する。後者の場合、同じ遺伝子導入を運ぶトランスジェニックサブラインのパフォーマンスを比較しますが、ゲノムの異なる場所で行います。最後に、比較ライブイメージングと周囲分散33に関する並列化の重要性について議論し、実験フレームワークのスループット限界を議論し、他のモデル生物へのアプローチの適応を評価する。

<table><tbody><tr><td>6ウェルプレート</td><td>Orange Scientific</td><td>4430500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>24ウェルプレート</td><td>Orange Scientific</td><td>4430300</td><td>Tribolium</em</td></tr><tr><td>>35-mmとOslashを含むライブイメージングのみ。ペトリ皿</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>153066</td><td>Drosophilaを含むライブイメージング専用。</td></tr><tr><td>90 mm&オスラッシュ;ペトリ皿</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>L9004575</td><td></td></tr><tr><td>100 & マイクロ;mメッシュサイズセルストレーナーBD</td><td>Biosciences</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>250 &micro;mメッシュサイズふるい</td><td>VWRインターナショナル</td><td>200.025.222-038</td><td>Tribolium</td></tr><tr><td>300&microを含むライブイメージングのみ;mメッシュサイズふるい</td><td>VWRインターナショナル</td><td>200.025.222-040</td><td>Tribolium</td></tr><tr><td>710&microを含むライブイメージングのみ;mメッシュサイズふるい</td><td>VWRインターナショナル</td><td>200.025.222-050</td><td>Tribolium</td></tr><tr><td>800&microを含むライブイメージングのみ。mメッシュサイズふるい</td><td>VWRインターナショナル</td><td>200.025.222-051</td><td>Tribolium</em</td></tr><tr><td>>405細かい小麦粉</td><td>Demeter e.V.</td>を含むライブイメージングのみ<td>SP061006</td><td>Tribolium</em</td></tr><tr><td>>市販のショウジョウバエ培地</td>を含むライブイメージングのみ <td>Genesee Scientific</td><td>66-115</td><td>Drosophila / カスタムメイドのDrosophilaを含むライブイメージングのみ、</td></tr><tr><td>蛍光マイクロスフェア、1.0 & マイクロ;メートル&オスラッシュ;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>T7282</td><td></td></tr><tr><td>不活性ドライイースト</td><td>ジェネシーサイエンティフィック</td><td>62-108</td><td></td></tr><tr><td>低融点アガロー</td>ス <td>カールロス</td><td>6351.2</td><td></td></tr><tr><td>ナローバイアル</td><td>ジェネシーサイエンティフィック</td><td>32-109</td><td>ショウジョウバエ</td></tr><tr><td>小さなペイントブラシ</td><td>VWR International</td><td>149-2121</td><td></td></tr> <tr><td>を含むライブイメージングのみ次亜塩素酸ナトリウム(NaOCl)、~12%活性Cl</td>カール<td>ロス</td><td>9062.3</td><td>注意:次亜塩素酸ナトリウムは腐食性</td></tr><tr><td>全粒小麦粉</td><td>ですデメテルe.V.</td><td>SP061036</td><td>Tribolium / 英国: 全粒粉</td></tr><tr><td>ワイドバイアル</td><td>ジェネシー サイエンティフィ</td>ック <td>32-110</td><td>ショウジョウバエ</emを含むライブイメージングのみ></td></tr></tbody></table>

サンプルチャンバーベースの光シート蛍光顕微鏡における複数の昆虫胚の同時ライブイメージング

Simultaneous Live Imaging of Multiple Insect Embryos in Sample Chamber-Based Light Sheet Fluorescence Microscopes

