糞便(マイクロ)RNA単離
October 28th, 2020
このプロトコルは、動物およびヒト被験者の糞便サンプルから高品質のトータルRNAを分離します。市販のmiRNA分離キットは、最適化された量と質で純粋なRNAを単離するために、大幅に適応して使用されます。RNA分離株は、シーケンシング、マイクロアレイ、RT-PCRなどのほとんどのダウンストリームRNAアッセイに適しています。
マイクロRNAを研究するために、糞便サンプルからRNAを単離するためのプロトコルを提示します。このプロトコルは、糞便からRNAを高品質かつ大量に単離するために使用できます。生きた微生物からのRNAを最小限に抑えます。
このプロトコルでは、結合バッファーが使用されていないことを強調することが重要です。このプロトコルはシンプルでわかりやすいです。まず、25〜100ミリグラムの糞便サンプルを、2ミリリットルの微量遠心チューブに600マイクロリットルの滅菌1X DPBSに再懸濁します。
サンプルの入ったチューブを室温で30分間インキュベートします。次に、1ミリリットルのピペットチップで混合物をマッシュし、よくボルテックスします。混合物をホモジナイザーに再懸濁し、1サイクルを1分間4, 000回転で45秒間に設定して、RNAの量と品質を最適化し、向上させます。
600マイクロリットルの酸性フェノールクロロホルム溶液をサンプルに加え、混合物を60秒間ボルテックスします。あるいは、収量中のRNAの量を増やすために、ホモジナイザーと混合します。室温で10, 000 x gでサンプルを15分間遠心分離し、水相と有機相を分離します。
界面がコンパクトになるまで遠心分離を繰り返します。上部水相を、下部相を乱さずに慎重に、ヒンジキャップ付きの新しい2ミリリットル微量遠心チューブに移します。ACSグレードの100%エタノールを、取得した水相の体積の1.25倍で加え、ボルテックスを3秒間加えます。
フィルターカートリッジを収集チューブに入れます。各サンプル600マイクロリットルを、microRNA分離キットに付属のフィルターカートリッジにロードします。10, 000 x gで90秒間遠心分離し、カートリッジで混合物をろ過します。
次に、ろ液を廃棄します。これを繰り返して、混合物の全容量が同じフィルターメンブレンでろ過されるまで繰り返します。すべてのサンプルがフィルタリングされます。
700マイクロリットルのmicroRNA洗浄液1を同じフィルターカートリッジに加えます。60秒間遠心分離して、フィルターカートリッジで洗浄液をろ過します。ろ液を捨て、フィルターカートリッジを同じ収集チューブに置きます。
ACSグレードの100%エタノールで調製した700マイクロリットルの洗浄液2/3でフィルターカートリッジを洗浄し、10,000 x gで1分間遠心分離します。得られた濾液を廃棄し、フィルターカートリッジを同じチューブに入れます。フィルターカートリッジを500マイクロリットルの洗浄液2/3で洗浄し、10, 000 x gで1分間遠心分離します。
得られた濾液を捨て、フィルターカートリッジを同じ収集チューブに入れます。ACSグレードの100%エタノールで調製した250マイクロリットルの洗浄液2/3でフィルターカートリッジを洗浄し、10,000×gで1分間遠心分離します。得られた濾液を捨て、フィルターカートリッジを同じ収集チューブに入れます。
最後に、フィルターカートリッジを新しい収集チューブに移し、アセンブリを5分間回転させて残留液体を取り除きます。フィルターカートリッジを新しい収集チューブに移し、フィルターの中央に50マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を追加し、チューブにキャップをします。チューブを室温で10分間インキュベートします。
次に、チューブを8, 000 x gで5分間回転させて、RNAを新しいコレクションチューブに回収します。チップベースのRNA電気泳動アッセイでは、マウスおよびヒトの糞便由来の代表的なRNA分離株は、18Sおよび28SのrRNA組成が少ないか、または不足しており、RNA分離株のサイズはsmall RNA領域に落ちることが示唆されています。チップベースの電気泳動によるさらにsmall RNA電気泳動により、RNAの大部分がマイクロRNAサイズであることが明らかになりました。
抽出したRNAの純度は、260ナノメートルと280ナノメートルの波長で2.0、260ナノメートルと230ナノメートルの波長で1.8の吸光度比の値で示されるように高かった。有機抽出の成功を確実にするためには、面が明確であることを確認し、下相を乱すことなく上部水相のみを移すようにしてください。
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概要
このプロトコルは、糞便サンプルから高品質のRNAを分離するための簡単な方法を提示し、生きている微生物からの汚染を最小限に抑えます。動物と人間の両方の被験者のために設計されており、下流のアプリケーションに最適化された収率と純度を確保します。
主要な研究コンポーネント
科学の分野
- 神経科学
- 微生物学
- 分子生物学
背景
- 糞便サンプルからのRNAの分離は、マイクロRNAを研究するために重要です。
- 従来の方法では微生物RNAからの汚染につながる可能性があります。
- 高品質のRNAは、正確な下流の分析に不可欠です。
- このプロトコルは、改良された結果を得るために商業的なmiRNA分離キットを適応させています。
研究の目的
- 糞便からのRNA抽出のための信頼できる方法を提供する。
- RNA分離物の品質と量を向上させる。
- 様々な生物学的文脈におけるマイクロRNAの研究を容易にする。
使用された方法
- 無菌1X DPBSでの糞便サンプルの再懸濁。
- 処理のための2ミリリットルのマイクロ遠心分離管の使用。
- 商業的なmiRNA分離キットの適応。
- 生きている微生物からのRNA汚染の最小化。
主要な結果
- 糞便サンプルからの高品質の総RNAの成功的な分離。
- 最適化されたプロトコルはシーケンシングとRT-PCRに適したRNAを生成します。
- 微生物RNA汚染を減らす効果を実証しました。
- プロトコルは研究者にとってシンプルで簡単です。
結論
- このプロトコルは糞便サンプルからのRNA抽出のための信頼できる方法を提供します。
- 高品質のRNAは下流のアプリケーションにとって重要です。
