糞便(マイクロ)RNA単離

マイクロRNAを研究するために、糞便サンプルからRNAを単離するためのプロトコルを提示します。このプロトコルは、糞便からRNAを高品質かつ大量に単離するために使用できます。生きた微生物からのRNAを最小限に抑えます。

このプロトコルでは、結合バッファーが使用されていないことを強調することが重要です。このプロトコルはシンプルでわかりやすいです。まず、25〜100ミリグラムの糞便サンプルを、2ミリリットルの微量遠心チューブに600マイクロリットルの滅菌1X DPBSに再懸濁します。

サンプルの入ったチューブを室温で30分間インキュベートします。次に、1ミリリットルのピペットチップで混合物をマッシュし、よくボルテックスします。混合物をホモジナイザーに再懸濁し、1サイクルを1分間4, 000回転で45秒間に設定して、RNAの量と品質を最適化し、向上させます。

600マイクロリットルの酸性フェノールクロロホルム溶液をサンプルに加え、混合物を60秒間ボルテックスします。あるいは、収量中のRNAの量を増やすために、ホモジナイザーと混合します。室温で10, 000 x gでサンプルを15分間遠心分離し、水相と有機相を分離します。

界面がコンパクトになるまで遠心分離を繰り返します。上部水相を、下部相を乱さずに慎重に、ヒンジキャップ付きの新しい2ミリリットル微量遠心チューブに移します。ACSグレードの100%エタノールを、取得した水相の体積の1.25倍で加え、ボルテックスを3秒間加えます。

フィルターカートリッジを収集チューブに入れます。各サンプル600マイクロリットルを、microRNA分離キットに付属のフィルターカートリッジにロードします。10, 000 x gで90秒間遠心分離し、カートリッジで混合物をろ過します。

次に、ろ液を廃棄します。これを繰り返して、混合物の全容量が同じフィルターメンブレンでろ過されるまで繰り返します。すべてのサンプルがフィルタリングされます。

700マイクロリットルのmicroRNA洗浄液1を同じフィルターカートリッジに加えます。60秒間遠心分離して、フィルターカートリッジで洗浄液をろ過します。ろ液を捨て、フィルターカートリッジを同じ収集チューブに置きます。

ACSグレードの100%エタノールで調製した700マイクロリットルの洗浄液2/3でフィルターカートリッジを洗浄し、10,000 x gで1分間遠心分離します。得られた濾液を廃棄し、フィルターカートリッジを同じチューブに入れます。フィルターカートリッジを500マイクロリットルの洗浄液2/3で洗浄し、10, 000 x gで1分間遠心分離します。

得られた濾液を捨て、フィルターカートリッジを同じ収集チューブに入れます。ACSグレードの100%エタノールで調製した250マイクロリットルの洗浄液2/3でフィルターカートリッジを洗浄し、10,000×gで1分間遠心分離します。得られた濾液を捨て、フィルターカートリッジを同じ収集チューブに入れます。

最後に、フィルターカートリッジを新しい収集チューブに移し、アセンブリを5分間回転させて残留液体を取り除きます。フィルターカートリッジを新しい収集チューブに移し、フィルターの中央に50マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を追加し、チューブにキャップをします。チューブを室温で10分間インキュベートします。

次に、チューブを8, 000 x gで5分間回転させて、RNAを新しいコレクションチューブに回収します。チップベースのRNA電気泳動アッセイでは、マウスおよびヒトの糞便由来の代表的なRNA分離株は、18Sおよび28SのrRNA組成が少ないか、または不足しており、RNA分離株のサイズはsmall RNA領域に落ちることが示唆されています。チップベースの電気泳動によるさらにsmall RNA電気泳動により、RNAの大部分がマイクロRNAサイズであることが明らかになりました。

抽出したRNAの純度は、260ナノメートルと280ナノメートルの波長で2.0、260ナノメートルと230ナノメートルの波長で1.8の吸光度比の値で示されるように高かった。有機抽出の成功を確実にするためには、面が明確であることを確認し、下相を乱すことなく上部水相のみを移すようにしてください。