ライトシートベースの蛍光顕微鏡は、複数の生物学的に関連するスケールで複雑なプロセスを研究するための効率的なソリューションを提供します。試料の三次元の完全性を維持するためにとりわけ設計され、通常サンプルの回転を特色にするサンプル室ベースのセットアップは、発生生物学の最良の選択である。例えば、それらは、ショ ウジョウバエメラノガスター および赤い小麦粉カブトムシ トリボリウムカスタネウムの果実フライの胚形態形成全体を文書化するために使用されてきた。しかし、利用可能なライブイメージングプロトコルの多くは、単一胚の実験的枠組みのみを提供します。特に比較研究では、このようなアプローチは、順次画像化された標本が周囲分散の影響を受けるため、不便である。さらに、これにより、所定の時間内にアッセイできる検体の数が制限されます。我々は、同時ライブイメージングのための実験的なフレームワークを提供し、サンプル室ベースのセットアップのスループットを向上させ、すべての標本に対して同様の周囲条件を保証します。まず、光シート蛍光顕微鏡の校正ガイドラインを提供します。第2に、試料回転に適合する複数の胚の実装方法を提案する。第三に、ショ ウジョウバエの典型的な3次元ライブイメージングデータセットを提供し、蛍光標識核と3つのトランスジェニックラインと Triboliumを並置し、同じ遺伝子を運ぶ3つのトランスジェニックサブラインの性能を比較しますが、ゲノムの異なる場所で比較します。私たちのプロトコルは、連続ライブイメージングで常に存在する周囲分散に積極的に対処するため、比較研究のために特別に設計されています。これは、ノックアウト実験などから生じる非収量性の型の定量的分析と特徴付けに特に重要です。また、全体的なスループットが向上し、蛍光顕微鏡の光シートへのアクセスが制限される場合に非常に便利である。最後に、提案された取り付け方法は、他の昆虫種およびさらなるモデル生物、例えばゼブラフィッシュに対して、基本的に最適化努力を伴わない適応することができる。

我々のプロトコルは、サンプルチャンバーベースのLSCMにおける比較蛍光ライブイメージングのための実験的枠組みについて説明する。例えば、フレームワークは、2種以上の(i)胚、(ii)1つ以上の遺伝子がノックアウトされるラインの胚と野生型コントロール、(iii)同じトランスジェニックラインの複数の胚、(iv)異なるトランスジェニックラインからの複数の胚、または(v)同じトランスジーンを運ぶサブラインからの胚を並置するために使用することができるが、異なるゲノムの場所で。このセクションでは、最後の 2 つのシナリオの例を示します。
我々の最初の例示的な適用では、我々は、異なるトランスジェニックショウジョウバエラインに由来する3つの胚の蛍光シグナルダイナミクスを示す(表2)約1日間にわたって(図4、補足ムービー1)。これらのラインについては、おそらくユビキタスで構成的に活性なプロモーターの制御下で核に局在するEGFP/GFPを発現するため、かなり似...

光シートベースの蛍光顕微鏡は、発生生物学において最も価値のあるツールです。比較研究の大きな問題は、周囲分散です。我々のプロトコルは、複数の標本の同時ライブイメージングのための実験的なフレームワークを記述し、したがって、この問題に積極的に取り組む。

Light sheet-based fluorescence microscopy offers efficient solutions to study complex processes on multiple biologically relevant scales. Sample ...