- 商業キットへの適応はRNAの収率と純度を向上させることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Isolating high-purity RNA from fecal samples enables mechanistic de-risking in target validation by providing access to host-derived microRNAs without microbial contamination. This supports predictive confidence in biomarker discovery and pathway analysis for gastrointestinal and systemic diseases. The protocol’s scalability and reproducibility facilitate enterprise reuse across discovery and preclinical workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of host microRNA signatures in feces for therapeutic hypothesis testing and pathway clarification.
- Operational Value: Reduces mechanistic ambiguity by minimizing confounding signals from living microbes in sample preparation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces RNA isolates suitable for sequencing, RT-PCR, and microarray applications, enabling reliable compound screening readouts.
- Operational Value: Standardized washing steps and phase separation ensure reproducibility and scalability for high-throughput assay development.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports translational biomarker alignment by yielding disease-relevant small RNA profiles from animal and human fecal models.
- Operational Value: Facilitates continuity from discovery through preclinical validation with consistent RNA quality and quantity.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from Early Discovery to Lead Identification and Preclinical validation by providing a standardized input for omics and functional assays.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and biological de-risking by isolating host-derived RNA from complex fecal matrices.
- Screening: Enables assay readiness through high-yield, pure RNA outputs compatible with downstream analytical platforms.
- Analytics: Delivers quantitative RNA measurements with high purity (A260/A280 ~2.0, A260/A230 ~1.8) for accurate condition comparison.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via species-agnostic application in mouse and human models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for fecal RNA isolation across multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through reduced microbial contamination and enhanced target validation in host-microbiome studies.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability via optimized resuspension, washing, and filtration steps.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in biomarker-driven programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on reliable RNA-derived data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid handling and phase separation techniques to avoid interphase disruption.
- Dependent on centrifugation equipment capable of 10,000 x g and homogenization at 4,000 rpm for sample processing.
- Necessitates cross-team standardization of sample mass limits (25–200 mg) to ensure consistent aqueous phase recovery.
- Adaptation considerations include adjusting wash volumes and incubation times for varying sample types and inhibitor loads.
- Practical limitation: samples exceeding 200 mg may compromise phase separation and RNA purity due to interface instability.