サンプルチャンバーベースのライトシート蛍光顕微鏡は、高スループットではなく、ハイコンテント用に設計されています。したがって、ライブイメージングアッセイは、周囲の変動による影響を少なくするために、順次実行する必要があります。当社のクモの巣ホルダーは、複数の胚のスタッキングと同時イメージングを可能にし、周囲のばらつきを排除し、スループットを向上させます。蜘蛛の巣ホルダーに胚をマウントするには、ある程度の技巧が必要です。説明ビデオは、多くの短い行動ジェスチャーのシーケンスを説明するのに理想的です。サンプルチャンバーベースのライトシート蛍光顕微鏡のキャリブレーション用。まず、アガロースアリコートをドライブロックヒーターミキサーで摂氏80度で液化します。溶かしたアガロースを摂氏35度に冷まし、50マイクロリットルのアガロースを1.5ミリリットルの反応チューブに移します。0.5マイクロリットルの蛍光マイクロスフェア溶液をアガロースと1分間1,400回転で混合し、クモウェブホルダーのスロット穴を10マイクロリットルのアガロース蛍光マイクロスフェア溶液混合物で満たします。薄いアガロース膜だけが残るまでできるだけ多くのアガロースを吸引し、アガロースが30〜60秒間固化するのを待ちます。サンプルチャンバーにオートクレーブ処理した水道水を入れ、クモの巣ホルダーをゆっくりとサンプルチャンバーに挿入します。検出レンズの前にある長穴を動かし、ホルダーを照明軸と検出軸に対して45度の位置に回転させます。クモの巣ホルダーは、透過光チャネルで見えないようにする必要があります。適切な蛍光チャンネルに切り替え、レーザー出力と露光時間を調整して、蛍光マイクロスフェアが適切な信号を提供するようにします。横方向になったアガロースフィルムを完全に覆うビューボリュームを指定し、それぞれの照明レンズと検出レンズの組み合わせで可能な最大軸解像度を計算して、Z間隔を定義します。次に、蛍光マイクロスフェアの3次元テストZスタックを記録し、X、Y、およびZの最大投影をキャリブレーションチャートと比較します。マイクロスフィアがぼやけている、ぼやけている、または歪んでいるように見える場合。照明レンズや検出レンズの位置を調整します。胚のデコレーションには、1ラインあたり1-6ウェルプレートのA1、A2、A3、B3ウェルに8ミリリットルのオートクレーブ処理した水道水を追加します。次に、7ミリリットルのオートクレーブ処理された水道水と1ミリリットルの次亜塩素酸ナトリウム溶液をB1ウェルとB2ウェルに加えます。最初のプレートを実体顕微鏡の下に置き、最初の胚を含む細胞ストレーナーをA1ウェルに挿入します。胚を30〜60秒間穏やかに攪拌して洗浄してから、ストレーナーをB1ウェルに移動します。プレートを30秒間激しく振ってから、ストレーナをA2ウェルに移します。穏やかに攪拌しながら胚を1分間洗浄し、ストレーナーをB2ウェルに移して、ほとんどの胚が完全に脱角化されるまで激しく振とうします。次に、ストレーナーをA3ウェルに移して1分間穏やかに洗浄してから、デコレーション胚のストレーナーをB3ウェルに保存して、他の系統の胚が実証されたように処理されるまで保存します。胚をクモの巣ホルダーに取り付けるには、示されているように別のアガロースのアリコートを液化します。アガロースが冷えたら、クモの巣ホルダーを実体顕微鏡の下に置き、10マイクロリットルのアガロースをスロット穴に追加します。ピペットの先端を使用してアガロースを長穴に広げてから、薄いアガロースフィルムだけが残るまでできるだけ多くのアガロースを吸引します。アガロースが固まったら、絵筆を使用して胚を慎重に選び、アガロースフィルムに移します。長穴の長軸に沿って配置し、前後軸を長穴の長軸に合わせます。胚を安定させるために、胚とアガロースフィルムの間の隙間に1〜2マイクロリットルのアガロースを慎重にピペットで入れます。アガロースが固まったら、マウントされた胚を入れたクモの巣ホルダーを、画像バッファーで満たされたサンプルチャンバーにゆっくりと挿入します。胚を画像化するには、クモの巣ホルダーが照明軸と検出軸に対して45度の位置にあることを確認し、透過光チャネル内で胚を視野の中心に移動します。クモの巣ホルダーが見えないようにする必要があります。次に、胚の中面が焦点面と重なり、輪郭が鮮明に見えるまで、Zのマイクロ翻訳ステージで胚を動かします。蛍光チャネルに切り替えずに、胚を両方向に250ミクロン動かして、視野の容積を指定します。多方向に沿ったイメージングが必要な場合は、胚を適切に回転させ、胚に焦点を合わせ、示したように視野の容積を指定します。次に、他のすべてのマウントされた胚に対してこの手順を繰り返します。すべての胚の視野量を指定したら、蛍光チャネルとタイムラプスパラメータを定義し、イメージングプロセスを開始します。数日間続くアッセイの場合は、蒸発を減らすために、サンプルチャンバーの開口部を少なくとも部分的に覆うことを検討してください。イメージングアッセイが終了したら、クモの巣ホルダーをサンプルチャンバーから慎重に取り外し、小さなペイントブラシを使用して胚をアガロースフィルムから切り離し、適切に標識された顕微鏡スライド上に胚を置きます。スライドをリトリーバルディッシュに入れ、適切な標準飼育条件下でインキュベートします。孵化の時点が近づいたら、回収皿を頻繁にチェックし、孵化した幼虫を24ウェルプレートの個々のウェルに移します。ウェルの半分を適切な成長培地で満たし、次に適切な標準的な飼育条件下で幼虫をインキュベートします。観察された個体が成人期に達したら、適切な交配パートナーを提供し、数日後に子孫を確認します。このビデオでは、異なるトランスジェニックショウジョウバエ株に由来する3つの胚の蛍光シグナルダイナミクスを約1日にわたって観察することができます。すべての系統が、おそらく遍在し、構成活性のあるプロモーターの制御下で核局在化EGFPを発現していたため、同様の蛍光パターンが予想されました。しかし、ライブイメージングの結果を比較すると、表現パターンには強い空間時間的な違いがあり、これは周囲の分散による二次的な影響ではないことが明らかになりました。この解析では、同じピギーバックベースの導入遺伝子を持つ3つのTribolium胚の解析。原腸陥入時の漿膜窓閉鎖過程のライブイメージング結果の比較結果から、2 番目のサブラインは他の 2 つのサブラインよりも全体的に非常に強い信号を提供することが示唆されています。これらのデータが示すように、ゲノムの状況もTriboliumの導入遺伝子の発現レベルに強い影響を与える可能性があります。私たちのアプローチは、野生型コントロール胚を同時にイメージングできるため、ノックダウンおよびノックアウト表現型の解析に非常に適しています。私たちのプロトコルは、2つ以上の昆虫種の形態形成を比較するためにも使用できます。したがって、開発の進化についてより深い洞察を得ることができます。

simultaneous-live-imaging-multiple-insect-embryos-sample-chamber

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

イメージング C.エレガンス</em落射蛍光顕微鏡とオープンソースソフトウェアを使用して>胚

この記事では、ライトシート蛍光顕微鏡のサンプル調製について説明します。また、ゼブラフィッシュの生きた胚を長時間イメージングする方法も示しており、これにより、生理学的に近い状態で生きた胚の長時間のタイムラプス動画を記録することができます。...

ライトシート顕微鏡サンプル調製:長期イメージングのための生きたゼブラフィッシュ胚のマウント

ゼブラフィッシュの胚の発達は、低濃度のアガロースで光学的に透明なポリマーチューブに埋め込まれている光シート顕微鏡で日間にわたって追跡することができる。...

多層はゼブラフィッシュの長期シート光顕微鏡用に取り付け

このプロトコルは、シート光顕微鏡のセットアップとCのin vivoイメージングのために、その実装について説明します虫の胚。...

のための簡単​​なシート光顕微鏡を設定する<em&gt;トトで</em&gt;イメージングの<em&gt; C.虫</em&gt;開発

&gt;jove_content&lt;細胞小器官や他の細胞内構造の動的挙動をin...

リビングゼブラフィッシュ胚における細胞内構造のイメージング

光シートベースの蛍光顕微鏡による昆虫の胚の形態形成を撮像する技術の状態となっています。このプロトコルは、輪郭とモドキTribolium castaneumの胚に適した3つの取り付け技術を比較し、ライブイメージングに適して2つの新規のカスタムメイドのトランスジェニック系統を導入し、本質的な品質管理を説明し、現在の実験の限界を示しています。...

光シートベースの蛍光生活の顕微鏡または固定し、染色<em&gt;モドキTribolium castaneum</em&gt;胚

長い波長多光子蛍光励起顕微鏡レーザーの高度な光学技術の組み合わせは、Tg (sox10:EGFP) および Tg (foxd3:GFP)...

リアルタイムで開発を可視化する多光子タイムラプス イメージング: ゼブラフィッシュ胚の神経堤細胞の可視化

この記事では、長時間経過共焦点顕微鏡用に脆弱なゼブラフィッシュ胚を取り付ける方法について説明する。この低コストの方法は、任意の反転顕微鏡でイメージングするための通常のガラス底顕微鏡用皿を使用して簡単に行うことができます。取り付けは、異なる濃度でアガロースの層で行われる。...

ゼブラフィッシュ胚全体の延長タイムラプス共焦点顕微鏡法の層状取り付け法

ここで提示されるプロトコルは、プレートベースの高含有画像を使用して胚発生時に複数 のショウジョウバエ...

ショウジョウバエ胚の調製と、自動高コンテンツアナライザを用いた生細胞顕微鏡のための微小注入

ここでは、市販のライトシート顕微鏡および画像処理ワークステーションを用いて眼形態形成のタイムラプスイメージングを行い、得られたデータを解析するためのプロトコルが提供される。このプロトコルは、胚麻酔、低融解温度アガロースへの埋め込み、イメージングチャンバ内の懸濁、イメージングパラメータの設定、および最後に画像解析ソフトウェアを使用したイメージングデータの分析の手順を詳述しています。...

rx3:GFPトランスジェニックゼブラフィッシュを用いたライトシート顕微鏡による眼の形態形成の可視化

ライトシート顕微鏡を使用して、無傷の絨毛膜内の初期のゼブラフィッシュ胚をイメージングするためのサンプル調製戦略について説明します。これは、70%エピボリーおよび芽の段階で胚が絨毛膜内で獲得するさまざまな向きを分析し、ライトシートシステムを使用して胚全体で細胞スケールの分解能を得るためのイメージング戦略を詳しく説明します。...

初期ゼブラフィッシュ胚のライトシート顕微鏡イメージングとマウント戦略

学ぶ光シート蛍光顕微鏡を用いた複数の昆虫胚の同時ライブイメージング法。クモの巣ホルダーを使用してDrosophila胚を同時に観察し、環境変動を排除して発生生物学研究の精度とスループットを向上させる。

サンプルチャンバーベースの光シート蛍光顕微鏡における複数の昆虫胚の同時ライブイメージング

さらに動画を探す